文摘
在果蝇Metal-induced毒性(黑腹果蝇)是一种建立模型研究神经毒性和神经退行性疾病。植物化学物质,特别是生物碱,具有神经保护已报告。在这里,我们评估了从非洲Jointfir(保护作用的生物碱提取Gnetum africanum)叶锰- (Mn)诱导毒性在野生型果蝇。苍蝇被暴露于10毫米锰、锰的生物碱提取和cotreatment加上提取,分别。苍蝇的存活率和运动性能评估5天治疗后,此时的苍蝇是均质和化验乙酰胆碱酯酶(疼痛)活动,一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)水平。结果表明,提取显著恢复Mn-induced减少苍蝇的存活率和运动性能。此外,提取中和Mn-induced海拔在疼痛活动中,不,和ROS水平。非洲的生物碱提取Jointfir叶可能因此成为有用的植物化学物质的来源发展的新的治疗方法管理神经退化。
1。介绍
锰(Mn)是必不可少的在体内广泛的生化过程(1]。然而,暴露在过度的Mn通过,例如,职业意味着可以诱导神经退行性疾病的病理生理学特征类似于帕金森病(2]。神经退行性疾病是多种致病因素的病态;例子包括阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)。研究表明,这些疾病的特点是下降与大脑相关的神经递质,如乙酰胆碱和刺激神经组织的胺,以及氧化应激引起的大脑中金属离子的含量过高3]。它因此成为重要发展整体治疗方法预防和管理这些疾病的关注在不同的风险因素。胆碱能神经元的神经递质乙酰胆碱乙酰胆碱酯酶代谢的酶(4- - - - - -6]。因此,胆碱酯酶抑制剂,如加兰他敏和多奈哌齐已经用作广告(治疗干预6,7]。多年来,胆碱酯酶和单胺氧化酶抑制剂用于治疗方法来管理这些疾病。然而,这些干预措施,带来严重的负面影响。因此,补充/替代饮食/药物干预的重要性作为一个管理和预防方法在怎么强调都不为过。
果蝇(黑腹果蝇)获得了大量的使用作为生物医学研究的另一种动物模型,特别是对于解开一些人类疾病背后的分子机制。此外,研究表明,高达75%的人类致病基因是守恒的果蝇(8]。人类和果蝇基因组之间的相似性是不仅限于遗传成分还包括它们之间的关系,与众多的例子守恒的生物机制(9]。Metal-induced毒性的d .腹是一个建立模型研究神经毒性和神经退行性疾病。之前的研究使用金属,如铁、铝、铜、和锰诱导神经毒性神经退化的模型d .腹;铁、铜,Mn-induced毒性与帕金森病和帕金森症(10),而用于模型类似于病理学d .腹(11]。具体来说,的标志Mn-induced神经毒性d .腹包括减少寿命和运动性能,增加了活性氧生成,受损的胆碱能和doperminergic系统(12- - - - - -14]。
植物性生物活性植物化学物质茶多酚和生物碱等在这两方面都取得了可喜的神经保护电位在体外(15),在活的有机体内大鼠(16,17),果蝇模型(18,19]。绿叶蔬菜形成当地饮食的主要成分和植物生物活性植物化学物质的主要来源。他们期望不仅营养价值也在民间的药用特性报道。值得注意的是非洲Jointfir (Gnetum africanum)。非洲Jointfir (AFJ)是一个绿叶蔬菜所需的不同的非洲国家,特别是尼日利亚东南部(这是通常被称为“Okazi”)的营养和药用价值14,20.,21]。据报道,树叶丰富的生物碱植物化学物质(22),传统上用于治疗一些疾病,如发烧、溃疡和糖尿病(23]。树叶作为香料和消耗在制备汤和炖菜(24]。此外,hypolipidermic,高血糖的、抗炎和抗氧化性能的植物之前已经报道过(25,26]。因此,本研究评估背后的一些生化机制的保护属性生物碱提取对manganese-induced AFJ神经毒性模型d。
2。材料和方法
2.1。原油样品收集和提取生物碱化合物
非洲Jointfir新鲜样品(Gnetum africanum)叶子在阿库雷来自当地市场,(西南)尼日利亚,在雨季期间(5月)2017。样品被确认和验证的生物学,联邦理工大学,阿库雷,尼日利亚(身份证号码:腰布/生物/ 404)。树叶仔细分离,运行自来水下冲洗,干了二十天在室温下(阴影)恒重。粉样品之前一直在一个密封的容器中提取的生物碱。
2.2。试剂
化学试剂如acetylthiocholine碘、硫代巴比土酸对氨基苯磺酰胺,减少谷胱甘肽,DEPPD, DMSO, DPPH,三氯乙酸,乙酸钠是来自Sigma-Aldrich(现在默克公司,达姆施塔特,德国)。过氧化氢,甲醇、醋酸、盐酸、氯化铝、醋酸钾、钠十二烷基硫酸,硫酸铁(II),氯化锰、钾ferrycyanide和氯化铁是来自BDH化工有限公司(英国普尔)。除了表示,否则,所有的其他化学物质和试剂的分析成绩和水的玻璃蒸馏。
2.3。果蝇(黑腹果蝇)培养
野生型果蝇(应变)Harwich股票文化(来自国家物种股票中心(美国博林格林,哦))从果蝇实验室获得,生物化学,伊巴丹大学欧州。苍蝇维护和饲养在一个正常的饮食由玉米粉中含有1%w / v啤酒酵母和0.08%v / w作在室温下在12 h黑暗/光周期条件下的果蝇研究实验室,功能食品和营养食品部门,联邦理工大学,阿库雷、尼日利亚。所有的实验都是相同的d .腹压力。
2.4。生物碱提取制备
生物碱提取的样本准备根据Harborne的方法(27),用细微的修改(28]。这涉及到提取10 g的样品在100毫升的10% alcoholic-acetic酸为24小时。随后混合物过滤获得清晰的滤液。滤液集中在45°C真空旋转蒸发器(Laborota 4000高效、Heidolph、德国),这是NH紧随其后3哦,沉淀。收集沉淀为原油生物碱提取、干燥彻底45°C和存储在冰箱在4°C所有后续分析。提取获得的收益是95毫克/克干叶的非洲Jointfir样本。所有后续的提取溶解在1% DMSO溶液的分析。
2.5。体外分析
2.5.1。胆碱酯酶活性测定
生物碱提取的影响疼痛活动被修改后的评估Ellman比色法(29日]。135年的反应包括μL的蒸馏水,20μL 100毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH值8.0),20μL(10毫米DTNB,飞匀浆在0.1磷酸盐缓冲剂(pH值8.0)(有关详细信息,请参阅下面的组织匀浆制备),提取适当的稀释,20μL(8毫米acetylthiocholine碘作为引发剂。的反应是监控5分钟(每隔15秒)使用分光光度计412海里。消极的控制进行了分析,包括提取和匀浆,没有衬底。抑制比例之后疼痛活动表示为参考(匀浆疼痛活动没有提取)。
2.5.2。自由基清除能力
提取物清除自由基的能力利用DPPH模型评估的方法Gyamfi et al。30.正如之前报道的[31日在反应混合物组成的提取(0 - 1毫升)和1毫升的0.4毫米methanolic-DPPH解决方案。其次是潜伏在黑暗中30分钟,在516 nm和吸光度测定。自由基清除能力百分数表示的引用(反应混合物提取除外)。
2.5.3。铁螯合试验
提取对铁的螯合能力是决定使用的方法Puntel et al。32]。150年一个整除μL 500年μM FeSO4作为铁源反应了168μL 0.1 Tris-HCl (pH值7.4),218年μL盐水,提取(0-25μL)。5分钟的反应混合物是孵化前的13μL 0.25% 10-phenanthroline (w / v)。吸光度是随后在分光光度计测量510海里。的铁2 +螯合能力表示为参考的百分比(反应混合物提取除外)。
2.6。体内分析
2.6.1。实验设计
Harwich应变的d .腹(两种性别,3 - 5天)被分成5组包含50个苍蝇( )。组1是放置在一个正常的饮食(不含生物碱),组2 - 4被放置在一个包含10毫米Mn(采购MnCl饮食2)、锰+ AFJ生物碱提取(最终浓度为2.5毫克/克的饮食),分别和AFJ生物碱提取。苍蝇被暴露于这些治疗20天前在环境温度和维护用于不同的化验。Mn剂量的选择是基于生存初步研究(数据未显示),苍蝇被暴露于不同浓度的锰(2 - 10毫米)支持先前公布的数据(14]。初步研究确定的剂量AFJ提取选择和车辆(1% DMSO)显示死亡率没有显著的苍蝇(数据未显示)。
2.6.2。杀伤力的反应
苍蝇观察每天的死亡率、发病率和存活率是由计算死苍蝇的数量决定的,而幸存者转移到刚做好每周的饮食。数据随后被分析和绘制累计死亡率和比例的活苍蝇后,治疗期(13]。
2.6.3。通过负趋地性试验测量运动性能
负趋地性分析被用来评估苍蝇的运动性能(33]。总之,治疗期后五天,苍蝇从每组简要固定化在冰和转移到一个干净的管(直径11厘米长,3.5厘米)相应的标签。苍蝇最初允许恢复固定10分钟,之后在管子的底部了。观测所做苍蝇的总数,穿过6厘米线6 s记录一段时间内。结果表示为百分比的苍蝇,逃脱了超过6厘米的最小距离6 s在三个独立的实验。
2.6.4。制备组织匀浆
苍蝇被固定在冰和均质在0.1 M磷酸盐缓冲剂,pH值7.4。由此产生的匀浆离心机在10000×g在4°C 10分钟Kenxin冷冻离心机模型KX3400C (Kenxin Intl。香港)有限公司。随后,上层清液与颗粒分离成标签埃普多夫超小型电子管和用于各种生化指标。
2.7。生物分析
2.7.1。乙酰胆碱酯酶测定(疼痛)活动
疼痛活动化验的方法Ellman [34),用细微的修改。反应混合物是由195年μL的蒸馏水,20μL 100毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH值8.0),20μL DTNB 10毫米,5μL匀浆,20μL(8毫米acetylthiocholine(引发剂)。此后,反应是监控5分钟(每隔15秒)在412海里。计算之后疼痛活动和表达为mmolAcSch / h /毫克的蛋白质。
2.7.2。总活性氧(ROS)水平
总ROS水平在整个飞行组织匀浆被估计为H2O2根据以前报道的方法(相当于35),用细微的修改。反应混合物由50μ1400年组织匀浆,LμL(乙酸钠缓冲(pH值4.8),0.1和1000年μL(试剂6毫克/毫升DEPPD和4.37的混合物μ米的FeSO4溶解在乙酸钠缓冲(1:25)。37°C的反应是孵化为5分钟,其次是吸光度测量在505 nm分光光度计。ROS水平估计的H2O2标准校准曲线表示为单位/毫克蛋白1单位= 1毫克H2O2/ L。
2.7.3。测量一氧化氮(NO)
没有内容在整个飞行组织匀浆估计使用基于售后的试剂光度法的方法(36用细微的修改。简而言之,150年的反应混合物由μL(组织匀浆,50μL蒸馏水,600μ售后的试剂(0.1%的LN——(1-naphthyl)乙二胺盐酸盐,1%磺胺,2.5%磷酸)。其次是10分钟潜伏在黑暗中在室温和吸光度测量在540海里。亚硝酸盐和硝酸盐的浓度作为衡量硝酸钠没有水平确定的标准曲线,表示为μ摩尔NO /毫克的蛋白质。
第2.7.4。血清总蛋白测定
布拉德福德的方法(37)与牛血清白蛋白(BSA)为标准,被用来量化的总蛋白质含量飞匀浆。
2.8。gc - ms表征
定性描述分析可能的化合物存在于AFJ进行了采用气相色谱(使用扫描模式)之前报道(28用细微的修改。简单地说,一个整除的样本(500毫克)溶解在10毫升的甲醇。7890之后,分析了使用气相色谱仪与电子轰击源耦合到5975 c惰性质谱仪(安捷伦科技)。分离的化合物的固定相是HP-5MS毛细管柱涂以5%苯基甲基硅氧烷(30米长×0.25×0.32毫米直径μ膜厚度)(安捷伦科技)。使用的载气是氦的恒流1.0毫升/分钟的初始公称压力19.6 MPa和平均速度33.425厘米/秒。一个整除的样品(1μL)在离了注射模在注射温度为110°C。清除流是3毫升/分钟总流11.762毫升/分钟;气体保护模式开启。烤箱最初设定在110°C(2分钟),那么增加10°C /分钟到200°C(2分钟),那么5°C /分钟到280°C(9分钟)。运行时是38分钟,3分钟溶剂延迟。质谱仪是经营70年电子电离模式与电离能eV离子源温度为230°C,四极温度达到150°C,传输线温度为280°C。
分析之前,是自动调谐perfluorotributylamine女士(PFTBA)检查大量的使用已经建立的标准m / z69、219、502、和其他仪器优化和灵敏度条件。
分析验证是由运行复制样品为了看到组成复合名称的一致性,各自的保留时间和分子量。这些丰度的输出NIST 11图书馆搜索报告提取的成分。每个化合物鉴定通过NIST库搜索报告有一个相应的质谱显示大量的可能的无数m / z每个化合物的山峰。
2.9。数据分析
获得的数据被报道为均值的平均值±标准误差(SEM)和适当分析了使用单向方差分析(方差分析),后续图基的事后测试(水平的意义被接受 , ,和 )。所有统计分析进行了使用软件GraphPad棱镜(V.5.0)。
3所示。结果与讨论
在本研究中,我们评估了背后的机制的保护能力生物碱提取非洲Jointfir (AFJ)对manganese-induced神经毒性模型d .腹。这项研究显示,暴露的d .腹10毫米的Mn 20天显著( )减少果蝇存活率(数字1(一)- - - - - -1 (c))和运动性能(图2)。然而,cotreatment AFJ生物碱提取显著改善减少Mn-induced苍蝇的存活率和运动性能。先前的研究也报道,10毫米Mn的存活率和运动性能显著降低d .腹,这可能与Mn的细胞毒性效应(13]。我们的发现也同意早期的发现能力的植物生物碱提取物改善Mn-induced损伤的运动性能和存活率d .腹(14,38]。此外,它也被报道,植物生物碱提取物改善Mn-induced老鼠的神经毒性(39,40]。
(一)
(b)
(c)
我们的研究结果表明,AFJ表现出疼痛的抑制作用(在体外浓度依赖性(图)3 (b))也显著改善海拔引起的疼痛Mn的活动在活的有机体内在果蝇(图3(一个))。疼痛刺激水解乙酰胆碱乙酸胆碱,从而调节胆碱能神经元功能(7]。乙酰胆碱是一种神经递质调节认知功能至关重要,学习/记忆、运动机能和运动41]。神经毒性水平的Mn已报告损害相关的胆碱能系统Mn-induced运动机能障碍,运动,和认知功能障碍(41]。因此,本研究中说明的,疼痛的增加活动经过五天的接触锰与他们的攀爬能力显著下降。观察到的障碍在苍蝇的攀爬能力可以被关联到一个可用的乙酰胆碱生物利用度降低胆碱能神经传递(13,42]。这一现象已被报道为主要风险因素的开发和发展老年痴呆症(7]。此外,我们的研究结果与先前的报告,短期政府协议的Mn带来显著升高大鼠大脑疼痛活动(43,44]。另一项研究显示,暴露的老鼠Mn海拔引起的疼痛活动他们的血清和大脑45]。因此,AFJ生物碱提取的能力改善Mn-induced高架疼痛活动苍蝇,以及增加Mn-treated苍蝇的攀爬能力可以建议背后的机制之一,提取对Mn-induced毒性的保护作用。与之前的研究相一致,植物提取物的抗胆碱酯酶性质实质上与他们组成植物化学物质包括生物碱;生物碱提取展览胆碱酯酶抑制特性在体外(46,47]。Konrath等人报道,生物碱提取物Lycopodiaceae物种从南美表现出抗胆碱酯酶的活动在体外和在活的有机体内在大脑皮层、纹状体和海马后大鼠急性管理(48]。此外,植物的小檗碱等生物碱,咖啡因,evodiamine,异尖叶碱,四甲基吡嗪,葫芦巴碱也有报告称,显示各实验模型神经保护属性,往往与他们的抗胆碱酯酶,抗氧化,抗炎作用[49- - - - - -54]。因此,AFJ生物碱提取物也提出了一个有效的神经保护生物碱的来源。一般来说,植物生物碱被提升为神经退行性疾病的药物先导物的管理由于其治疗机制包括抗胆碱酯酶的属性(55]。
(一)
(b)
早些时候的发现涉及氧化应激在Mn-induced神经毒性(13,56,57]。氧化应激,ROS过载的结果不能有效地抵消了抗氧化防御机制,因此,启动细胞损伤(58,59]。在生理系统中,抗氧化酶包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶参与预防自由基过载和顺向氧化应激。这项研究的结果表明,果蝇接触锰表现出显著升高(图ROS水平4(一)),这是氧化应激的指标。这是在协议与早些时候报告海拔ROS水平后Mn-induced毒性果蝇(13,60,61年]。然而,cotreatment AFJ生物碱提取显著改善ROS水平Mn-intoxicate苍蝇。这个观察可以与AFJ提取物的抗氧化性能可以进一步证实的DPPH自由基清除和铁2 +螯合能力(图4 (b))。DPPH清除能力和铁2 +螯合是两个常见化验进行评估测试化合物的抗氧化潜力。以前的研究表明,植物生物碱提取物表现出抗氧化性能与他们相关联的神经保护电位(62年]。的铁2 +在这项研究中提取的螯合能力可能是重要的治疗的重要性;首先,过度积累的铁2 +可能引发链氧化还原反应特别是芬顿反应可以启动细胞毒性ROS的生成。其次,化学相似性锰和铁表明,锰的神经毒性效应是由与铁竞争“nonredox”域蛋白(63年]。因此,治疗与铁螯合能力显示代理承诺改善Mn-induced毒性(41]。
(一)
(b)
这项研究还表明,锰能够显著提升苍蝇(图没有水平5)。这类似于先前的研究报道,Mn-induced毒性引起的高程在老鼠大脑大脑皮层(没有水平2]。一氧化氮是一种扩散性的信号分子在脊椎动物和昆虫的神经系统64年]。在d .腹,没有被证明调解在细胞增殖和分化飞发展阶段(65年,66年]。没有还在免疫反应介导的苍蝇病原体和寄生虫(67年,68年]。一般,没有报道作为促炎介质中没有被诱导合成一氧化氮合酶(间接宾语)显著升高(69年]。因此,AFJ生物碱提取的能力显著改善Mn-induced高程水平苍蝇无法显示其潜在的抗炎特性。在图6和表1,gc - ms表征的结果,提出了可能的化合物的分子结构和提取测定;然而这需要进一步的研究充分说明精确的结构组成成分生物碱的提取进行进一步的药理研究。
结论因此可以从本研究生物碱提取AFJ能够防止manganese-induced毒性的机制包括减少氧化应激,抑制疼痛活动和促炎介质不,并随之增加,登山和运动活动黑腹果蝇。因此,AFJ生物碱提取能代表小说的神经来源的化合物。
缩写
| 疼痛: | 乙酰胆碱酯酶 |
| AFJ: | 非洲Jointfir |
| 广告: | 阿尔茨海默病 |
| DEPPD: | N, N二乙基-帕拉苯二胺 |
| DPPH: | 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| 没有: | 一氧化氮 |
| 帕金森病: | 帕金森病 |
| ROS: | 活性氧物种。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究由世界科学院(TWAS)格兰特没有:16 - 500 RG /车/ AF / AC_G - FR3240293300。