文摘

人类的载脂蛋白E基因(APOE)ε32与缺血性心脏病的风险降低有关。ApoE缺乏小鼠损害梗塞心肌梗塞(MI)后愈合。缺血性损伤后,大量的中性粒细胞首先招募到梗塞区,然后降低死亡和促进修复相变材料。ApoE的角色在炎症反应的早期阶段MI基本上仍不清楚。在这项研究中,我们调查的影响ApoE缺乏对中性粒细胞的功能和心肌梗死后心肌损伤。通过左冠状动脉结扎ApoE^{- / -}和野生型小鼠(WT),我们观察到梗塞大小增加,中性粒细胞浸润ApoE^{- / -}老鼠。在梗塞区内,中性粒细胞胞外陷阱(网)的观察ApoE^{- / -}老鼠,而增加净形成中检测出体外ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞通过NADPH oxidase-ROS-dependent通路。抑制过度生产网减少心肌损伤ApoE^{- / -}结扎后的老鼠。一般来说,我们的研究结果揭示了至关重要的作用在调节Ly6G载脂蛋白E⁺中性粒细胞激活和净形成,导致限制心肌梗死后心肌损伤。在这样一个过程中,载脂蛋白E通过ROS-MAPK-MSK1通路调节网络的形成。

1。介绍

如今,由于心血管疾病死亡率仍被评为排名第一在所有非传染性疾病在全球范围内,迅速和缺血性心脏病的患病率不断上升在过去的二十年里在中国(1,2]。动脉粥样硬化的形成,缺血性心脏病最常见的原因,是由于低密度脂蛋白堆积在皮下空间(3]。因此,载脂蛋白E缺陷(ApoE^{- / -}老鼠)广泛应用于以模仿和更好地理解这hypercholesterolemia-associated过程。

人类APOE有三个主要的等位变异(ε2,ε3,ε4),大多数人至少携带一个ε3所示。的基因,ε32个基因型与缺血性心脏病的风险降低(4]。除了抗氧化活性神经细胞中发现(B12)、载脂蛋白e也报道调节造血干细胞增殖通过促进胆固醇流出5,6]。当前的研究观点ApoE^{- / -}体内更多的工具达到高胆固醇血症条件为了更好地了解动脉粥样硬化或心肌缺血过程。ApoE本身的作用还没有充分调查。

在人类和实验心肌梗死(MI),招募大量的中性粒细胞炎症信号到梗塞区在24 h,然后,在梗死区中性粒细胞减少的数量迅速3天内。在这段时间里,中性粒细胞以及其他白细胞降解细胞外基质成分,帮助清除残骸和大分子的受伤的细胞(7]。精心组织的炎症和抗炎进步可以限制缺血性损伤的心脏。然而,这样的平衡可能强烈破坏,导致[不良的左室重构8]。中性粒细胞胞外陷阱的形成(网),中性粒细胞功能的方式,作为后卫的感染但贡献者autoimmune-associated疾病的发病机理9]。几种研究显示针对网络形成的保护作用或细胞外DNA结构在再灌注模型(10- - - - - -12]。但是很少有研究报告网的作用在一个永久的心肌梗死模型和载脂蛋白E的角色在这样的一个过程。

在这项研究中,我们旨在研究载脂蛋白E在急性心肌梗死(AMI)损伤的发病机制,特别是其潜在目标,嗜中性粒细胞,参与缺血性损伤。ApoE^{- / -}老鼠用于建立的AMI模型探索的影响ApoE缺乏对AMI损伤和炎症反应,尤其是中性粒细胞和嗜中性粒细胞胞外陷阱在梗塞区内。动物和体外实验结果表明载脂蛋白E通过ROS-dependent通路调节网络的形成。值得注意的是,我们的研究结果表明,中性粒细胞的数量和净形成调节心肌损伤的心肌梗死的早期阶段,为减少梗死损伤提供承诺的目标。

2。材料和方法

2.1。动物和心肌梗死模型

男性8-week-old野生型(WT)和6 -ApoE^{- / -}老鼠从地下实验室动物。所有动物协议被机构审查批准和复旦大学中山医院的伦理委员会。

老鼠与异氟烷麻醉,有限的,气管插管,连接到一个机械通风。左边的第三或第四肋间公开开放的心,和左冠状动脉的结扎建立心肌梗死(MI)。要么apocynin(0.5毫克/公斤,Selleck化学品)或Cl-amidine(25毫克/公斤,Selleck化学品)腹腔注射前30分钟结扎为了抑制网络的形成。为对照组,使用同样体积的PBS。

2.2。梗塞大小的测量

小鼠安乐死与戊巴比妥钠过量,他们的心被删除。每个心都横着切成5部分,彩色0.5% 2、3,5-triphenyl四唑氯(TTC) 37°C,持续15分钟。noninfarct区变红,梗塞区变白。梗塞大小(%)被计算为梗塞区片总面积的百分比。

梗塞大小进一步证实了血清水平的水平层次(南京建成生物工程研究所)或cTnI水平(Anogen)。

2.3。超声心动图分析

胸骨旁的烈度衰减超声心动图进行结扎Vevo®2100后7天。简单地说,老鼠和异氟烷麻醉界上维持体温加热垫。胸骨旁的烈度衰减M-mode超声心动图记录Vevo®2100。心率(HR)、左心室射血分数(LVEF)和分数缩短Vevo实验室(FS)计算的软件。

2.4。组织病理学分析

组织病理学的嗜中性粒细胞浸润和净形成了老鼠牺牲结扎后1天。心被切除,嵌入在石蜡(徕卡生物系统)或10月(樱花Finetek)。连续5μ米厚的石蜡切片用于小天狼星红染色。连续5μ米厚的冰冻切片用于immunofluorescent costaining净形成(antihistone H3瓜氨酸R2 + R8 + R17 Ly6G, Abcam)。Costaining被可视化荧光显微镜和488 - 596 -共轭二次抗体(BioLegend)安装与DAPI Fluoroshield安装介质(Abcam)。中性粒细胞(放大200倍)量化使用五个随机Ly6G-positive字段每节和动物。净形成(放大400 x 200 x)量化使用五个随机cit-H3 (citrullinated组蛋白H3)积极字段每节的动物。正面面积的百分比计算相对于整个视野ImageJ软件。

2.5。单个细胞悬液和流式细胞术

老鼠牺牲心肌梗死后1天。周边血液通过心脏穿刺绘制成spray-coated K2EDTA管(BD生物科学)。红细胞是细胞溶解的红细胞裂解缓冲(BioLegend)。和剩余的细胞与PBS resuspended含有0.5% ( )BSA。这些细胞被孵化后抗体:anti-CD11b-APC, M1/70 (BioLegend);-Ly6C-PerCP / Cy5.5 HK1.4 (BioLegend);和-Ly6G-PE 1 a8 (BioLegend)。中性粒细胞被确认为CD11b⁺Ly6G^高Ly6C^低。数据获得的BD FACSAria™II。

2.6。定量实时聚合酶链反应

总RNA是孤立的,第一链合成进行了使用PrimeScript™II 1^圣链cDNA合成装备(豆类生物Inc .)。定量实时PCR使用结核病快速绿色™qPCR混合(豆类生物Inc .)中执行Bio-Rad只连接™实时检测系统。相对表达水平取决于正常化亩所支配β肌动蛋白通过ΔΔC (Actb)_t方法。

给出了使用的引物序列如下:Actb,向前5 - - - - - -ACGTTGACATCCGTAAAGACC-3 ,反向5 - - - - - -ACACAGAGTACTTGCGCTCA-3 ;载脂蛋白e,向前5 - - - - - -AACCGCTTCTGGGATTACCTG-3 ,反向5 - - - - - -GTCCTCCATCAGTGCCGTCA-3 ;肿瘤坏死因子,提出5 - - - - - -CCCCTCTATTTATATTTGCACT-3 ,反向5 - - - - - -CCAAATCAGCGTTATTAAGACA-3 ;白细胞介素6、前进5 - - - - - -CCTAGTGCGTTATGCCTA-3 ,反向5 - - - - - -GTCCCAACATTCATATTGTCA-3 ;Mpo、前进5 - - - - - -GCCAAACTGAATCGCCAGA-3 ,反向5 - - - - - -ATGTTAAGAGCAGGCAAATCCA-3 ;Elane,向前5 - - - - - -AGGCATTGACTCCTTCATCCG-3 ,反向5 - - - - - -CCTAGTTGGTCCTGCCCTCTCG-3 ;和Itgam向前5 - - - - - -CATTTCTTGCCTGTGACCAA-3 ,反向5 - - - - - -GTATTCTCAGCACCTAAACCC-3 。

2.7。细胞隔离和网络的形成

小鼠中性粒细胞是收获和纯化如前所述13,14]。总之,骨髓细胞聚集并添加到Percoll梯度组成的52%,65%,78% Percoll层和离心机在2500 rpm在室温下30分钟。细胞乐队在65%和78%之间层是收获,和血红细胞和红细胞裂解缓冲细胞溶解。细胞被确定通过与anti-CD11b-APC流式细胞术,M1/70 (BioLegend);-Ly6C-PerCP / Cy5.5 HK1.4 (BioLegend);和-Ly6G-PE 1 a8 (BioLegend)。

如前所述(执行网络形成的定量15,16]。简单地说, 每口井的细胞(6到8重复每组)被镀成黑色96孔酶标(康宁)。NADPH氧化酶抑制剂(apocynin, Selleck化学品),重组人类APOE3 (PeproTech), P38 MAPK抑制剂(SB239063或losmapimod Beyotime生物技术研究所),或ERK1/2抑制剂(180204 FR, Beyotime生物技术研究所)进行预处理前30分钟phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA Beyotime生物技术研究所),特里同x - 100(表达载体),或H₂O₂被添加进井根据协议或需求。SYTOX绿色(表达载体)增加了1小时后PMA(100海里)或H₂O₂(8μ米)治疗和孵化为3小时。荧光是量化的激发波长488 nm和发射波长530 nm)使用一个自动板单色读者(FlexStation 3,分子设备)。净的形成是由荧光强度量化的分析。

为了量化活性氧(ROS)生成、相同数量的中性粒细胞是悬浮在BSA-free和无血清PBS。30分钟后,有或没有PMA治疗,DCFH-DA (Beyotime生物技术研究所)添加和孵化了30分钟。中性粒细胞被resuspended PBS和转移到一个黑色的96孔板。荧光强度是量化的激发波长488 nm和发射波长530 nm)使用一个自动板单色读者。细胞的数量清点RFUs正常化。为了量化ROS生成在梗塞的心,新收获的心被立即嵌入式尽快与10月和切片。包含5部分与PBS孵化μM dihydroethidium (Beyotime生物技术研究所)37°C为30分钟。与荧光显微镜和图像拍摄相同的曝光时间。平均灰度值由ImageJ量化软件。

为了虚拟化网, 每口井的细胞与poly-L-lysine涂镀到盖玻片。固定为4% ( )多聚甲醛PMA治疗18个小时后10分钟,DNA结构与主anti-cit-H3抗体染色,然后用488 -共轭二次抗体和DAPI。网是由荧光显微镜可视化(徕卡DM700)。生命的细胞染色, 每口井的细胞与poly-L-lysine涂镀到盖玻片。SYTOX绿色和赫斯特33258年(Beyotime生物技术研究所)增加了3.5 h PMA治疗后。孵化后另一个0.5 h,活细胞荧光显微镜的可视化。

2.8。西方墨点法

中性粒细胞是收获,分为3组(控制、PMA和PMA + APOE3)。孵化后与PBS、PMA或PMA + APOE3 1小时,细胞被离心机和细胞溶解里帕缓冲区(Beyotime生物技术研究所)。血清总蛋白测定通过BCA法(Beyotime生物技术研究所),和样本煮InstantView™sds - page加载缓冲区(Beyotime生物技术研究所)。样本由12% sds - page凝胶(Beyotime生物技术研究所)和转移到PVDF膜(微孔)。总蛋白乐队被可视化使用紫外线(ChemiDoc™成像系统,Bio-Rad)。膜被封锁(5% )牛奶TBST 1小时,然后孵化主要抗体(细胞信号技术)在一夜之间。这些墨迹与TBST冲洗三次和孵化HRP-conjugated二级抗体(细胞信号技术)40分钟。洗后TBST三次,屁股被应用到一个ECL发光氨试剂(Beyotime生物技术研究所)和可视化通过ChemiDoc™成像系统。乐队是由ImageJ量化的软件。

2.9。统计分析

结果被表示为 至少三个独立实验的每一个细胞实验小组或各组动物至少六个独立的实验。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试中,单向方差分析其次是图基的多重比较测试参数统计,邓恩和克鲁斯卡尔-沃利斯测试之后,非参数统计的多重比较。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。心肌损伤加重ApoE^{- / -}小鼠结扎后

调查的作用ApoE在心肌梗死损伤缺陷,我们建立了永久的心肌梗死冠状动脉结扎ApoE^{- / -}和WT老鼠。TTC染色的结果表明,梗塞面积明显增大ApoE^{- / -}老鼠相比WT同行(数字1(一)和1 (b))。为了进一步评估心肌损伤,血清水平的cTnI以及检查。与TTC染色数据协议,血清水平的cTnI以及心肌梗死后的显著增加ApoE^{- / -}和WT老鼠与对照组相比没有手术(图1 (c))。此外,血清水平的cTnI和水平显著提高ApoE^{- / -}老鼠比WT小鼠结扎后1天(图1 (c))。此外,超声心动图数据表明,心脏泵功能(LVEF和FS)是减少ApoE^{- / -}老鼠比WT小鼠结扎后7天,前提是心率均无显著差异(数字1 (d)和1 (e))。

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图1

的作用ApoE缺乏在缺血性损伤。(a, b)代表TTC染色法和定量的梗塞大小ApoE ^{- / -}和WT小鼠结扎后1天。每组包含6小鼠的数据。(c)的血清水平cTnI以及ApoE ^{- / -}和WT老鼠没有手术结扎后(Ctrl)或1天(MI)。每个任务组包括数据6老鼠,和每个MI组涉及到数据的老鼠。超声心动图(d, e)代表图像和定量的心率、左心室射血分数(LVEF)和部分缩短(FS)ApoE ^{- / -}和WT老鼠没有手术结扎后7天(Ctrl)或(MI)。每个任务组包括6小鼠,每个MI组包括8老鼠。数据显示为 。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试(两组)和单向方差分析之后,图基的多重比较测试(超过两组)。 和 。

小天狼星红染色画面显示更大的疤痕的大小ApoE^{- / -}老鼠相比WT小鼠结扎后7天(补充图1)。此外,存活曲线表明,后期的治疗(21天或更多),ApoE^{- / -}小鼠心肌损伤后高死亡率相比WT老鼠(补充图1 b)。我们的结果表明,ApoE心肌梗死后缺乏加重急性缺血性损伤,但这种感情不够强烈增加死亡率在急性炎症反应阶段。

3.2。ApoE心肌梗死后缺陷加剧了中性粒细胞激活

缺血性损伤的炎症反应中起着双刃剑的作用,梗死后心脏修复。在这里,我们假设ApoE缺陷可能导致炎症在梗塞的心里发展不利。我们预测,immunofluorescent染色的结果表明Ly6G-positive中性粒细胞的数量显著增加的梗塞和边缘区ApoE^{- / -}老鼠相比WT小鼠结扎后1天(数字2(一个)和2 (b)和补充图2)。流式细胞术(FCM)的结果证实CD11b显著增加⁺骨髓细胞和CD11b⁺Ly6G^高Ly6C^低的外周血中性粒细胞ApoE^{- / -}老鼠相比WT小鼠结扎后1天(图2 (c)和2 (d))。为了进一步验证ApoE缺乏提高免疫细胞的动员心肌梗死后,我们发现血液的变化比小鼠结扎前和FCM结扎后3天,7天。数据显示CD11b的百分比⁺细胞和CD11b⁺Gr-1⁺中性粒细胞(包括CD11b⁺Ly6C⁺单核细胞)一直在增加ApoE^{- / -}老鼠比WT小鼠结扎后(补充图2 c和d)。

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图2

ApoE缺乏促进中性粒细胞的激活。(a, b)代表immunofluorescent染色中的Ly6G梗塞的WT和的心ApoE ^{- / -}小鼠结扎后1天的百分比的Ly6G-positive区域整体形象。酒吧规模:100μm。每组包括6小鼠。(c, d)流式细胞术的控制策略和髓细胞的百分比(CD11b⁺)和中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G^高Ly6C^低)的血ApoE ^{- / -}和WT老鼠梗死后1天。每组包含8老鼠。(e)定量实时PCR proinflammation细胞因子肿瘤坏死因子(Tnf)、白介素- 1β(Il1b)和白介素6(白细胞介素6)梗塞的心里ApoE ^{- / -}和WT老鼠没有手术(Ctrl)和梗死(MI)后1天。每组包含6小鼠。(f, g)整合素的定量实时PCR alpha-M (Itgam),中性粒细胞髓过氧化酶(Mpo),中性粒细胞弹性蛋白酶(Elane)梗塞的心的ApoE ^{- / -}和WT老鼠没有手术(Ctrl)和梗死(MI)后1天。每组包含6小鼠。数据显示为 。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试(两组)和单向方差分析之后,图基的多重比较测试(超过两组)。 和 。

进一步检查炎症反应在梗塞的心,我们进行了定量实时PCR。信使rna表达水平的数据显示,proinflammation cytokines-Tnf, Il1b, Il6-were显著调节的梗塞的心ApoE^{- / -}老鼠相比WT同行结扎后1天(图2 (e))。此外,我们发现血清TNF水平α。ELISA结果显示血清TNF水平α增加小鼠结扎后的1天,而高水平ApoE^{- / -}老鼠比WT老鼠(补充图2 b)。整合素的mRNA alpha-M (Itgam CD11b)是调节梗塞的心里ApoE^{- / -}老鼠相比WT小鼠结扎后1天,表明增加CD11b的渗透⁺细胞内的梗塞的心的ApoE^{- / -}老鼠WT的老鼠相比(图2 (f))。此外,定量实时PCR结果显示出更高层次的Mpo或Elane mRNA表达受伤的心ApoE^{- / -}老鼠相比WT小鼠梗死后1天,表明增加功能或梗塞的心的中性粒细胞的数量ApoE^{- / -}老鼠(图2 (g))。

确认载脂蛋白E缺陷导致增强中性粒细胞的浸润在梗塞的心,我们静脉注射APOE3注入ApoE^{- / -}小鼠结扎前10分钟。Immunofluorescent Ly6G染色图像显示的百分比Ly6G-positive面积明显减少梗塞区内的老鼠注射APOE3比PBS同行结扎后1天(补充图2 e)。结果表明载脂蛋白E缺陷发挥了因果作用的增加心肌梗死后中性粒细胞的浸润。

3.3。ApoE缺乏促进心肌梗死后净形成

进一步探讨载脂蛋白e缺陷对中性粒细胞功能的角色,然后我们发现中性粒细胞胞外陷阱(网),中性粒细胞功能的方式,在梗塞的心。Immunofluorescent染色的图片citrullinated组蛋白H3 (cit-H3网)的标记显示,网的形成是显著增加在梗塞的心的ApoE^{- / -}老鼠相比WT小鼠结扎后1天(图3(一个))。此外,大多数网Ly6G是积极的(图3(一个))。为了确认载脂蛋白e缺陷的因果作用的净形成,APOE3静脉注入ApoE^{- / -}老鼠和immunofluorescent染色的执行cit-H3心收获结扎后1天。结果证实,APOE3注入显著降低净形成的梗塞区域内ApoE^{- / -}老鼠(图3 (b))。

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图3

载脂蛋白e缺陷促进中性粒细胞胞外陷阱的形成。(一)代表immunofluorescent染色anti-cit-H3 (anticitrullinated组蛋白H3,绿色),Ly6G(红色),和DAPI WT的心和内(蓝色)ApoE ^{- / -}小鼠结扎后1天的百分比cit-H3-positive网的整体形象。每组包含6小鼠。酒吧规模:50μm。(b)代表immunofluorescent染色anti-cit-H3(红色),SYTOX绿色(绿色),DAPI WT的心和内(蓝色)ApoE ^{- / -}小鼠结扎后1天的百分比cit-H3-positive网的整体形象。每组包含6小鼠。酒吧规模:200μm。(c)代表dihydroethidium染色法和平均灰度值(综合的定量 )心的WT老鼠,ApoE ^{- / -}老鼠,ApoE ^{- / -}小鼠注射APOE3结扎后1天。酒吧规模:50μm。每组包括6小鼠。数据显示为 。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试(两组)、单向方差分析Dunnett紧随其后的多重比较测试(b),和克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后,邓恩的多重比较检验(c)。 和 。

鉴于cit-H3-positive网的形成是ROS-dependent, ROS生成后缺血性损伤当时被dihydroethidium染色。结果表明,内ROS生成增加梗塞的心的ApoE^{- / -}小鼠相比WT小鼠结扎后1天。此外,APOE3治疗倾向于减少梗塞的心脏内ROS生成ApoE^{- / -}老鼠虽然没有达到统计学意义(图3 (c))。

3.4。ApoE缺乏促进通过NADPH Oxidase-ROS-Dependent净形成通路

找出是否ApoE缺乏可以直接促进网的形成,我们执行一个中性粒细胞从WT分离和体外实验ApoE^{- / -}老鼠。immunofluorescent染色的结果显示,两种中性粒细胞cit-H3 PMA后积极治疗,与体内净(图形成的结果4(一))。更多的净形成检测ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞比WT mouse-derived PMA刺激(图后中性粒细胞4 (b))。定量实时PCR结果表明,中性粒细胞的Apoe非常低水平表达相比,肝脏和心脏(图4 (c)),这表明ApoE的主要细胞来源来自细胞外的中性粒细胞。此外,10 ng / mL APOE3补充可以减少净形成PMA-treated中性粒细胞从WT或孤立ApoE^{- / -}老鼠(图4 (d))。

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图4

ApoE ^{- / -}缺乏通过NADPH oxidase-ROS-dependent通路调节网络的形成。(一)代表immunofluorescent染色cit-H3(绿色),Ly6G(红色),和DAPI(蓝色)ApoE ^{- / -}——WT-derived中性粒细胞治疗PMA 18小时。酒吧规模:50μm。(b)代表活细胞染色SYTOX绿(绿色,细胞外DNA)和赫斯特33258(蓝色,总DNA)ApoE ^{- / -}- - - WT-derived中性粒细胞和PMA刺激4小时。酒吧规模:100μm。净的形成和体外定量ApoE ^{- / -}- - - WT-derived中性粒细胞和PMA刺激2 h, 4 h, 6 h, 18 h SYTOX绿色。 (ApoE ^{- / -}mouse-derived中性粒细胞与WT刺激小鼠4小时后), (ApoE ^{- / -}mouse-derived中性粒细胞与WT小鼠6小时后刺激),和 (ApoE ^{- / -}mouse-derived小鼠中性粒细胞与WT刺激后18小时)。(c)定量实时PCR的载脂蛋白E (Apoe)肝脏、心脏和纯化WT小鼠中性粒细胞( )。(d)的体外定量净的形成ApoE ^{- / -}鼠标和WT mouse-derived中性粒细胞和PMA刺激有或没有的载脂蛋白eε3 (APOE3)补充了4小时。ROS水平(e)定量ApoE ^{- / -}鼠标和WT mouse-derived中性粒细胞和PMA刺激有或没有APOE3补充了4小时。(f)的体外定量净的形成ApoE ^{- / -}鼠标和WT mouse-derived中性粒细胞和PMA刺激有或没有apocynin补充了4小时。(g)的体外定量净的形成ApoE ^{- / -}鼠标和WT mouse-derived中性粒细胞刺激与H₂O₂有或没有APOE3补充了4小时。列满了黑色:WT mouse-derived中性粒细胞。列满了白色:ApoE ^{- / -}mouse-derived中性粒细胞。数据显示为 。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试(两组)和单向方差分析之后,图基的多重比较测试(超过两组)或Dunnett多重比较的测试(d, f)。 和 。

鉴于cit-H3-positive或PMA-induced网NADPH oxidase-ROS依赖,我们首先想知道APOE3补充可能影响ROS生成。结果表明,PMA治疗促进活性氧生成在中性粒细胞相比治疗组(图4 (e))。尽管ROS生成增加ApoE^{- / -}mouse-derived PMA治疗后中性粒细胞与WT老鼠相比,APOE3未能在两种中性粒细胞降低ROS水平PMA治疗后(图4 (e))。apocynin用NADPH氧化酶抑制剂预处理,结果表明:PMA-induced净形成抑制了apocynin治疗和证实,净形成NADPH oxidase-ROS依赖(图4 (f))。因为APOE3未能抑制PMA-induced ROS生成,然后我们想知道APOE3抑制网络形成的下游信号通路ROS生成。通过使用过氧化氢(H₂O₂)治疗,我们发现APOE3可以抑制H₂O₂全身净形成这两种类型的中性粒细胞(图4 (g))。此外,净形成增强ApoE^{- / -}mouse-derived H后中性粒细胞₂O₂治疗相比WT mouse-derived中性粒细胞(图4 (g))。结果表明:载脂蛋白E抑制H₂O₂全身或PMA-induced净活性氧的形成通过下游信号通路。

3.5。通过ROS-MAPK-MSK1 APOE3抑制净形成通路

MAPK通路是一个净ROS的下游信号通路的形成,我们调查是否针对MAPKs会抑制网络的形成。净形成体外实验的结果显示,无论是P38 MAPK抑制剂(SB239063或losmapimod)和ERK1/2抑制剂(FR180204)可以显著抑制净形成ApoE^{- / -}老鼠和WT mouse-derived中性粒细胞(图5(一个))。西方墨点法数据证实PMA治疗后,水平的磷酸化ERK在中性粒细胞增加,磷酸化P38 MAPK显著增加ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞,磷酸化物在WT mouse-derived中性粒细胞显著增加(数据5 (b)和5 (c))。此外,APOE3治疗可以抑制PMA-induced ERK,物,P38 MAPK磷酸化ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞,但只有磷酸化P38 MAPK达到显著减少ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞在WT mouse-derived磷酸化物达到明显降低中性粒细胞(数字5 (b)和5 (c))。物,结果表明,ERK和P38 MAPK都参与PMA-induced净形成但只有P38 MAPK敏感的载脂蛋白E缺陷。

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图5

通过MAPK-MSK1 APOE3影响净形成通路。(a)的体外定量净WT - - -的形成ApoE ^{- / -}派生的中性粒细胞刺激PMA和不同浓度的P38 MAPK抑制剂(SB239063或losmapimod)或ERK抑制剂(FR180204) 4小时。(b, c)西方的印迹和定量ERK1/2 (ERK)磷酸化ERK1/2 (p-ERK),物,磷酸化物(p-JNK), P38 MAPK和磷酸化P38 MAPK (p-P38 MAPK)在WT -和表达ApoE ^{- / -}派生的中性粒细胞刺激与PBS、PMA或PMA + APOE3 1小时。(d, e)西方印迹和定量的磷酸化MSK1 (p-MSK1)和磷酸化ATF2 WT -和(p-ATF2)表达式ApoE ^{- / -}派生的中性粒细胞刺激与PBS、PMA或PMA + APOE3 1小时。列满了黑色:WT mouse-derived中性粒细胞。列满了白色:ApoE ^{- / -}mouse-derived中性粒细胞。数据显示为 。统计测试包括单向方差分析Dunnett紧随其后的多重比较检验(a)和克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的多重比较检验(c, e)。 和 。

APOE3进一步算出一个可能的目标,然后我们检查的水平磷酸化MSK1 ATF2,下游MAPKs分子,尤其是P38 MAPK。西方墨点法数据显示,PMA治疗增加MSK1磷酸化在两种中性粒细胞PMA治疗后,虽然APOE3治疗可以减少PMA-induced MSK1磷酸化两种中性粒细胞(数字5 (d)和5 (e))。此外,磷酸化水平MSK1显著增加ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞WT mouse-derived每组相比,中性粒细胞与同等待遇(数字5 (d)和5 (e))。磷酸化水平ATF2 PMA治疗后的增加中性粒细胞与PBS治疗组相比,但它只达到了显著增加ApoE^{- / -}mouse-derived PMA治疗后中性粒细胞。此外,APOE3治疗没有显著影响PMA-induced ATF2磷酸化在mouse-derived中性粒细胞(数字5 (d)和5 (e))。磷酸化水平的增加MSK1、磷酸化ATF2磷酸化ERK,磷酸化P38 MAPK、磷酸化物是按照净形成(增加数据4 (b)和4 (d))。这些结果表明MSK1是载脂蛋白E在调节的目标网络的形成。

3.6。抑制净生产过剩减少心肌损伤ApoE^{- / -}老鼠

载脂蛋白e缺陷通过NADPH oxidase-ROS-dependent途径促进净生产过剩,cit-H3-positive网的形成是肽基精氨酸deiminase 4 (PAD4)的依赖。NADPH氧化酶抑制剂,apocynin, PAD4抑制剂,Cl-amidine,被用来阐明是否过度网络形成的直接原因是增加心肌损伤ApoE^{- / -}老鼠。Apocynin(0.5毫克/公斤)或Cl-amidine(25毫克/公斤)注入腹腔内结扎前30分钟减少净形成ApoE^{- / -}和WT老鼠。TTC染色数据显示梗塞大小是下降的ApoE^{- / -}小鼠注射apocynin或Cl-amidine相比的ApoE^{- / -}小鼠注射PBS结扎后1天(数字6(一)和6 (b))。有趣的是,我们观察到梗塞大小增加WT apocynin或Cl-amidine治疗后小鼠(数字6(一)和6 (b)),表明心肌梗死和维修需要一个合适的网。然后,我们评估心肌损伤的血清水平的浓度。与TTC染色结果一致,apocynin或Cl-amidine注射血清水平水平的降低ApoE^{- / -}老鼠比ApoE^{- / -}老鼠注射了PBS(图6 (c))。验证Cl-amidine治疗的影响,我们进行了immunofluorescent cit-H3染色。染色梗塞的心的图片显示,净形成Cl-amidine治疗后明显下降而在PBS治疗ApoE^{- / -}和WT老鼠(图6 (d))。

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(b)
(c)
(d)

图6

过度的净形成心肌梗死损伤的作用ApoE ^{- / -}老鼠。(a, b)代表TTC染色和WT或梗塞大小的百分比ApoE ^{- / -}小鼠PBS、apocynin或Cl-amidine注入结扎后1天。每组包含6小鼠。(c)血清水平的WT或水平ApoE ^{- / -}小鼠PBS、apocynin或Cl-amidine注入结扎后1天。每组包含8老鼠。免疫组织化学染色(d)代表cit-H3 (citrullinated组蛋白H3、红色),SYTOX绿色(绿色),DAPI WT的心或内(蓝色)ApoE ^{- / -}小鼠PBS、apocynin或Cl-amidine注入结扎后1天。和定量的百分比的cit-H3-positive区域整体形象。酒吧规模:100μm。每组包括6小鼠。列满了黑色:WT老鼠。列满了白色:ApoE ^{- / -}老鼠。数据显示为 。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试(两组)和单向方差分析Dunnett紧随其后的多重比较测试(超过两组)。 和 。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,过量的活性氧生成和净形成梗塞的心里ApoE^{- / -}老鼠是伴随着增加CD11b的渗透⁺Ly6G^高Ly6C^低中性粒细胞和NADPH oxidase-ROS-dependent通路的激活。ApoE缺乏促进网的形成通过upregulation ERK和P38 MAPK磷酸化水平以及MSK1的磷酸化水平,MAPKs的下游分子。然而,APOE3抑制网的形成不是通过直接抑制ROS生成但ROS-dependent的调节下游信号通路,MAPK-MSK1信号通路。因此,这些数据表明载脂蛋白E的关键作用减轻心肌损伤通过调节中性粒细胞功能和炎症反应在心肌梗塞的早期阶段。

中性粒细胞参与先天免疫的第一行的进步引发了入侵的病原体或创伤性病原体17]。除了吞噬作用和氧化破裂,网的形成被认为是一个重要的方式防御感染(18]。缺血性损伤后,中性粒细胞激活和招募,参与炎症过程,并去除死细胞的碎片(19]。除了proinflammation函数、中性粒细胞也促进巨噬细胞的分化与极化对心肌梗死后修缮的表型(20.]。

除了调节循环脂质稳态,载脂蛋白E具有抗氧化活性的神经细胞株(B12)和调节造血干细胞增殖通过促进胆固醇流出5,6]。以前的研究报道,ApoE缺乏促进CD11b⁺Ly6C^高单核细胞增多症导致受损梗塞维修(21]。在我们的研究中,我们还发现增加缺血性损伤ApoE缺乏小鼠以及增强的动员,形成中性粒细胞浸润,细胞外的陷阱。净形成两个enzyme-based机制:肽基精氨酸deiminase 4和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(22),在这里,我们发现网络的形成是通过ROS-dependent,心肌梗死后citrullinated组蛋白H3-dominant通路。有趣的是,APOE3抑制净形成但未能显著减少ROS生成急性治疗后体内和体外。

PMA-induced网是NADPH oxidase-ROS依赖(5,23),可以废除的NADPH氧化酶抑制剂,apocynin。在这里,我们发现,低剂量的APOE3抑制PMA-induced和H₂O₂全身净形成ApoE^{- / -}鼠标- WT mouse-derived中性粒细胞,同意前面的研究载脂蛋白e的抗氧化活性5,23]。然而,目前的研究发现APOE3治疗不能减少ROS生成PMA治疗后。因此,我们推测APOE3净形成通过抑制ROS的下游信号通路。以前的研究报道,Raf-MEK-ERK通路和P38 MAPK通路下游净NADPH oxidase-ROS-dependent通路的形成(15,24,25]。我们的数据表明,P38 MAPK或ERK1/2抑制剂治疗可以抑制PMA-induced净形成ApoE^{- / -}老鼠和WT mouse-derived中性粒细胞。此外,MAPK磷酸化水平PMA治疗后两种中性粒细胞增加,但APOE3治疗显著降低PMA-induced P38 MAPK磷酸化ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞。这些结果表明,MAPKs参与PMA-induced净形成,但只有P38 MAPK PMA治疗后载脂蛋白E缺陷很敏感。因此,下游MAPKs分子,特别是P38 MAPK,已发现。我们发现磷酸化MSK1 PMA治疗后表达明显增加而APOE3治疗可以减少PMA-induced MSK1磷酸化两种中性粒细胞。此外,磷酸化MSK1明显更高的水平ApoE^{- / -}mouse-derived中性粒细胞每个WT老鼠相比,按照净体外形成的数量。MAPKs的抑制剂可以抑制MSK1磷酸化,我们推测,载脂蛋白E抑制净生产过剩减少MSK1磷酸化(26]。但底层机制APOE3调节MSK1磷酸化需要解开。和更多的选择性MSK1抑制剂需要进一步证实针对磷酸化MSK1能否真正抑制网络的形成。

几项研究已经发现,针对网限制在WT小鼠或大鼠缺血再灌注损伤,减少血栓形成或nonreflow [10,11,27]。st段抬高的急性心肌梗死患者肝素),他们可能有5 - 50%的发病率痛苦nonreflow后主要经皮冠状动脉介入(28),这表明永久缺血性损伤重心肌梗死。但网的作用在永久性心肌梗死损伤和修复后永久性结扎没有透露。在这里,我们发现apocynin或Cl-amidine治疗心肌损伤的限制ApoE^{- / -}小鼠急性心肌梗塞后,表明过度净形成是增加心肌损伤的原因之一。至于WT老鼠,apocynin或Cl-amidine治疗增加结扎后缺血性损伤,这是完全不同的从缺血再灌注模型。永久性结扎模型的病理过程可能影响减少血栓形成或血流动力学变化下结扎缝合和可能受影响的主要是由组织缺氧和炎症反应,而血栓和血液动力学的变化会直接影响到梗塞大小在缺血再灌注模型29日]。因此,我们推测,一个合适的网是心肌梗死后要求的数量。因为大多数的临床患者AMI有促进网络形成的危险因素(30.,31日),我们认为会有一个潜在的有益影响抑制净形成STEMI患者减少nonreflow和限制应对炎症反应。

5。结论

我们的研究表明,缺乏载脂蛋白E促进通过ROS-MAPK-MSK1净形成通路,导致增加心肌梗死后心肌损伤(图在图的研究7)。净形成激活ROS生成增加心肌梗死的早期阶段。网通过抑制NADPH氧化酶的抑制或抑制肽基精氨酸deiminase 4可能提供一个新的策略来保护心肌梗死损伤ApoE^{- / -}老鼠。鉴于大多数临床AMI患者伴有高血糖或高胆固醇血症,风险因素的净生产过剩,抑制净生产过剩可能目标心肌梗死损伤降到最低。

图7

图解模型ApoE / APOE3的作用在调节中性粒细胞功能,尤其是网络的形成,在急性心肌梗死的背景下。急性心肌梗死后,中性粒细胞主要从骨髓动员,渗透到梗塞的心脏,并形成网通过NADPH oxidase-ROS-MAPK-MSK1信号通路。在这个过程中,载脂蛋白E调节中性粒细胞浸润和净形成。至于网络形成,载脂蛋白E未能减少ROS生成但可以抑制MSK1磷酸化。此外,P38 MAPK对载脂蛋白E缺陷十分敏感。APOE3补充抑制P38 MAPK磷酸化作用条件下的载脂蛋白E缺陷。此外,载脂蛋白e缺陷促进PMA-induced ERK1/2磷酸化,但APOE3未能抑制ERK1/2磷酸化后PMA治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(91439121,91439121,91439121,81370402)和国家重点研发项目(2016号yfc1101102)。

补充材料

图S1:心脏治疗受损ApoE心肌梗死后缺乏的老鼠。(一)代表天狼星红染色和疤痕的大小的定量ApoE^{- / -}和WT小鼠结扎后7天。每组包含6小鼠的数据。(b)的生存曲线ApoE^{- / -}(实线)和WT(虚线)的小鼠结扎后(MI)。每组15老鼠(包括数据 )。数据显示为 。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试(两组)和生存率较(存活曲线)。 。图S2:载脂蛋白e缺陷促进中性粒细胞浸润和心肌梗死后动员。(a)代表immunofluorescent染色中的Ly6G梗塞的WT和的心ApoE^{- / -}小鼠结扎后1天。酒吧规模:100μm。(b)血清TNF水平α的ApoE^{- / -}和WT老鼠没有手术(Ctrl)和梗死(MI)后1天。每组包含8老鼠。(c, d)流式细胞术的控制策略和髓细胞的百分比(CD11b⁺)和中性粒细胞(CD11b(包括单核细胞)⁺Cr-1⁺)的血ApoE^{- / -}和WT老鼠没有手术(Ctrl)和结扎后3天,7天(MI)。每组包含6小鼠。(e)代表immunofluorescent染色中的Ly6G梗塞的心的ApoE^{- / -}老鼠有或没有APOE3结扎后1天,治疗的比例的Ly6G-positive区域整体形象。酒吧规模:200μm。每组包括6小鼠。数据显示为 。包括双尾学生的统计测试 - - - - - -测试(两组)和单向方差分析之后,图基的多重比较测试(b)或Dunnett多重比较的测试(e)。 , ,和^& (ApoE^{- / -}老鼠与WT小鼠结扎)和后3天^# (ApoE^{- / -}老鼠与WT小鼠结扎后7天)。(补充材料)