文摘
年龄相关性黄斑变性(AMD)影响视网膜黄斑和导致失明,和AMD失明和严重的视力损害的主要原因是中老年人。AMD的特点是布鲁赫膜的积累点和功能障碍的视网膜色素上皮(RPE)细胞和感光细胞。AMD的发病机制尚不清楚,也没有有效的治疗存在。越来越多的证据表明氧化应激中起关键作用RPE细胞变性和AMD。褪黑素是一种抗氧化剂进行清除自由基,抗炎,抗肿瘤,抗血管新生的影响。本研究调查了抗氧化、抗凋亡和自噬褪黑素对RPE细胞氧化损伤的影响。我们使用过氧化氢(H2O2)刺激活性氧的产生导致ARPE-19细胞系细胞凋亡。我们的研究结果显示,褪黑激素治疗显著地抑制H2O2全身的RPE细胞损伤,减少凋亡率,增加了线粒体膜电位,增加了自噬作用。此外,褪黑素减少了伯灵顿/ bcl - 2比例和凋亡蛋白的表达水平细胞色素c和半胱天冬酶7。此外,褪黑素调节autophagy-related蛋白的表达LC3-II Beclin-1和表达下调p62的表达。因此,褪黑激素对自噬和凋亡的影响可以防止H2O2全身的人类RPE细胞氧化损伤。褪黑素对人类RPE细胞可能有多个保护作用对H2O2全身的氧化损伤。
1。介绍
年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人失明的主要原因在发达国家1]。大约有5000万人体验AMD症状,1400万人视力受损,因为AMD (2];AMD的患病率也增加(3]。异常视网膜色素上皮(RPE)细胞引起AMD患者的视力丧失,和减损RPE细胞的正常生理功能的早期发病机制AMD (4]。
越来越多的证据表明,氧化应激在AMD (RPE退化起着至关重要的作用5]。RPE细胞特别容易受到氧化应激引起的活性氧(ROS) (6)如超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧和过氧化氢(H2O2)[7,8]。研究发现,一些抗氧化剂和zinc-containing补充剂可以抑制AMD发展和保护视力7,9]。因此,通过限制保护RPE细胞氧化应激可能代表一个有效的方法来减缓或扭转AMD患者的视力丧失。
在蜂窝系统中,活性氧对细胞有害的生存;然而,他们是至关重要的细胞信号传导和调节细胞增殖、迁移、分化和基因表达10,11]。抑制ROS-induced RPE细胞损伤可能抑制AMD发展(12,13]。过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是主要的酶保护RPE细胞通过表达增加了有效地清除活性氧和衰减氧化损伤(14,15]。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的产物,和它的表达通常是用作标记的脂质过氧化反应和氧化损伤16]。
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,病理细胞凋亡与AMD (17,18]。一项研究报道,凋亡bcl - 2家族蛋白和凋亡伯灵顿蛋白质扮演重要角色在mitochondrion-dependent外在和内在的细胞死亡通路(19,20.]。伯灵顿可以从线粒体细胞色素c的释放到胞质活性半胱天冬酶导致细胞凋亡(19,20.]。此外,半胱天冬酶7,伯灵顿,bcl - 2,在细胞凋亡和细胞色素c凋亡标记。
自噬清除受损的细胞器和蛋白质总量的RPE细胞,这是一个至关重要的功能,因为这些细胞暴露于氧化应激(21]。有研究报道,自噬发生在RPE细胞(22,23]。然而,RPE细胞的自噬可能导致的故障或损伤的积累aggregation-prone蛋白质,细胞变性,最后诱导的细胞死亡,所有这些已经与AMD的发病机制(21,23,24]。此外,研究表明,自噬活动的保护是至关重要的防止有害的细胞内积累的破坏分子(23]。然而,自噬途径是否对RPE细胞保护作用尚不清楚;此外,氧化应激之间的关系和RPE细胞自噬和他们的交互影响需要进一步澄清。
褪黑激素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)是一个tryptophan-derived神经激素执行关键功能在许多生理系统和流程的规定包括昼夜节律、免疫系统、心血管系统、和衰老过程25,26]。的一项研究提到,人接受250毫克褪黑激素每6小时25 - 30天没有毒性作用[27]。一项研究报道,尿褪黑激素的水平相对较低的AMD患者(28]。因此,研究褪黑素和AMD的影响之间的关系可能是建设性的。褪黑激素是主要由松果体合成和分泌25];然而,研究表明其他的来源,包括肠道,镜头,和视网膜(29日,30.]。褪黑素是一种强大的抗氧化剂,进行清除ROS、MDA降低,刺激的合成抗氧化酶(31日]。此外,褪黑素可以保护视网膜色素细胞培养(ARPE-19)缺血引起的氧化损伤和细胞死亡和H2O2(32,33]。褪黑素对细胞的保护作用对氧化应激可能源于其清除自由基和抗氧化防御机制的刺激的活动(34,35]。也可以激活褪黑素细胞膜受体MT1是,可以刺激生产的各种抗氧化的酶通过几个信号通路(34,36]。然而,背后的分子机制的影响褪黑激素在H2O2全身的氧化损伤和褪黑激素是否能诱导自噬通路提供保护对RPE细胞对损伤的影响尚不清楚。本研究的目的是调查是否褪黑素可以保护ARPE-19细胞H2O2全身的氧化损伤通过抗氧化、抗凋亡和自噬机制和分子机制探讨褪黑素对ARPE-19细胞的影响。
2。材料和方法
2.1。试剂和抗体
在这项研究中,3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),褪黑素,luzindole,多聚甲醛,牛血清白蛋白(BSA)、H2O2和碳酸氢钠取自Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。的细胞培养试剂购自Gibco(美国纽约大岛)。主apoptosis-related蛋白抗体(伯灵顿,bcl - 2, Cyt c, cleavage-caspase 7,和半胱天冬酶7)和autophagy-related蛋白质(LC3、Beclin-1 mTOR、p-mTOR ULK1,和p-ULK1)从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。从Abcam Anti-p62得到(英国剑桥)。Anti-GAPDH,β肌动蛋白,兔子/鼠标IgG-horseradish过氧化物酶抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。
2.2。细胞培养
ARPE-19人类RPE细胞行购买来自美国文化(美国)集合类型。细胞培养在杜尔贝科的修改鹰的中/火腿的F-12(美国康宁公司那里)补充10%胎牛血清,100μg / mL链霉素和100 U /毫升青霉素在37°C的大气中含有5%股份有限公司2。每3天的细胞通道一旦增长到大约90%汇合。
2.3。细胞生存能力分析
用MTT测定细胞存活率进行了测试。ARPE-19细胞被播种在96 -孔板的密度5×103细胞/ 24小时孵化的过程。细胞治疗与车辆(乙醇)或褪黑激素浓度表示48 h,然后他们接受300μM H2O2为24小时(34,37)(图S1)。luzindole(褪黑素受体拮抗剂)测试,前面详细的RPE细胞被播种。Luzindole添加到培养基在最后50浓度μ米(34]。一个小时之后,褪黑素被加入到培养基培养48 h, h2O2然后添加其次是培养24小时。使用MTT测定细胞生存能力评估。简单地说,培养基被移除,100μL的磷酸盐(PBS) MTT添加含0.5毫克/毫升、其次是孵化在37°C 3 h在黑暗中。接下来,晶体溶解了100μ二甲亚砜的L。的吸光度测量用一个时代微型板块分光光度计(美国VT BioTek)的测试波长570 nm波长630 nm的引用。提出了相对细胞生存能力的比例与褪黑素细胞治疗与治疗。
2.4。乳酸脱氢酶释放试验
通过细胞毒性测定乳酸脱氢酶(LDH) [38)使用商业LDH释放试验进行分析工具包(美国密歇根州开曼化学)。在这个试验,LDH减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) NADH,然后与一个特定的调查生产一个颜色(光密度max = 450海里)。
2.5。硫代巴比土Acid-Reactive物质测定
测量细胞内MDA水平,ARPE-19细胞在培养皿中10厘米(5×105细胞)24小时孵化过程。褪黑激素的细胞被添加到不同浓度48 h,之后他们暴露在h2O2(300μ米)24 h。硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS)通过比较吸收结果量化的标准曲线MDA等价物通过催化水解生成1,1,3,3-tetramethoxypropane。
2.6。细胞凋亡检测
细胞凋亡测定用FITC膜联蛋白V凋亡检测工具(美国富兰克林湖BD生物科学)。短暂治疗后,这些细胞被洗PBS和400年孵化μ包含2 L的绑定缓冲μL的膜联蛋白V-FITC和2μL (propidium碘在黑暗中在室温下15分钟。彩色样本然后FACSCalibur流式细胞仪分析,并使用CellQuest结果进行了分析。
2.7。ROS化验
活性氧产量决定使用一个2 ,7二乙酸-dichlorodihydrofluorescin (DCFH2- da)染色法测定(Abcam,剑桥,英国)。褪黑激素治疗后48 h, ARPE-19细胞孵化了20μM DCFH2在37°C - da 30分钟,然后添加到300年μM H2O24 h。然后ARPE-19细胞resuspended PBS和通过流式细胞术分析。fluorescence-positive细胞的百分比被记录在FACSCalibur流式细胞分析仪使用的激发和发射过滤器485和530海里,分别。
2.8。免疫印迹分析
确定它们的蛋白质浓度,ARPE-19细胞在免疫沉淀反应测定细胞溶解缓冲区包含磷酸酶抑制剂鸡尾酒平板电脑和蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。蛋白质浓度化验使用bicinchoninic酸测定工具包(T-Pro生物技术、新台北县、台湾)。量化蛋白质溶解产物(30μg)通过钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳分析,解决7% - -15%聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物膜。每个膜堵塞5% BSA分别为1.5 h和孵化与不同初级半胱天冬酶抗体7,cleavage-caspase 7,伯灵顿,bcl - 2, Cyt c, mTOR, p-mTOR (Ser2448) p-ULK1 (Ser757) ULK1, p62, LC3, Beclin-1 GAPDH和β肌动蛋白在一夜之间在4°C。洗了三次后Tween-20 Tris-buffered盐水和0.05% (TBST),膜与二次孵化antimouse或antirabbit抗体(1:10000;细胞信号技术、马、美国)在室温下1 h。使用发光图像分析仪检测的信号:Amersham成像仪600(美国通用电气医疗集团生命科学,MA)。信号强度使用ImageJ被量化。
2.9。免疫细胞化学
ARPE-19细胞被洗了三次与PBS和固定4%多聚甲醛在室温下30分钟。ARPE-19细胞然后用PBS和permeabilized PBS含有0.025% Triton x - 100 15分钟。细胞被封锁屏蔽解决方案(5% ( )在1 x TBST BSA)。阻塞后,antibodies-including anti-LC3和p62 1: 250 dilution-were应用,一夜之间细胞在4°C的环境。Alexa萤石594 -共轭兔子antimouse二级抗体制备在阻止缓冲区,其次是孵化ARPE-19细胞在室温下1 h。洗后,细胞被安装4 ,使用荧光显微镜6-diamidino-2-phenylindole-containing安装介质和分析。
MitoView 633是一个红光对于线粒体荧光染料,染色。染料膜渗透,变得明亮荧光在线粒体膜的积累。治疗后,中被删除和添加到prewarmed介质含有稀释MitoView 633。在含有稀释培养基中细胞颗粒状和resuspended MitoView 633。我们进行了测试染色浓度200海里。这些细胞被可视化使用蔡司LSM700共焦显微镜。
2.10。统计分析
每个实验至少重复三次重复的平均值计算,这个值是用于统计分析。并给出了数据意味着±标准差(SD)。统计分析使用单向方差分析(方差分析)分析,其次是图基的事后测试用于确定两组或多组之间的差异(GraphPad Prism 6.0;美国CA Systat软件)。统计学意义被选中 。
3所示。结果
3.1。褪黑激素保护ARPE-19细胞H2O2全身的氧化损伤
研究褪黑激素的细胞毒性效应和H2O2在培养的RPE细胞,这些细胞被暴露到50或者100μM褪黑激素48 h或不同浓度的h2O2(200、250、300、500μ米)24 h。这项研究的结果发表在数字1(一)和1 (b)。RPE细胞的生存能力评估使用MTT试验。如图1(一)褪黑激素在测试浓度(50和100μM)对ARPE-19细胞(图一般是安全的1(一))。治疗ARPE-19细胞H2O2减少RPE细胞生存能力是剂量依赖性的方式。暴露于300年μM H2O2诱导细胞生存能力损失大约50%(图1 (b))。因此,这个浓度(50和100μM褪黑激素;300年μM H2O2)被选为后续实验。ARPE-19细胞进一步受到褪黑激素(50和100μ米)24 h,然后被暴露于300年μM H2O2一个额外的24 h调查在ARPE-19褪黑素细胞的保护作用。统计上,褪黑激素显著衰减造成的减少ARPE-19可行性H2O2(图1 (c))。此外,为了评估褪黑素的保护作用2O2全身的氧化损伤,研究测量后ARPE-19细胞LDH释放褪黑激素预处理和H2O2曝光,结果表明,H2O2诱导治疗LDH释放,细胞毒性的指标,显著抑制褪黑激素预处理(图1 (d))。这些结果表明褪黑激素保护ARPE-19细胞H2O2全身的氧化损伤。
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3.2。Luzindole减少褪黑素对H RPE细胞的保护作用2O2损害
我们评估是否褪黑素的保护作用2O2通过褪黑素细胞膜受体全身的氧化损伤。接下来,细胞培养挑战有或没有luzindole,褪黑素膜受体拮抗剂,确定直接抗氧化剂与褪黑素受体介导的影响。Luzindole添加到培养基在最后50浓度μm .一个小时之后,褪黑素被加入到培养基培养48 h, h2O2然后添加其次是培养24小时。与300年ARPE-19细胞培养μM H2O2,50μM luzindole添加褪黑素之前,表现出显著降低生存能力与细胞仅褪黑激素治疗;luzindole封锁了褪黑素的保护作用(图1 (e))。
3.3。褪黑激素能抑制H2O2全身在ARPE-19细胞氧化应激
探讨褪黑素对MDA的影响形成,我们检查了使用TBARS测定脂质过氧化水平。治疗H2O2导致MDA水平显著增加,这是减少褪黑激素预处理(图1 (f))。如图2(一个)和2 (b)H2O2增加了活性氧水平ARPE-19细胞和褪黑素表现出显著的抑制作用在H2O2全身的活性氧产量。因此,褪黑素是抑制脂质过氧化和活性氧生成,和这可能占其保护作用。
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3.4。褪黑激素保护ARPE-19细胞H2O2全身的细胞凋亡
进一步调查是否褪黑素可防止H2O2全身的细胞死亡通过凋亡效应(ARPE-19细胞凋亡检测使用膜联蛋白V /π。如数据所示2 (c)和2 (d)PI-positive的比例(死)细胞表现出显著增加ARPE-19文化处理300μM H2O224 h仅与未经处理的控制文化。ARPE-19细胞培养的预处理50和100μ褪黑激素48 h在h2O2接触产生显著减少的比例PI-positive(死)细胞与文化暴露在H2O2一个人。预处理与褪黑素减少H2O2全身的细胞凋亡;都褪黑激素的浓度有显著影响(图2 (d))。因此,预处理与褪黑素可以保护ARPE-19细胞H2O2全身的细胞死亡。褪黑激素ARPE-19细胞凋亡的抑制作用是进一步证实了通过测试MitoView 633。如图3线粒体膜电位,增加300年ARPE-19细胞治疗μM H2O224 h仅与未经处理的控制文化。这个结果表明内在途径参与H2O2全身的凋亡细胞死亡。然而,ARPE-19细胞使用50和100μ褪黑激素48 h在h2O2暴露24 h展出增加线粒体膜电位与h2O2组。这个结果表明褪黑激素可以抑制H2O2全身的细胞凋亡在ARPE-19细胞。
凋亡蛋白的表达结果表明,50和100μM褪黑激素抑制H2O2全身的细胞凋亡蛋白酶7乳沟ARPE-19细胞(数字4(一)和4 (b))。我们还测量了bcl - 2蛋白的表达和伯灵顿,以确定H2O2和褪黑激素管理产生任何变化。伯灵顿/ bcl - 2 H后表现出显著增加比例2O2治疗与控制(数字4(一)和4 (c)),而褪黑激素达到统计上显著减少的H2O2增加全身的伯灵顿/ bcl - 2比例。伯灵顿/ bcl - 2比例的关键调节线粒体细胞色素c的释放。因此,我们评估的细胞色素c水平ARPE-19细胞的线粒体和细胞质。H2O2诱导细胞色素c含量显著增加细胞质减少它们的线粒体(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。相比之下,细胞质中的褪黑素细胞色素c水平降低与H2O2一个人。这些结果表明,褪黑激素保护ARPE-19细胞H2O2通过凋亡信号通路全身损害。
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3.5。褪黑激素激活自噬过程ARPE-19细胞
RPE细胞的保护作用可能与氧化应激可能涉及自我吞噬,这是主要的机制更新所有postmitotic细胞的胞质部分;我们因此检测自噬的影响。LC3处理是经典的自噬标记和转换的比例从LC3-I LC3-II与自噬体形成的程度密切相关。我们评估的表达LC3-II自噬标记。在数据5(一个)- - - - - -5 (c),这是表明预处理50和100μ褪黑激素48 h在h2O2暴露的24小时ARPE-19细胞的表达增加LC3-II LC3-II / LC3-I比率,从而提供证据表明褪黑激素增强了自噬过程h2O2对待ARPE-19细胞。在cotreated H2O2和褪黑素组,LC3-II水平表现出统计上显著的增加与H2O2治疗组(图5 (b))。此外,Beclin-1在自噬体的形成也起着重要的作用,因此认为自噬小体的自噬激活的标志。我们评估Beclin-1的表达。Beclin-1水平表现出显著降低细胞处理300μM H2O2。细胞与H cotreated2O2和褪黑激素Beclin-1水平体现出统计上显著的增加与H2O2治疗细胞(数据5(一个)和5 (d))。作为显示在图5(一个),褪黑素表达下调autophagy-related蛋白的表达p62表达式。褪黑激素引起显著降低p62水平与对照组相比的数字5 (e)和5 (f))。如图5 (g),治疗与此同时减少mTOR磷酸化。细胞与H cotreated2O2和褪黑素表现出显著降低mTOR磷酸化水平相比,H2O2处理细胞。然而,褪黑激素没有造成显著降低ULK-1磷酸化水平相比,H2O2治疗细胞(图5 (h))。这些发现表明褪黑激素预处理可以提高ARPE-19的自噬过程,降低H2O2全身的细胞死亡。
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(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
越来越多的证据表明,RPE细胞的氧化应激是AMD的病理生理学的一个至关重要的方面(39]。因此,研究专注于设计方法保护RPE细胞免受氧化应激作为AMD的治疗选项。暴露在H2O2作为公共模型转达RPE细胞的氧化应激敏感性和抗氧化活性(16,32,34]。丰富的天然产品,尤其是黄酮类化合物,赋予适应性生存通过抑制氧化应激反应在各种不利环境条件下(40][41,42]。在这项研究中,我们观察到的可行性ARPE-19细胞暴露在300年μM H2O2下降了大约30%,但褪黑激素预处理明显抑制H2O2全身的伤害和增加细胞的可行性。然而,MDA反映了RPE细胞的氧化损伤。因此,减缓进步和发展的早期AMD造成氧化损伤,它是至关重要的保护RPE细胞通过减少活性氧和MDA形成(43- - - - - -45]。目前的研究表明,暴露ARPE-19细胞H2O2导致增加活性氧和MDA生成,但这些影响被褪黑激素治疗显著改善。
先前的研究也报道,褪黑素的分泌水平下降随着年龄的增长,和一个特别明显的减少循环褪黑激素在AMD患者(28]。先前的研究表明,褪黑激素保护RPE细胞对蓝光和H2O2损害在体外和氧化应激(32,34,35]。褪黑激素是一个著名的抗氧化剂和内源活性氧清除剂和抗氧化能力高于其他抗氧化剂如维生素E (30.,46)也可能在不同类型的视网膜细胞保护作用包括RPE细胞和感光细胞(46]。在糖尿病的一项研究中,研究人员确定,内源性和外源性褪黑素可能会影响代谢紊乱不仅通过调节胰岛素分泌,而且通过提供防止活性氧(47]。在目前的工作,褪黑激素提供了保护2O2全身的活性氧。H2O2全身的RPE细胞凋亡是一个著名的药物发现研究模型16,48- - - - - -50]。在目前的工作,我们的研究结果表明,H2O2可以通过增加apoptosis-related导致细胞凋亡蛋白(伯灵顿,Cyt c,和半胱天冬酶7)在ARPE-19细胞,但是这个过程被褪黑素显著降低。这些结果表明,褪黑素可以防止H2O2刺激ARPE-19细胞细胞凋亡,这可能是密切相关的褪黑激素的抗凋亡和抗氧化效果。
小说和这项研究的重大发现之一是,褪黑激素可以降低H2O2通过自噬全身RPE的伤害。自噬的增加显著降低凋亡细胞毒性,这表明ROS-activated自噬cytoprotective对抗细胞凋亡(51]。自噬对RPE细胞的维持体内平衡是至关重要的,因为它消除了不正常的细胞器和蛋白质(52- - - - - -54]。消化不足,因为受损视网膜色素上皮细胞的自噬引起受损细胞器和毒性蛋白的积累,会引起RPE功能障碍和与AMD的发病机理有关55,56]。自噬是受多种信号通路,AMPK-mTOR途径之一的监管过程中起着重要的作用。自噬的mTOR信号是负的监管机构57]。LC3-I转换成LC3-II水平自噬活动可以作为指标。p62蛋白质是有选择地纳入自噬小体通过直接绑定到LC3-II自溶酶体有效地降解。因此,总p62表达水平与自噬(负相关58]。Beclin-1行为在起始阶段的自噬形成隔离膜,一个吞噬细胞质的双层膜结构材料形成自噬体(58]。此前的一项研究表明,褪黑素的势函数在自噬调节氧化应激(59]。在这项研究中,我们确定,褪黑激素抑制mTOR和自噬增加标记(LC3-II和Beclin-1)一致,促进了自噬。这一发现意味着ROS监管ARPE-19细胞的自噬通过下调mTOR和移植LC3-II Beclin-1,增加力量的保护ARPE-19褪黑素细胞氧化应激细胞死亡。因此,褪黑素的吸收可能有利于保护RPE细胞H2O2全身的氧化损伤与视网膜疾病相关。
我们发现,褪黑激素介导的自噬和抑制H2O2全身的活性氧积累和ARPE-19细胞脂质过氧化反应,这也就解释了褪黑素对RPE细胞的重要保护作用。另外,我们发现这些影响褪黑激素被luzindole阻塞。因此,cytoprotection褪黑素可能与褪黑素受体介导的效果,这与以前的研究结果是一致的(34]。
5。结论
总之,褪黑激素对H有保护效应2O2全身的视网膜细胞死亡。褪黑激素能抑制H2O2全身的RPE细胞损伤,减少细胞凋亡率,增加线粒体膜电位,降低半胱天冬酶的激活和调节自噬通路ARPE-19细胞(图6)。这些发现对AMD有治疗的启示和相关的炎性疾病。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Chih-Chao Chang和黄Tien-Yi贡献了同样的工作。
确认
本研究支持由中国科技部(批准号。most106 - 2320 - b - 038 - 064 my3 most103 - 2313 - b - 038 - 003 my3和nsc102 - 2313 - b - 038 - 001)和农业委员会,台湾,中华民国(批准号106 as-16.4.1-st-a4)。
补充材料
补充材料包含实验协议修改后的文章。图S1:实验协议ARPE-19细胞。(补充材料)