文摘

铜绿假单胞菌(PA)是一种最常见的病原体引起危重患者院内感染。然而,该机制在PA感染巨噬细胞生长状态和功能变化还不得而知。在目前的研究中,NADPH氧化酶,gp91^phox(NOX2)介导巨噬细胞衰老在PAO1 colony-dependent方式。gp91^phox可能调节衰老过程与NF -相互交互κB通路。在感染过程中,过度的差别或对这些gp91^phox在巨噬细胞可能影响NF的核活动κB p65, NF -差别而对这些κB p65导致抑制gp91的表情^phox。活性氧(ROS)担任两个分子之间的第二信使活性氧抑制剂,N乙酰半胱氨酸(NAC),可以部分恢复这些变化。因此,ROS和炎性细胞因子的水平,包括il - 6和TNFα,提升在PAO1感染,他们生产改变gp91的基因操纵的结果^phox和NF -κB p65以及NAC治疗。而且,衰老表型,SA -β加染色和p16^ink4a与gp91遗传操作后,改变^phox和NF -κB p65 NAC治疗。巨噬细胞的吞噬能力在衰老有所下降。总之,PA引向巨噬细胞衰老,衰老巨噬细胞具有吞噬能力降低。衰老的过程是由NADPH氧化酶gp91之间的交互^phox和NF -κB p65通过ROS作为第二信使。

1。介绍

铜绿假单胞菌(PA)是一种最常见的病原体引起院内感染,特别是在危重病人,导致高死亡率(1- - - - - -3]。肺,PA具有复杂的毒素分泌系统,可以破坏上皮完整性,导致菌血症(4]。PA的宿主反应是复杂的,涉及到多种细胞类型以及各种基因的激活。在感染的早期阶段,主机主要依赖于先天免疫细胞包括中性粒细胞和巨噬细胞对抗PA感染。例如,巨噬细胞识别和吞噬病原体和分泌促炎细胞因子,如增长肿瘤坏死因子-α(TNFα)和白介素- 6 (IL),显示一个有效的防御机制对细菌和病毒的病原体(5]。炎性细胞因子释放是细菌感染的特点之一;然而,夸张的炎症导致组织损伤,从而导致高发病率和死亡率。PA感染被发现后的死亡率相关肺部细菌负荷(6]。因此,细菌感染高负荷猜测导致炎症环境恶化。然而,夸大了对炎症细胞炎症的影响,如巨噬细胞的生长状态,还没有完全理解。

在感染过程中,活性氧(ROS),参与废除外国侮辱主要是由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶在吞噬细胞。此外,ROS继续参与复杂的生理过程,包括细胞信号传导和扩散和在疾病发病机制中扮演重要角色7,8]。NADPH氧化酶类(nox),如NOX1-5 DUOX1-2,用NADPH作为电子供体膜相关酶催化分子氧的简化型超氧化物和过氧化氢(H₂O₂)[9]。其中,多组分酶NOX2活性氧的主要来源是生产和广泛分布在吞噬细胞包括中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞在肺部[10]。NOX2复杂装配五个蛋白质,包括gp91膜蛋白质^phox/ NOX2和第22位^phox构成复杂的核心。催化部位和NADPH-binding网站是包含在gp91^phox/ NOX2蛋白质。较小的膜蛋白,第22位^phox可能作为gp91的稳定因素^phox/ NOX2蛋白复合物,以及附件为细胞质亚基p47网站^phox(11]。在感染期间,NOX2催化ROS的丰富生产废除细菌吞噬细胞。如上所述,这infection-intrigued氧化应激也会调节吞噬细胞的生长状态。

核因子-κB (NF -κB)是一种炎症性转录因子。在细胞质中的细菌感染,NF -的异质二聚体κB p65 p50与我分开κBα和转移到细胞核中p65结合上游的炎性细胞因子,调节他们的表情(12]。此前报道,NOX2担任夸张者或炎症抑制剂通过调节NF -κB活动(13,14]。NOX2导致中性粒细胞pyroptosis的损耗,导致过度的肺部炎症在PA感染(15]。因此,监管循环包括氮氧化物和NF -κB在吞噬细胞协调炎症反应和氧化可以推测;然而,这种监管机制可能产生特定的细胞领域影响细胞的命运。细胞衰老是细胞生长停止的状态,这是受到炎症和氧化应激的影响。因此,我们推断NOX2和NF -之间的监管κB可以确定巨噬细胞的生长状态,取决于感染的严重程度(细菌负荷),从而影响宿主防御。

2。材料和方法

2.1。的制备铜绿假单胞菌应变PAO1

最初,PAO1殖民地培养Luria-Bertani(磅)琼脂板在37°C一夜之间,其次是接种10毫升新鲜磅中等一夜之间的持续增长。之后的另一个接种PAO1新鲜磅汤,这个媒介是培养达成最优密度被用于感染模型在不同菌落(cfu)。

2.2。巨噬细胞的制备

RAW264.7细胞接种在6-well板RPMI 1640中等密度的5×10⁵/ L一夜之间在37°C。感染巨噬细胞模型,PAO1被播种在6-well 4×10的密度板⁶/好,1.6×10⁷/嗯,分别。随后,细胞在4和24小时,收获。ROS抑制试验,活性氧抑制剂,NAC(股票浓度:100毫米,工作浓度:1毫米;Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国),添加PAO1感染前30分钟,直到细胞收获。

2.3。检测细胞衰老

SA -β加染色进行培养的巨噬细胞根据制造商的指示(Beyotime生物技术,中国)。此外,p16^ink4a抗体(Abcam、上海、中国)是用于检测细胞衰老。

2.4。慢病毒感染和基因操作

调查NOX2和NF -之间的交互κB, gp91^phox被撞倒下来和质粒中也是使用慢病毒感染系统pLVX-shRNA2(美国Clontech有限公司);此外,p65基因被撞倒了。简单地说,细胞转染的Lenti-X™慢病毒表达系统使用慢病毒包装的设备(Yuduo生物科技、上海、中国)根据制造商的协议。5×10⁵巨噬细胞是镀在25厘米²细胞培养瓶。18 h后,聚凝胺添加在最后8毫克/毫升的浓度,和100毫升病毒上清液补充说,其次是文化持续24小时。随后,rpmi - 1640中包含慢病毒被替换为一个正常的rpmi - 1640完全培养基。接下来,添加2毫克/毫升嘌呤霉素每2天筛查共计7天,之后稳定细胞系是感染控制,pLVX-gp91^phoxKDshRNA2, pLVX-gp91^phox分别OEshRNA2, pLVX-p65KDshRNA2质粒。最后,巨噬细胞与不同的基因操作培养和治疗在适当的时间点。

2.5。西方墨点法

主要anti-NF -κB p65 gp91^phoxNa-K-ATPase,β肌动蛋白,组蛋白H3抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。Phospho-NF -κB p65 (Ser536)从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。西方墨点法进行细胞、膜蛋白,和核提取物如前所述16]。β肌动蛋白是用作控制整个细胞中提取蛋白质,为核蛋白质组蛋白H3, Na-K-ATPase膜蛋白。

2.6。ROS生产检测

细胞收获在指定的时间点和ROS生产确定后,制造商的指示使用商业套装(汇佳生物技术,中国)。试验测量的结果在一个BioTek ELISA板读者(美国VT BioTek仪器,Inc .)在405海里。

2.7。促炎细胞因子的表达

细胞被收集在指定的时间点。实时PCR用于检测的表达水平TNFα,il - 10,il - 6使用以下的基因引物:tnfα(向前:5-AGGATAACTGGAACACAGACA-3 ;反向:5-TTGGAGACAACATACAAGCA-3),il - 10(向前:5-CATACTGCTAACCGACTCCT-3 ;反向:5-AATGCTCCTTGATTTCTGG-3),il - 6(向前:5-GCCTTCCCTACTTCACAA-3 ;反向:5-ACAACTCTTTTCTCATTTCCAC-3),gapdh(向前:5-GCAGTAAACAGTCCATCTACAA-3 ;反向:5-CTCTCCTTCATCCACCCT-3)。相对表达式计算为2^−ΔΔCT。

2.8。吞噬作用分析

野生型(WT) RAW264.7巨噬细胞和不同的遗传操作被播种在6-well板的密度5×10⁵细胞/一夜之间。然后,细胞治疗PAO1 4×10的菌落计数⁶/好,1.6×10⁷/好4 h接着用荧光标记乳胶颗粒浓度的10×10⁷珠子/毫升(表达载体)额外4 h。的如果WT巨噬细胞有或没有空向量被用作控制。NAC治疗进行pLVX-gp91 PAO1感染前30分钟^phoxOEshRNA2巨噬细胞阐明是否抑制ROS可能影响巨噬细胞的吞噬作用。然后,这些细胞被洗了三次与磷酸盐(PBS)删除未使用的珠子。细胞外的荧光猝灭了台盼蓝和吞噬作用使珠子的RAW264.7测量使用FLUOstar最适条件荧光计(Ortenberg BMG LABTECH有限公司,德国)在480 nm的激发波长和发射波长520纳米。数据表示为相对荧光单位(RFUs)。

2.9。统计分析

评估组织之间的差异,分析使用GraphPad Prism 5.0软件由一个未配对以及(两组)或方差分析(多个组)其次是Tukey-Kramer多重比较测试后。非参数方差分析与克鲁斯卡尔-沃利斯用于事后考验。结果表示为 。双尾 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。NADPH氧化酶激活、氧化应激和NF -κB参与激活巨噬细胞衰老在PA感染

PAO1 4×10的菌落计数⁶CFU和1.6×10⁷CFU孵化RAW264.7 4巨噬细胞,24 h,分别。因此,PA引起巨噬细胞衰老时间和殖民地count-dependent方式。如数据所示1(一)和1 (b),在4×10 PAO1⁶CFU导致大约15%在4 h coincubation巨噬细胞细胞衰老,增加到35%在24小时。PAO1 1.6×10⁷CFU进一步增加了细胞衰老的百分比,与PAO1 coincubation后为1.6×10⁷CFU 24 h,巨噬细胞表现出积极的SA - 70%以上β加染色。此外,确认细胞衰老PAO1后发生感染,p16 senescence-associated生物标志物的表达^ink4a检测到。如图1 (c),p16的表达^ink4a大大增加在PAO1后巨噬细胞感染时间和殖民地count-dependent的方式。

因为细胞衰老是高度相关的氧化应激,接下来,我们确定了ROS生产调查在PAO1感染巨噬细胞的氧化状态。24小时后,巨噬细胞治疗1.6×10⁷CFU PAO1产生ROS > 8倍而控制细胞接受一次车,和殖民地count-dependent方式(图2(一个))。随后,我们调查了ROS的表达式生成器,NADPH氧化酶元素,gp91^phox。图2 (b)揭示了gp91表达增加^phoxPAO1治疗后巨噬细胞。综上所述,NADPH氧化酶在PAO1-induced巨噬细胞衰老引起活性氧的生产。

根据之前的报道(17),NF -κB激活通常是伴随着氧化应激在感染。显示在图2 (b),核的表达NF -κB p65 RAW264.7细胞增加PAO1 4和24小时后感染,这表明核易位p65增加在这个过程。此外,高活动的NF -κB p65显示为增加磷酸化的p65 Ser536通过感染(图2 (b))。这些结果表明,核NF -κB p65在衰老巨噬细胞激活PAO1感染。

3.2。NADPH氧化酶亚基gp91^phox通过ROS作为第二信使调节p65激活,导致巨噬细胞衰老期间PAO1感染

因为gp91^phox和NF -κB p65参与PAO1-induced巨噬细胞衰老,我们假定一个潜在的相互作用机制。接下来,gp91^phox(称为pLVX-gp91phoxOEshRNA2和pLVX-gp91phoxKDshRNA2 resp)是调节和表达下调的基因操作使用慢病毒系统,和NF -κB p65也表达下调(pLVX-p65KDshRNA2)。如图3(a),相比PAO1-infected WT RAW264.7,与pLVX-gp91phoxKDshRNA2回应PAO1感染巨噬细胞低gp91^phox表达和降低核NF -κB p65 Ser536及其磷酸化水平。相反,RAW264.7 pLVX-gp91phoxOEshRNA2表现出高核NF -κB p65水平,比WT RAW264.7 Ser536磷酸化。这些结果表明,核NF -κB p65活动可能受到gp91的激活^phox。有趣的是,NF -差别的对这些κB p65也减少了gp91的表达^phox在PAO1-infected巨噬细胞,从而表明两个分子之间的反馈回路。

自从gp91^phox和NF -κB p65本地化在不同细胞隔间,直接相互作用是不可能的。因此,我们假定gp91^phox调节NF -κ活动通过ROS作为第二信使。WT巨噬细胞和gp91^phox-overexpressing巨噬细胞与活性氧抑制剂治疗,南汽,PAO1感染之前,为了调查发生的抑制作用在NF -κB p65活动。如图3(b), NAC治疗很大程度上减少了核NF -κB p65和磷酸化p65在Ser536 PAO1 WT或gp91感染^phox-overexpressing巨噬细胞。综上所述,这些研究结果支持,ROS二级信使作为调节因子在gp91之间的互动^phox和NF -κB p65。

接下来,我们检查这是否交互gp91循环^phox-ROS-NF -κB p65可能最终影响巨噬细胞的衰老表型在PAO1感染。图4(一)的差别表明PAO1感染期间,对这些gp91^phox和NF -κB p65巨噬细胞减少细胞巨噬细胞衰老表型,包括积极的SA -β加染色和p16^ink4a表达与WT巨噬细胞。相反,gp91的过度^phox在巨噬细胞,导致细胞衰老的比例升高的增加积极的SA -β加染色和p16^ink4a表达式。此外,相比PAO1-infected WT gp91^phox-overexpressing巨噬细胞,诱导衰老的NAC治疗有效地中止他们的能力在巨噬细胞(图4 (b))。综上所述,PAO1感染诱导巨噬细胞通过调节衰老gp91之间^phox和NF -κB p65,由活性氧产量作为第二信使。

3.3。gp91^phox和NF -κB协调调节氧化应激和炎症在PAO1侵染诱导巨噬细胞衰老

自一个交互循环gp91phox-ROS-NF -κB p65 PAO1期间在衰老检测巨噬细胞感染,我们评估了ROS的产生和炎性细胞因子的表达包括il - 6、il - 10和肿瘤坏死因子α。如数据所示5(一个)和5 (b)这些组织中观察到,一个显著差异是由单向方差分析测试( );与对照组相比,与PAO1感染巨噬细胞产生的垃圾量或更多的活性氧。这个产量在很大程度上抑制pLVX-gp91升高^phoxKDshRNA2 pLVX-p65KDshRNA2巨噬细胞。NAC治疗在PAO1-infected巨噬细胞活性氧的生产减少了约24.3%,相比PAO1-infected WT巨噬细胞;然而,统计差异ROS生产没有观察到两组之间(事后测试)。在PAO1感染,产生的ROS pLVX-gp91^phoxOEshRNA2巨噬细胞是15.7倍高于基准,由WT,显著高于pLVX-gp91^phoxKDshRNA2, pLVX-p65KDshRNA2巨噬细胞。NAC治疗显著pLVX-gp91废除了ROS增加生产^phoxOEshRNA2回应PAO1感染的巨噬细胞。

此外,探讨炎性细胞因子的表达,我们的mRNA水平决定的TNFα,il - 6,il - 10使用一个实时PCR方法。在数据显示5 (c)- - - - - -5 (e)在PAO1感染、WT巨噬细胞水平的增加TNFα,il - 6,il - 10基因的表达。WT RAW264.7相比,pLVX-gp91phoxKDshRNA2 RAW264.7提出降低TNFα和il - 6水平,升高il - 10表达( )。另一方面,pLVX-gp91^phoxOEshRNA2巨噬细胞显示的mRNA水平升高TNFαil - 6和减少il - 10而pLVX-gp91phoxKDshRNA2巨噬细胞。此外,pLVX-p65KDshRNA2巨噬细胞表现出减少mRNA的TNF水平α和巨噬细胞il - 6和il - 10 WT相比升高。WT或pLVX-gp91 NAC治疗^phoxOEshRNA2巨噬细胞大大降低il - 6和TNFα表达和il - 10表达升高比类似的组织。这些结果表明,活性氧在衰老巨噬细胞和炎性细胞因子产生协同NOX2之间的相互交互,NF -κB在PAO1感染。

3.4。衰老巨噬细胞吞噬作用的破坏能力展出

评估衰老巨噬细胞的吞噬能力,使珠子的决心。如图6,4 h孵化后使珠子,PAO1-infected巨噬细胞的吞噬能力有所增强,而如果没有感染的巨噬细胞。有趣的是,巨噬细胞感染细菌负荷提出了更高的吞噬能力低于高感染细菌负荷。同样,在PAO1感染(1.6×10⁷/),pLVX-gp91的吞噬能力^phoxOEshRNA2巨噬细胞低于WT, pLVX-gp91^phox分别KDshRNA2, pLVX-p65KDshRNA2巨噬细胞。pLVX-gp91 NAC治疗^phoxOEshRNA2巨噬细胞可以在类似条件下扭转其吞噬能力降低。同时,gp91之间的吞噬能力^phoxKDshRNA2、pLVX-p65KDshRNA2 NAC-treated pLVX-gp91^phoxOEshRNA2在PAO1感染巨噬细胞相似。在这项研究中,它表明pLVX-gp91^phoxOEshRNA2巨噬细胞表现出更多的对衰老期间PAO1感染,表明PA induced-senescent巨噬细胞吞噬作用的破坏能力。

4所示。讨论

在此,我们报道了NADPH氧化酶2介导巨噬细胞衰老期间通过交互NF - PA感染κB通路。具体地说,(1)PAO1 colony-dependent方式诱导巨噬细胞衰老;NOX2-dependent ROS生产和由此产生的氧化应激可能导致巨噬细胞衰老期间PAO1感染。(2)NOX2相互与核NF -κB活动延续炎性细胞因子的释放。其中,ROS作为第二信使调节NF -κB在PAO1激活感染。(3)衰老在PAO1感染巨噬细胞表现出妥协吞噬作用。

通常,PA感染肺部导致NOX2和NOX4的激活。此前报道,PA感染刺激人类的肺微血管内皮细胞(HLMECs)对通过激活凋亡NOX4但不是NOX2,导致肺通透性升高。此外,NOX2块差别基因对这些炎症通路(18]。p47的基因缺失^phox(胞质元素NOX2)导致的失活NF -κB,从而减少受损的炎性分泌物细菌清除率。在巨噬细胞,p47^phox也部分影响NF -κB易位,整个TLR4的表达和p47^phox有助于最大激活NF -κB (13]。因此,NADPH氧化酶的活性在NF -是一个有趣的因素κB激活。

虽然关注中性粒细胞的作用在脓毒症或肺部感染包括pyroptosis和嗜中性粒细胞衰老(15,19),对巨噬细胞增殖状态,衰老,或者在感染细胞凋亡。这项研究表明,在PAO1感染,巨噬细胞是指向衰老。根据之前的报道(20.),NADPH氧化酶亚基p47的活动^phox降低由于其降低巨噬细胞磷酸化因为p66Shc击倒,导致减少ROS生产导致长寿p66Shc-deficient老鼠的延缓衰老的作用。类似于中性粒细胞衰老(19),增强巨噬细胞衰老导致炎症利基市场,显示为核易位NF -增加的结果κB和促炎细胞因子的生产。目前的研究表明,gp91的遗传操作^phox导致改变核NF -κB活动;这些结果与先前的报道13,18]。氧化应激和炎症通路已经被认为是协同几种发病机制有关。NADPH氧化酶的催化产品,ROS,扮演了一个重要的角色在细胞周期包括细胞生长的抑制或永存21,22]。senescence-associated分泌表型(SASP)控制的NF -κB是一个衰老细胞的特点(23]。例如,高水平的il - 1和il - 6可以引起ROS-mediated DNA损伤反应(DDR),从而导致细胞衰老24]。在当前的研究中,PAO1感染诱导巨噬细胞NADPH氧化酶gp91衰老^phox依赖性活动的方式。gp91的规定^phox表达直接影响巨噬细胞衰老状态。因此,NADPH oxidase-dependent PAO1感染巨噬细胞活性氧产量有所增加。gp91功能的丧失^phox的失活导致NF -κB在细胞核中p65亚基,gp91的过度^phox增加p65易位。这些过程可能看起来不太可能在不同的细胞调节分子,因为他们都是本地化隔间。此前报道,产生的ROS NADPH氧化酶类可以作为第二信使调控NF -κB激活(25,26]。活性氧对细胞生长中起着双重作用:细胞衰老凋亡或antiapoptosis-dependent NF -κB活动(21,22,27]。同时,在这项研究中,ROS作为第二信使gp91之间的活动^phox和NF -κB p65,活性氧抑制剂以来,南汽,部分封锁了巨噬细胞衰老和核NF -κB p65激活。综上所述,我们描述了一个监管机制介导PA侵染诱导巨噬细胞衰老NADPH氧化酶gp91之间通过互动^phox和NF -κB p65使用ROS作为第二信使。

NF -κB活动产生保护作用在防止对细胞凋亡的淋巴细胞凋亡因子的表达的直接监管,如Bcl-xL和c-IAP2,在脓毒症(28]。然而,过度的NF -κB亚基p65诱导细胞衰老通过基因组稳定性和DNA修复(29日,30.),而损失的p50 p65抑制异质二聚体,导致细胞的加速早产(31日]。这一现象表明NF -κB是参与细胞生长多方面地逮捕。最近,NF -κB及其相关炎性细胞因子被发现参与细胞衰老(32]。在最近的研究中,巨噬细胞衰老的状态是相关核NF -κB的活动。此外,炎性细胞因子水平的il - 6、TNFα后,il - 10改变巨噬细胞衰老的状态的变化,表明不同的巨噬细胞,分泌表型是由NF -κB的活动。综上所述,在PAO1-induced巨噬细胞衰老,NADPH氧化酶激活诱导活性氧的生产,这部分调节NF -κB激活及其下游细胞因子释放。

ROS和NF -的生产κ对抗病原体B-regulated炎性细胞因子至关重要;然而,这些介质的夸张的海拔可能引起组织损伤和细胞功能障碍。,巨噬细胞的吞噬能力降低和升高细菌感染和gp91超表达^phox巨噬细胞的吞噬作用减弱他们的能力。此外,细胞衰老恶化,在这种情况下,这可能是由于吞噬实验感染模型中进行使用前的珠子的标签。同时,最大吞噬之后,巨噬细胞的现象可能会稳定在严重的细菌感染。此外,以前的报告表明,在PA感染,巨噬细胞吞噬作用不依赖NF -的激活κB (33]。综上所述,造成细胞衰老PA感染巨噬细胞可能具有吞噬能力降低。这可能部分解释为什么细菌严重感染高负荷引起的高死亡率和发病率。虽然我们没有测试中巨噬细胞衰老的作用与PA感染动物模型,温家宝et al。利用一个PA肺部感染模型,证明了严重的症状和肺损伤的老鼠比岁年轻的老鼠。在他们的研究中,巨噬细胞浸润被推迟,在肺部分数量少岁比年轻鼠鼠PA感染后(34]。这些数据表明,细胞生长停止在巨噬细胞可能在老年人肺部感染鼠。然而,进一步的动物实验是必不可少的充实巨噬细胞衰老的影响在宿主防御PA感染。

总之,巨噬细胞操纵下高龄化PAO1感染。NADPH oxidase-ROS-NF -的交互κB通路参与在PA感染巨噬细胞衰老的过程。这些衰老引起巨噬细胞高细菌负荷表现出妥协的实验能力。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。81400011)和基础研究基金支持的中央大学(没有。20620140669)。