文摘
淀粉样原纤维形成是所有蛋白质的共同财产;因此,模型可以用于研究蛋白质这一过程。我们测量蛋白质聚合模型amyloid-forming stefin B的存在和缺乏一些抗氧化剂。stefin B总是诱导淀粉样原纤维形成的pH值TFE 5到10%,在室温下。抗氧化剂NAC的影响,维生素C,维生素E,和三个多酚类物质白藜芦醇,槲皮素和姜黄素原纤维形成的动力学遵循使用荧光。与此同时,聚集和纤维的形态和数量被透射电子显微镜(TEM)检查。抗氧化剂的浓度是不同的,这是观察到不同的行动模式应用在低或高的浓度相对于绑定常量。为了获得更多的洞察的可能模式绑定,南汽的对接,维生素C,所有三个多酚是stefin B的单体的形式完成的。
1。介绍
淀粉样蛋白的属性状态是通用的蛋白质(1- - - - - -3),而在序列上的细微差别和三维结构决定等形式倾向有序聚集(4,5]。尽管任何蛋白可以诱导形成淀粉样状态在体外,只有大约50 amyloidogenic蛋白质聚合在活的有机体内和导致疾病6,7]。最后导致蛋白质淀粉样原纤维的聚合,得到隔离成不同的包涵体,而最危险的证明可溶性低聚物,可能绑定和穿孔膜造成毒性。治疗神经退行性疾病,攻击的根源这一病理过程甚至治愈这种疾病,是急需的,由于老龄化。如何阻止异常蛋白质的过程的方式聚合在一个特定的点几个(8]。方法之一是支持本机状态稳定抗体,另一个是招聘伴护蛋白质或增加降解途径(9- - - - - -14]。然而,这些新的方法可能的早期治疗仍在调查在动物模型和临床试验。
氧化应激(OS)是神经退行性疾病的最重要特征之一(15]。众所周知,它修改蛋白质,导致他们的错误折叠和聚集。另一方面,蛋白质聚集绑定二价金属离子(Fe2 +和铜2 +),结合过氧化氢导致的形成活性氧(ROS) (16]。因此,神经保护,减少蛋白质总量或活性氧或两者似乎可行的药理目标(17]。然而,很少有有效的临床应用化合物已经开发成功的就更少了,因为他们的毒性和潜在的致癌性。天然抗氧化剂提供神经保护效应通过各种生物的行为,如清除自由基、交互与过渡金属,调制不同的酶和胞内信号通路的影响,和基因表达17]。一些流行病学研究表明,饮食富含抗氧化剂提供预防很多疾病,比如癌症、心脏病、高血压、神经退行性疾病和中风(17,18]。每个人都应该记住,治疗相对安全的天然多酚类物质的使用是有限的药物动力学。此外,这些化合物几乎不能通过血脑屏障,达到一个活跃的大脑中的浓度(17]。一些衍生品可能更好;例如,结果表明,金属配合物的姜黄素抑制淀粉样β蛋白更有说服力地颤动(Aβ)比母体化合物19]。
知道蛋白质聚合是一个共享的属性的所有蛋白质,蛋白质模型可以用来研究这个过程。我们学习了许多方面的低聚物和amyloid-like原纤维形成由人类stefin B (20.- - - - - -25]。在这里,我们使用这个系统来研究不同抗氧化物质对动力学的影响,产量和淀粉样原纤维形成的形态。在这项研究中,我们选择了维生素C (C)和E(维生素E),N乙酰半胱氨酸(NAC)和三个多酚:姜黄素(坏蛋),白藜芦醇(Res)、槲皮素(这位)(图1)。维生素C和E和南汽,以及多酚类化合物,减少活性氧的自由电子清除行动26]。然而,他们也可以直接与氢键网络或芳香族蛋白质残基相互作用,分别与影响蛋白质聚合(27,28]。
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NAC ((2 r) 2-acetamido-3-sulfanyl丙酸)(图1(一))已被证明是一个有效的前兆谷胱甘肽(GSH)生产,它是已知穿过血脑屏障(BBB) [29日]。它提供半胱氨酸、谷胱甘肽合成的病原反应底物。因此,它作为一种抗氧化剂通过增加谷胱甘肽水平,通过直接与自由基相互作用[29日]。它能够有效地破坏的fibrillogenesisβ肽已被报道(30.]。维生素C ((2 r) 2 - [(1) 1, 2-dihydroxyethyl] 3 4-dihydroxy-2H-furan-5-one)被认为是大脑中一个至关重要的抗氧化剂(图1 (b))[31日]。即一个巨大的证据表明维生素C可能改变神经系统疾病和作为一个潜在的治疗工具。细胞,它有助于维持几个关键流程,包括神经细胞成熟和分化,髓鞘的形成,儿茶酚胺的合成,调节神经传递,和抗氧化保护31日]。目标删除sodium-vitamin C转运蛋白在小鼠导致大面积脑出血和死亡(31日]。
多酚类物质是次要的植物代谢产物具有芳香环和一个或多个羟基与不同结构的复杂性(数字1 (c)- - - - - -1 (e))。最丰富的酚类化合物在植物包括类黄酮、黄酮醇、黄酮、异黄酮和花青素。白藜芦醇(3、5、40-trihydroxystilbene)(图1 (c))是一个丰富的多酚,植物抗毒素存在于红酒和葡萄。它有两个酚环连接由一个双键和有两个亚型反式白藜芦醇和独联体白藜芦醇。反式白藜芦醇被认为是负责法国悖论(32,33]。大量的证据显示了它对淀粉样纤维性颤动的影响过程(34- - - - - -37]。最常见的一种膳食多酚是黄酮醇槲皮素(2 - (3,4-dihydroxyphenyl) 3, 5, 7-trihydroxy-4H-chromen-4-one)(图1 (d))。槲皮素是广泛存在于苹果、茶、酸豆,洋葱。对淀粉样纤维性颤动的抑制活性已经被报道(38- - - - - -41]。姜黄素((1 e, 6 e) 1, 7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) hepta-1 6-diene-3, 5-dione)是一个黄色的色素存在于香料姜黄(lat。姜黄)(图1 (e))。根据6000多个引用,它已经与许多beneficient活动有关,如antiamyloidogenic,抗氧化,抗炎,抗肿瘤,抗病毒,抗菌42,43]。最重要的是,超过一百个临床研究与姜黄素进行了。搜索文献,姜黄素可以抑制淀粉样纤维性颤动的足总β(44,45朊蛋白[]46)、胰岛素(47),鸡蛋白(48),溶菌酶(49,50),而β乳球蛋白(51]。不幸的是,它的广泛应用是由于其药物动力学有限,剥夺其生物利用度。目前各种配方的姜黄素和正在进行的研究将帮助解决这个问题42]。
2。材料和方法
2.1。材料
在这项研究中,我们使用人工stefin B (stB wt)作为模型蛋白。这种重组蛋白半胱氨酸3 Ser所取代。2,2,2-Trifluoroethanol (TFE)购买的丙烯酰胺,Thioflavin T(阻)从奥尔德里奇,bis (sulfosuccinimidyl)辛二酸盐(BS3从热费希尔科学)。其他化学物质来自σ,卡洛•Erba美国赛瓦,默克公司。
2.2。表达和纯化
表达和净化已经被描述在其他地方(52]。简单地说,DNA结构变成了BL21 (DE3) pLysS应变大肠杆菌。与IPTG诱导表达(最终浓度1毫米)。感应三小时后,细胞分离介质和细胞溶解。表达式由sds - page电泳检查效率。另外细胞溶解产物纯化通过添加4%的聚乙烯亚胺(PEI)和重复离心。这种方式,大部分的污染物如核酸和大多数细菌(主要是酸性)蛋白质从溶解产物中删除。新加坡旅游局wt被亲和色谱法分离纯化细胞溶解产物羧甲基(CM) -papain-Sepharose。是非绑定材料筛选了0.01 Tris-HCl包含0.5 M氯化钠pH值8.0。wt stefin B是筛选了0.02茶缓冲pH值10.5。离子强度和pH值与强大的0.2磷酸盐缓冲剂,立即调整pH值7,与1 M氯化钠导致快速折叠。 Additional purification was done using SEC on Sephacryl S-200 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 0.01 M phosphate buffer, containing 0.12 M NaCl at pH 6.1. Purity was checked by SDS-PAGE electrophoresis.
2.3。ThT基金会荧光
染料是用来确定淀粉样原纤维的存在。荧光测量使用PerkinElmer模型LS-50B发光光谱仪。激励是设置为440 nm,光谱被记录从455纳米到600纳米。染料是溶解在磷酸缓冲(25毫米,0.1 M氯化钠在pH值7.5)15μ米( )。原纤维生长在温和的条件下在pH ~ 5 (0.015 M醋酸缓冲,0.15 M氯化钠在pH值4.8)在室温下;蛋白质浓度是34μm .为了加快形成原纤维,纤维性颤动混合物含有10% v / v TFE。50毫升的蛋白质溶液纤维增长了570μL年中缓冲区之前的测量。新的探测器是每天准备。荧光是衡量使用0.5厘米试管25°C。激发和发射缝被设定在5和7 nm,分别。数据收集每0.5海里。荧光强度与时间在482 nm绘制。每个测量至少进行两次重复,和提出了均值( )。盲人调查之后对每个抗氧化剂和减去最终值。
2.4。透射电子显微镜法
蛋白质样品(15μL (34μM蛋白溶液)应用于Formvar——碳涂层网格。3分钟后,样品被浸泡,沾1% (w / v)醋酸双氧铀。样本观察与飞利浦CM100(范、荷兰)透射电子显微镜操作在80千伏。图像记录使用Bioscan或ORIUS SC 200 CCD相机(Gatan Inc .,华盛顿,美国),使用DigitalMicrograph软件(Gatan Inc .,华盛顿,美国)。两条平行的网格为每个样本准备,至少有10个方格里被彻底检查,和许多显微图每个网格的拍摄。
2.5。分子对接
分子对接研究使用SwissDock服务器执行http://www.swissdock.ch/。SwissDock EADock DSS是基于对接软件,包含许多步骤的算法(53]。PDB文件提供的目标分子(机顶盒wt PDB id: 4 n6v)。链的蛋白质被选中时,水分子和离子被移除,氢原子被添加。一个统一的过程导致了许多预测每个选择的配体。绑定模式使用FullFitness得分和集群。集群然后使用FullFitness排名的元素。连续周期,最低的结构“FullFitness”和估计ΔG值选择收集和邻近的停靠配体结构作为代表。换句话说,只有配体蛋白的最低能量构象州许多生成绑定模式被认为是复杂的。绑定模式在JSmol可视化和PDB用于识别残留参与绑定。
2.6。ThT基金会荧光测量偏差
荧光测量是使用TECAN萨菲尔板读者(热费希尔科学)在96年井25°C。解的机顶盒wt的纤维在室温下没有孵化,存在不同的最终浓度的抗氧化剂。一个11.4倍体积的过剩是添加到每个荧光前阅读。对于每一个试验,抗氧化剂的荧光没有机顶盒wt与染料也被监控。激发波长是440海里,发射波长从455年到600海里。发射波长步长是1纳米,激发和发射带宽为7.5 nm。荧光强度在482 nm阅读。每个样本一式三份,和均值。
2.7。圆二色性
远紫外圆二色性(CD)光谱测量在室温下用圆二色性谱仪mos - 500(生物逻辑的造物九律科学仪器)。中描述的颤混合物准备部分2。3。蛋白质含量是34μ米( )。温度保持在25°C。1毫米石英试管是用于所有CD光谱。数据记录了从250年到200年与1 nm采样间隔。最后光谱的平均三个重复实验,和背景(样品的CD谱没有机顶盒wt和抗氧化剂)减去。
2.8。sds - page电泳和交联
纤维性颤动的机顶盒的混合物wt准备节中描述2。3。样本年龄在24小时内被应用sds - page凝胶使用标准的过程。确保不同高分子物种将保持稳定的SDS和高温,我们与BS进行交联3作为交联剂。制造商的指示后,50倍摩尔过剩的交联使用。机顶盒wt颤混合物在没有和交联的存在是用作控制。
2.9。测量稳态荧光猝灭
稳态荧光猝灭的测量机顶盒wt在不同浓度的饮料,也就是说,抗氧化剂,是使用TECAN萨菲尔板读者(热费希尔科学)在96年井25°C。蛋白质含量是34μ米,和抗氧化剂浓度是不同的。内在酪氨酸荧光测量了激动人心的蛋白质在277 nm,和发射光谱被记录在290到360纳米的范围。激发和发射狭缝宽度设置为7.5纳米,而发射波长步长设置为1纳米。每一个测量是一式三份完成的。分析了数据根据Stern-Volmer方程: 在哪里Fo和F荧光强度没有和饮料,也就是说,抗氧化剂,然后呢是Stern-Volmer猝灭常数。结合常数和结合位点是获得(2),这是一个修改Stern-Volmer方程: 在哪里缔合常数和吗n是结合位点的数量(54]。
3所示。结果
我们的研究的主要目的是评估的影响不同的抗氧化剂的颤概要模型protein-human stefin B(机顶盒)。因此,我们选择了三个多酚和两个化合物(图用一个更简单的结构1)。首先,他们影响淀粉样纤维性颤动的机顶盒之后使用荧光测量。这是一个通常的工具吗,荧光增加淀粉样原纤维的存在,因此通常是用来描述淀粉样纤维性颤动的抑制剂的反应。然而,预防措施是必须的,因为这可以猝灭荧光多酚化合物(55- - - - - -57]。作为一个辅助工具,TEM图像记录高原阶段的反应。在方法部分,所述每个样品2网格准备和许多图像每个观察获得的淀粉样原纤维产量的估计。TEM数据大多支持这荧光结果;然而,淬火时表示,我们测量了荧光的偏见(补充图S1)。此外,分子对接进行为了获得预测每个绑定模式的抗氧化剂。额外的数据关于绑定使用稳态荧光猝灭常数提供了测量和Stern-Volmer常数。二级结构的改变检查使用圆二色性。低聚物的状态决定使用sds - page电泳前交联。本节中描述的结果和分析讨论。的一部分结果提出和阐述了补充材料。
南汽和维生素C的浓度依赖性的结果对原纤维增长根据年中荧光收集数据2和3。在图2可以看出,南汽从1到6毫米浓度(平均摩尔比100:1 NAC蛋白质)促进蛋白质聚合,也就是说,它减少了滞后阶段。最后这荧光强度不会改变明显(图2);TEM显示也不影响最终产量或成熟的淀粉样原纤维(图的形态4 (b)显示4.0毫米NAC)。低浓度,即0.25毫米和0.5毫米南汽,抑制纤维生长,延长停滞阶段。
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在图3,可以看出,维生素C浓度在2.5毫米和4毫米也加速淀粉样原纤维形成的反应,也就是说,缩短了迟滞期,降低最终的成熟纤维根据荧光强度(图3)。这种荧光下降可能部分由于淬火效果TEM不会显示较低数量的成熟纤维在4毫米或2.5毫米(维生素C浓度数据4 (c)和4 (d))。在较低浓度,维生素C的行为类似于南汽;滞后阶段延长。显著地,维生素C在0.25毫米浓度抑制原纤维生长,延长停滞阶段(图3)和质量的降低纤维的聚合物通过TEM(图如图所示4 (e))。
我们也测量了维生素E溶解在乙醇的效果。没有显著影响,这种维生素的迟滞期或强度是观察(数据未显示)。原纤维没有抑制在这种情况下(TEM数据未显示)。
结果不同浓度的三种多酚类物质白藜芦醇,槲皮素和姜黄素荧光数据所示5- - - - - -7。白藜芦醇(图5对滞后阶段)显示无显著影响,而荧光强度稍微降低浓度的方式。然而,TEM数据(数据8(d)和9 (b)F-H)显示,更多的剩余总量,指着一个淬火效应(补充图S1)。槲皮素(图6)延长迟滞期;然而,这种效果是不如对姜黄素(图表示7)。有趣的是,当与其他抗氧化剂相比,槲皮素显示了不同的行为。根据TEM结果,更多的总量依然,在一些地区,原纤维看起来更非晶态(图8(e))。姜黄素影响停滞阶段(图7),它还减少了最后一年中最荧光。然而,这种观察可能是由于强烈的猝灭效应(补充图S1)。为了评估纤维的最终数量的差异在某些姜黄素的浓度,我们必须依靠TEM(数字8(f)和9 (b)a - c)。这种方法并不意味着测试纤维定量的数量;许多网格必须观察,直到可以估计有效统计数量。尽管如此,它使我们能够估计的影响不同的抗氧化剂对最终产量和聚合物的形态,和之间的关系形式。
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我们也测量了三种多酚的抗氧化剂的浓度依赖性,也就是说,Res,这位,坏蛋,反映在年中荧光测量机顶盒颤动(图的停滞阶段9(一个)比TEM(图)9 (b))。可以看出,这荧光强度成反比的浓度,即荧光降低,抗氧化剂的浓度增加(图9(一个))。这位和坏蛋法案同样,最低浓度的抗氧化剂并不影响淀粉样纤维性颤动,或者影响小的1μ坏蛋,而浓度高荧光强度的减少造成的。然而,这种效果更加明显的坏蛋(图9(一个))。TEM图像部分反映这些结果(图9 (b))。根据TEM结果,最后纤维量更高浓度的坏蛋(图的存在9 (b)C)低于低浓度(图的存在9 (b))。这位是特定(图的影响9 (b)、D和E)和许多总量都明显的浓度。控制相比,纤维短和厚,出现粘当坏蛋或者这位存在。TEM Res部分数据支持这荧光结果(图9 (b),F-H);100年的抑制作用μ50 M Res是更明显的μ研究》的200μM Res,更多的纤维是可见的。
CD光谱在远紫外区域没有显示任何二级结构的重大改变机顶盒wt样本年龄在24小时给予抗氧化剂的浓度(补充图S2)。为了确定低聚物的状态,颤混合物受到FPLC分析Superdex 75和交联前应用sds - page凝胶。FPLC洗脱概要文件不能作为一个可靠的结果,因为严重的蛋白质聚合的不同抗氧化剂(数据未显示)。然而,sds - page电泳后交联与BS3表明,抗氧化剂的平衡转移到更高的形式,如四聚体和更高的低聚物(补充图吗S3。四聚体和更高的寡聚物都标有一个箭头)。根据凝胶,当蛋白质暴露于抗氧化剂,有更多的二聚体,比的控制(补充图S3)。
分子对接研究提供了预测的绑定模式为每个抗氧化(图10)。由于SwissDock,可以获得对接预测JSmol和绑定参数基于机顶盒的PDB插入代码和具体结构的抗氧化剂。数据库是用来确定氨基酸残基参与特定protein-ligand交互(补充表S1)。有趣的是,每个抗氧化剂的程序提供了许多预测变异除了姜黄素;这种抗氧化剂每次被定位在同一个口袋(图10(e),补充表S1)。这个观察结果支持内在酪氨酸荧光测量(补充数据S4E和S5B, D)。补充图S4E表明酪氨酸荧光强度明显降低浓度的方式,和Stern-Volmer情节和绑定常量表明,姜黄素结合更紧密地比其他抗氧化剂研究(补充图S5B, D)。
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4所示。讨论
蛋白自组装成淀粉样原纤维状态的特点是大量的使人衰弱的疾病(2]。众所周知,自然的有机染料,例如,刚果红,紧密结合蛋白质,从而阻止他们的自组装。这和其他分子的能力,防止淀粉积累产生了巨大的兴趣,阐明其关键结构特性有助于抑制能力(34,58,59]。很明显,更好地理解结构活性关系将有利于建立新的蛋白质聚集抑制剂。反过来,这些见解可能破译淀粉样纤维性颤动的关键要素的关键难题。因此,本研究的主要目的是了解此时所选化合物影响蛋白质聚合反应和结构特征的化合物可以解释他们的antiamyloid活动对我们的模型protein-human stefin B。
认为一些多酚类化合物可能会干扰蛋白质聚合并不新鲜。到目前为止,众所周知,配体干扰淀粉样原纤维平面,平面分子与取代芳香结束团体(60]。首次提到可以追溯到2004年,当时作者小野等人研究了姜黄素的影响和rosmarinic酸(RA)的形成、扩展和不稳定的β第1 - 40()和足总β(1-42)[61年]。坏蛋和RA剂量依赖性抑制β形成从β第1 - 40()和一个β(1-42),以及它们的扩展。此外,他们存在剂量依赖的相关性不稳定的β年代(61年]。此外,2006年Porat等人提出了一个附加机制Cur行动28]。到那时,多酚抗氧化剂的抑制机制大多已经被认为是由于他们的抗氧化性能。考虑,多酚能够抑制淀粉样原纤维形成在体外在视图的结构相似性,这些作者提出额外的作用机制。他们建议结构性限制和特定芳香交互都是重要的抑制淀粉样原纤维形成的因为它们提供适当的定位的多酚抑制剂amyloidogenic核心。
我们的研究旨在展示各种抗氧化动力学上的物质的影响,产量和淀粉样原纤维的形态形成的人类stefin B在体外。我们相信,它模仿其他类似系统。跟随淀粉样原纤维的数量,荧光测量是使用。这是一个通常的工具吗,荧光增加淀粉样原纤维的存在,因此可以用来描述淀粉样纤维性颤动的抑制剂的反应。然而,这种分析可以通过外源性化合物的存在偏见,在我们的案例中多酚、南汽、维生素c有干扰的三个研究多酚类物质的荧光强度(55]。在这项研究中,作者表明,当涉及到量化的淀粉样原纤维形成的多酚类物质,荧光进行解释时应特别谨慎。换句话说,这些化合物可以显著偏差这荧光由于淬火效应(55]。因此,我们已经检查了淬火每个选择抗氧化的性质。补充图S1显示每个化合物作为饮料的荧光。然而,结果由TEM和滞后时间的差异在这荧光仍然有效评估这些化合物的抑制作用对淀粉样原纤维蛋白聚合,因此值得讨论。
年中荧光测量没有发现任何重大减少强度在不同浓度的NAC添加到新加坡旅游局颤混合物。TEM图像同样没有任何明显差异的最终产量和形态学机顶盒纤维(图2和4 (b))。另一方面,滞后阶段不同浓度的方式,也就是说,更高的浓度已经缩短了滞后阶段,而低浓度长期(图2)。显著地,可以观察到类似的行为模式在服用维生素C(图3),这可能可以解释为他们的重大影响amyloidogenic核心的微环境。这个观察不是由于pH值变化,因为在我们的手中,抗氧化剂并没有改变博士此外,电泳技术可以帮助确定低聚物大小在颤混合物(62年]。在我们的研究中,sds - page电泳后交联已经表明,抗氧化剂南汽和C平衡转向更高形式如四聚体和低聚物(图S3;四聚体的分子质量~ 44 kDa标有箭头和更高的低聚物)。类似的观察已经被其他作者(63年,64年]。根据凝胶,有更多的二聚体(分子质量~ 22 kDa,标有箭头)比的控制(图S3)。更高的寡聚物出现只有当蛋白质暴露在非常高浓度的抗氧化剂,在我们的例子中(图2.5毫米和6毫米服用维生素CS3道6和7)和2.5毫米和6毫米NAC(图S3道9和10)。值得注意的是,南汽和C的最高浓度降低迟滞期长度(数字2和3)。
如果我们比较数据的影响维生素C的淀粉样原纤维形成β乳球蛋白(27),观察到类似的抑制作用。维生素C抑制stefin B的原纤维形成的浓度从0.25毫米到0.5毫米,以延长停滞阶段(图3),并通过减少纤维的最终数量,根据TEM(图4 (e))。注意,这可能是倾向于淬火效果;因此,应该仔细分析低荧光是否确实意味着较低数量的纤维(55]。维生素C浓度高于0.5毫米(图3)降低迟滞期,促进聚合,类似于南京。最后这荧光较低而出现TEM显示了一个类似的纤维(数据4 (c)和4 (d))。在这里,这种差异可以解释为一个严重的淬火效果最好吗,荧光。李等人解释了通过其干扰抑制作用的维生素C - h组的氢原子β单支柱(27]。具体而言,代谢物的维生素C,水溶液中生成,如脱氢抗坏血酸和抗坏血酸盐离子,可以保护之间的静电相互作用β表由于其特定的相互作用而导致破坏β片叠加。这种机制与抗氧化作用不同,通常认为是维生素C的主要机制的行动。甚至报告说,它可以减少淀粉样斑块负担在皮层和海马测试老鼠杂交(65年]。在我们的研究中,这是再一次证实,服用维生素C有潜力作为antiamyloid物质。然而,在更高的浓度可能更有益,因为它增加了大多数毒性更高的低聚物。
三个多酚各不同。姜黄素的浓度抑制淀粉样原纤维形成(图7)。低浓度的影响会更大一些的延长迟滞期;然而,最后纤维出现更高的质量。在50的浓度μM,姜黄素延长迟滞期和减少的数量成熟的纤维。原纤维的形态和数量在50岁μM坏蛋被和TEM图检查8与姜黄素(f),一个不能忽视淬火效果;因此,TEM结果更相关,使用荧光。TEM图中的数据8(f)证实姜黄素在50岁μ抑制纤维生长。显著地,效果是浓度模式:在较低的浓度,如1所示μM Cur,纤维越来越长,而50岁μM Cur纤维更短和更少的(图9 (b)a - c)。白藜芦醇不减少停滞阶段(图5)。这显然降低了纤维的最终收益(图5),但没有证实了TEM(图8(d))。槲皮素(图略延长滞后阶段6)。然而,生产总量比原纤维可以看到通过TEM(数字8(e)和9 (b),D和E)。
对接研究可以为我们提供重要的信息,是一种非常有用的工具,了解流行的蛋白质和配体之间的绑定模式。为了调查可能的交互模式和确定最稳定的复杂stefin B之间,选择抗氧化剂,使用(图执行SwissDock对接10)。对接调查每个配体提供了大约100个不同的变体,免费的结合能与最低的值被选中(补充表S1)。有趣的是,不同的职位有不同的ΔG值提出了对于每个配体除了姜黄素,这是每一次定位以类似的方式和整体ΔG价值最低,(图10)。相比其他配体包括在这项研究中,姜黄素具有特定的化学支架(图1 (e));它包含两个取代芳香组对称受短碳水化合物链。更多讨论为什么姜黄素可能是最强的粘合剂是补充材料。
为支持数据对接研究,补充图S4显示每一个化合物也充当一个冷却器的酪氨酸荧光。观察到的荧光强度的降低表明每一个配体结合附近的酪氨酸残留物看做他们接近的酪氨酸残基结合的过程中,其荧光强度降低。Stefin B是一种multityrosine蛋白,因为它有三个酪氨酸残基(Tyr53, Tyr85, Tyr97)。因此,首先,它可能是一个复杂的任务澄清酪氨酸为配体可以访问。然而,这个问题可以使用对接预测和解决人类stefin B使用x射线衍射结构获得。更多的信息关于氨基酸残基参与绑定补充表中给出S1。
最后,在这项研究中,我们研究了5种不同的抗氧化化合物的作用的淀粉样纤维性颤动stefin b。我们的结果大多是与其他类似的研究,表明抗氧化剂与平面芳香结构,以及维生素C和NAC可以与聚合的蛋白质和交互抑制淀粉样原纤维形成的不同阶段。当前的研究强调,部分证实了抗氧化化合物的可能性也可以打击有毒寡聚物的形成和淀粉样原纤维。然而,他们的ROS清除效应不容忽视。考虑到蛋白质错误折叠和聚集导致许多退行性疾病,未来的研究是必要的。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
谋求Hasanbašić和阿尔玛Jahić同样这项工作。
确认
这项工作是由双边BiH-Slovenia格兰特(BI-BA / 16-17-007)为首的塞尔玛Berbić(波黑)和伊娃Žerovnik(斯洛文尼亚)和程序p1 - 0140 b . Turk为首的“蛋白质水解及其监管”(斯洛文尼亚卢布尔雅那)。谋求通过CMEPIUS Hasanbašić被奖学金的学生交流Jožef Stefan国际研究生院,斯洛文尼亚卢布尔雅那。
补充材料
图S1: Res的影响,这位,坏蛋和C在原位实时荧光。的CD光谱图S2:机顶盒wt总成24小时没有出现50岁μM >图S3: sds - page的机顶盒wt总成年龄24小时没有和不同浓度的抗氧化剂的存在;样品除了那些巷1之前交联sds - page。表S1:分子对接参数antioxidant-protein交互。表S2:计算化学和物理性质https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/。图S4:稳态荧光猝灭的测量机顶盒wt在不同浓度的饮料,也就是抗氧化剂。图S5: Stern-Volmer情节和修改Stern-Volmer块antioxidant-protein复合物的荧光猝灭常数。(补充材料)