文摘

polyphenol-enriched一部分(PEF)Acalypha wilkesiana的叶子一直在传统上用于治疗不同的疾病,研究抗炎效应和分子机制通过脂多糖(LPS)——264.7原始刺激巨噬细胞和对乙酰氨基酚(APAP即)诱导肝损伤小鼠模型。结果表明,脉动电场显著减毒LPS-induced一氧化氮(NO)和前列腺素E₂(铂族元素₂)生产和抑制诱导一氧化氮合酶的表达(间接宾语)和环氧合酶(cox - 2)在原始264.7巨噬细胞。PEF也减少促炎细胞因子的分泌,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、白介素- 1 (IL)β264.7、il - 6在LPS-stimulated原始巨噬细胞。此外,PEF强有力地抑制LPS-induced增殖的磷酸化蛋白激酶(MAPKs)以及核转录因子的激活κB (NF-κB)通过防止退化抑制剂κB -α(IκB -α)。体内,PEF预处理改善APAP-induced肝损伤和肝发炎,提出的降低肝损伤指标和促炎的因素在等离子体和基因水平。此外,PEF预处理明显减少toll样受体3 (TLR3)和TLR4表达和随后的MAPKs和NF -κB激活。高效液相色谱分析表明,两个主要的多酚类化合物在PEF geraniin corilagin。这些结果表明,脉动电场有抗炎作用,及其分子机制可能参与的失活TLR / MAPK / NF -κB信号通路,暗示PEF炎症性疾病的治疗潜力。

1。介绍

炎症,这被认为是发挥着至关重要的作用在身体的免疫防御系统,功能消除细胞损伤的初始原因和清除坏死细胞和组织损伤从最初的侮辱和炎症过程1]。然而,hypernomic或异常炎症反应和处理可能会导致一系列的疾病,例如心血管疾病、神经退化和癌症(2]。因此,它是非常重要的开发有效的代理inflammatory-mediated疾病的治疗。

LPS-activated巨噬细胞作为行之有效的实验模型,评估各种合成或自然的抗炎活动派生制剂体外(3,4]。巨噬细胞扮演着一个关键的角色在宿主防御机制,以应对感染或损伤和调节炎症和免疫系统直接或间接地(5]。冗余的炎症介质(没有和铂族元素₂)和促炎细胞因子(TNF -α,il - 1β和il - 6)由激活巨噬细胞被认为是至关重要的原因急性炎症反应以及慢性炎性疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、炎症性肠病(6,7]。基因表达的细胞因子和炎症蛋白质如伊诺和cox - 2在很大程度上是依赖于激活的转录因子NF -κB (8,9]。NF -κB,控制DNA转录,蛋白质复杂的细胞因子的生产,和细胞生存,起着至关重要的作用在调节免疫反应10]。如果条件下,NF -κB被绑定到我隐藏在细胞质中κB -α。NF -的激活κB是由signal-induced磷酸化的激酶叫我κB激酶(IKK),进而促进我的ubiquitin-dependent退化κB -α,导致的核易位NF -κNF - b,激活κB结合专门κB网站在目标基因的启动子区域和增强炎症介质的表达和促炎细胞因子(11]。MAPKs,丝氨酸/苏氨酸激酶家族与炎症相关的过程,也称调节NF -的激活κB和随后的炎症介质的表达和促炎细胞因子(12,13]。因此,合成或自然衍生化合物抑制NF -的激活κB和MAPKs可以考虑和发展作为炎性疾病的潜在治疗药物(14]。

APAP即是一种广泛使用止痛/药物在治疗剂量很少有副作用。然而,在一个非常高剂量,APAP即会导致严重的肝坏死,甚至暴发性急性肝衰竭。发病机理的主要机械的见解APAP-induced肝毒性被认为是多余的高毒性和活性代谢物积累N-acetyl-p-benzoquinone亚胺(NAPQI),耗尽细胞谷胱甘肽(GSH),导致严重的氧化应激和小叶中心的坏死(15,16]。虽然有毒代谢物APAP即占主要的肝损害,越来越多的证据表明,肝脏的先天免疫细胞的激活和随后的下游参与炎症介质和促炎细胞因子加剧损伤(17]。显然表明,早期肝细胞坏死引起的有毒代谢物APAP即会导致几个单元格内容的泄漏包括热休克蛋白(休克),核和线粒体DNA片段,和其他人共同称为有关分子模式(抑制),直接绑定并激活toll样受体(通常)前哨细胞如巨噬细胞和树突细胞。激活前哨细胞引起大量炎症介质的释放促炎细胞因子和招募单核细胞和中性粒细胞进入肝脏,最终加重初始损伤和肝细胞坏死(18- - - - - -20.]。通常,类的模式识别受体识别结构保守分子来源于微生物,扮演了一个重要的角色在炎症的分子机制,尤其是TLR4 [21]。TLR4是已知主要调制器在炎症反应的发病机制涉及药物引起的急性肝损伤(22,23]。众多报道表明TLR4调节炎症反应主要是通过几个胞内信号通路的刺激,包括NF -κB、MAPKs和磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K) /蛋白激酶B(一种蛋白激酶)途径10,24]。因此,抑制TLR / MAPK / NF -κB信号通路可能是一个治疗策略来减轻APAP-induced肝毒素的效果。

近年来,有一个越来越浓的兴趣发现天然产物从植物材料特别是传统草药被认为是无害的,不受有毒副作用(25]。人们普遍认为天然产品,丰富的生物活性化合物的来源,可以是有益的膳食补充剂和治疗药物开发候选人(26,27]。多酚类化合物(pc)如酚酸和类黄酮的药用功能,引起了越来越多的关注健康的好处包括抗氧化和消炎作用[28,29日]。Acalypha wilkesiana属于大戟科(大戟科),是一个医学和观赏植物广泛分布在世界各地,特别是在非洲的热带地区。的叶子答:wilkesiana曾在民间药物用于治疗许多疾病(30.,31日]。之前的植物化学的分析表明了生物碱的存在,丹宁酸,常用药用、倍半萜类化合物和多酚答:wilkesiana提取,证明有镇痛、解热、抗菌、抗炎活动(32,33]。然而,我们所知,没有科学研究可用来描述其抗炎活性的分子机制和什么样的化合物有关。

因此,本研究的目的是评估polyphenol-enriched一部分的抗炎效果答:wilkesiana通过使用LPS-stimulated生264.7巨噬细胞和一个APAP-induced肝损伤小鼠模型,探索其行动的潜在可能的监管机制。此外,PEF的主要成分是识别和量化的反相高效液相色谱法(rp)更好地理解生物活性化合物负责其抗炎和王亚南效果。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

有限合伙人,NG-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),苏木精,和伊红从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国);PrimeScript™RT主混合和SYBR绿色主购买从豆类混合生物技术(中国大连)。寡核苷酸被Sangon合成生物技术(上海,中国)。APAP即是购自Sangon生物技术(上海,中国)。化验用品的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和髓过氧化物酶(MPO)购自南京建成生物技术研究所(中国南京)。一氧化氮测定设备和核和胞质蛋白提取设备买来Beyotime生物技术研究所(上海,中国)。试剂盒,杜尔贝科修改鹰的介质(看看),胎牛血清的边后卫,青霉素,链霉素从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。其他化学药品和试剂都是分析品位和商业应用。

2.2。植物材料、提取和制备过程

的叶子答:wilkesiana由副教授中宁林从福建省农业科学院农业生态研究所。脱水和叶粉答:wilkesiana(700克)提取与去离子水的7000毫升100°C 1 h。过滤过的汤,然后集中由一个旋转真空蒸发器(Eyela、东京、日本)在55°C水浴水提取物,当时resuspended在水和命名为我们。我们再次过滤,然后添加到Diaion HP-20树脂(1.3公斤,三菱化学、东京、日本)列(8厘米×50厘米id),这是进一步洗先后有两个柱体积的水和75%乙醇水溶液给两个分数。水部分含有糖、蛋白质和盐被任命为WF。多酚是保留,然后用75%乙醇水溶液筛选了负担EtOH分数,指定为脉动电场。每个分数集中,冻干,然后储存在4°C进行进一步分析。WF的收益率和PEF分别为17.4 g和20.4 g,分别。

2.3。总多酚和总黄酮类化合物的测定

总酚含量测定为微克的没食子酸提取的等价物(GAE)每毫克(μg GAE / mg提取)Folin-Ciocalteu方法如前所述34]。总之,整除的样品或标准的解决方案(0.5毫升)和0.5毫升Folin-Ciocalteu试剂反应,允许为2分钟。然后,0.5毫升的10%碳酸钠(Na₂有限公司₃)解决方案和3.5毫升蒸馏水被添加并混合在一起。解决方案被蒙在鼓里2 h。吸光度测量标(分子器件、桑尼维尔CA)在760海里。总酚含量计算GAE从校准曲线。数据表示为一式三份的平均值分析。

总类黄酮含量测定的微克每毫克的提取芦丁等价物(重新)(μg RE / mg提取)使用修改后的比色方法如前所述34]。短暂,整除的样品或标准的解决方案(0.5毫升)与0.1毫升的5%亚硝酸钠混合(NaNO₂)解决方案。4分钟后,氯化铝(AlCl 0.1毫升的10%₃反应)的解决方案,允许添加了另一个4分钟。然后,0.3毫升的4%氢氧化钠(氢氧化钠)的解决方案是添加到混合物和调整到5毫升60%乙醇彻底混合紧随其后。反应是保持10分钟。吸光度是决定在510海里。总类黄酮含量的计算是根据校准曲线。数据表示为一式三份的平均值分析。

2.4。测量不,铂族元素₂肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6

生264.7巨噬细胞培养在96孔板的初始密度2×10⁴细胞/坚持一夜之间和孵化与样品(我们、WF、或PEF)从10到200人μg / mL或L-NAME(1毫米)2 h,然后有或没有LPS刺激(1μ24 h g / mL);的剂量选择根据先前的研究植物提取物对LPS-stimulated生264.7巨噬细胞的影响(4,35- - - - - -37]。培养介质收集,利用离心力分离,然后储存在−80°C到测试。培养介质中的亚硝酸盐浓度的测量作为一个指标没有生产,由一氧化氮测定工具包(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)根据制造商的指示。简单地说,50μL与100年培养介质的混合μL格里斯试剂,然后,亚硝酸盐浓度为540 nm源自NaNO从标准曲线₂。铂族元素的水平₂培养介质中量化的商业酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(研发系统、明尼阿波利斯、MN)和肿瘤坏死因子-水平α,il - 1β,il - 6在培养中量化的ELISA试剂盒(ABclonal生物技术、武汉、中国)根据制造商的指示。

2.5。细胞培养和可行性分析

生264.7巨噬细胞是购自中国科学院上海细胞库(上海,中国)。细胞在DMEM培养补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂纯度的浓缩铀的气氛。MTT比色细胞生存能力分析(38]。总之,细胞被播种到96孔板的初始密度2×10⁴细胞/坚持一夜之间和孵化与样品(我们、WF、或PEF)从10到200人μg / mL或L-NAME(1毫米)2 h,然后有或没有LPS刺激(1μg / mL) 24 h。然后,10μL 5毫克/毫升MTT添加到每个,紧随其后的是一个额外的4 h孵化。培养中被移除,甲瓒晶体于150年解散μL DMSO溶液。甲瓒解决方案的吸光度测量在490海里。细胞生存能力表示为一个相对未经处理的控制细胞的百分比。

2.6。制备胞质及核提取物

生264.7巨噬细胞在最初被播种密度5×10⁶细胞每60毫米盘和孵化过夜。细胞用脉动电场预处理(10、100和200μg / mL) 2 h,然后刺激有或没有有限合伙人(1μg / mL)为0.5 h。在提取之前,细胞收获和冰冷的PBS缓冲液洗一次,然后,胞质及核提取物是由使用核和胞质蛋白提取工具包(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)根据制造商的指示。

2.7。动物和实验设计

共40个雄性C57BL / 6小鼠,6 - 8周大,购买实验动物中心,厦门大学(厦门,中国)。老鼠维持免费的水和食物在动物间恒温的房间22±2°C和12 h光暗周期。动物和实验方法的使用是符合美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南。所有的努力都是尽量减少痛苦和减少使用动物。小鼠随机分为5组(每组8老鼠)。PEF是管理intragastrically在100、200和400毫克/公斤体重每天一次连续7天;的剂量选择基于以前的研究植物提取物对药物引起的肝损伤小鼠模型的影响(25,39- - - - - -41]。老鼠从控制和APAP-intoxicated组也考虑到相同体积的车辆连续7天。最后政府,两个小时后,老鼠APAP-intoxicated集团和PEF-protective集团的管理intragastrically单剂量为500毫克/公斤体重APAP即,和对照组的小鼠都被赋予了一项单一的车辆34]。老鼠牺牲收集血液样本和肝脏组织后6 h APAP即治疗。

血液样本在10000×g离心液在4°C血清收集,然后保持在−80°C,直到被用于生物分析。肝组织立即收集,放在冰冷的PBS缓冲,然后切成块。一半是由4%的多聚甲醛固定的组织病理学分析,和另一半瞬间冷冻在液氮和存储−80°C进行进一步分析。

2.8。测量血清的生化参数

血清活动ALT、AST、LDH和MPO测量通过使用相应的商业工具(南京建成生物技术研究所、南京、中国)根据制造商的指示。血清肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6是量化的ELISA试剂盒(ABclonal生物技术、武汉、中国)根据制造商的指示。

2.9。组织病理学分析

肝脏组织在4%多聚甲醛固定,脱水,然后嵌入在熔融石蜡(25]。部分5μm厚度被苏木精和伊红染色显微镜())来监控组织学变化。

2.10。提取总RNA,反转录,实时定量PCR分析

从细胞或肝组织总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),然后,1μ克总RNA用于逆转录利用PrimeScript RT大师混合(豆类生物技术、大连、中国)根据制造商的指示。实时定量PCR分析是由罗氏LightCycler®480系统(罗氏集团、瑞士)使用SYBR绿色主人混合(豆类生物技术、大连、中国)指的是协议。PCR引物用于特定基因列出如下:伊诺:(5-CAACCAGTATTATGGCTCCT-3和反向5-GTGACAGCCCGGTCTTTCCA-3),cox - 2: 5(向前-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3和反向5-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3)、肿瘤坏死因子-α(前5-AGCCGATGGGTTGTACCTTG-3和反向5-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3),il - 1β(前5-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3和反向5-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3),il - 6: 5(向前-GAGTGGCTAAGGACCAAGACC-3和反向5-AACGCACTAGGTTTGCCGA-3),向前MCP-1:(5-ATGCAGTTAACGCCCCACTC-3和反向5-CCCATTCCTTCTTGGGGTCA-3),MIP-1α(前5-TGAATGCCTGAGAGTCTTGG-3和反向5-TTGGCAGCAAACAGCTTATC-3),TLR3:(5-CCTCCAACTGTCTACCAGTTCC-3和反向5-GCCTGGCTAAGTTATTGTGC-3),TLR4:(5-GGTGTGAAATTGAGACAATTGA-3和反向5-GTTTCCTGTCAGTACCAAGGTTG-3),GAPDH:(5-AAACGGCTACCACATCCAAG-3和反向5-CCTCCAATGGATCCTCGTTA-3)。Thermocycler条件包括初始变性在94°C 3分钟,40变性的周期为30秒94°C,退火60°C,持续30秒,30秒和扩展在72°C,紧随其后的是一个2分钟的扩展在72°C。GAPDH是作为内部控制规范化。基于Comparative-Ct相对mRNA表达水平计算方法(2^−ΔΔCt方法)。

2.11。免疫印迹分析

免疫印迹分析如前所述[34]。短暂,总蛋白质从细胞中提取或冻结的肝组织和蛋白质浓度测定。然后,整除的蛋白质(20 - 40μg)是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(微孔Corp . Billerica,妈,美国)。膜被封锁的5%牛血清白蛋白(BSA) Tris-buffered盐水与渐变20 (TBST)在室温下1 h,然后孵化1:1000稀释各种主要在5% BSA抗体TBST一夜之间在4°C。抗体间接宾语(13120)、IKKα(11930)、IKKβ(8943),phospho-IKKα/β(2697),NF -κB p65 (8242), phospho-NF -κB p65(3033),我κB -α(4814),phospho-IκB -α(2859)、物(9252),phospho-JNK (4668), ERK1/2 (4695), phospho-ERK1/2 (4370), p38 (8690), phospho-p38(4511),和GAPDH(2118)从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA),抗体TLR3 (ab62566)和TLR4 (ab13556)从Abcam购买(英国剑桥)和抗体cox - 2 (A1253)从ABclonal购买生物技术(武汉,中国)。细胞膜与TBST洗了三次,然后用辣根peroxidase-conjugated二次孵化兔免疫球蛋白抗体(7074)或老鼠免疫球蛋白(7076)(1:5000稀释为每个)从杰克逊ImmunoResearch购买实验室(美国西树林,PA)在室温下1 h。与TBST三洗后,免疫反应性的蛋白质使用SuperSignal西部Pico可视化工具包(美国热费希尔科学皮尔斯,IL)根据制造商的指示,然后在使用成像ChemiDoc™XRS +系统(Bio-Rad、钙、美国)。

2.12。分离、鉴定和测定PEF的主要组件

PEF的冻干粉再溶解在20%甲醇,然后受到ODS (50μ米,YMC有限公司、日本京都)柱层析洗脱含水甲醇为20%。洗脱液集中由一个旋转真空蒸发器在40°C水浴,然后被重复半制备的反相高效液相色谱法纯化YMC Triart C18柱(10×250毫米,5μm, YMC有限公司,京都,日本)与40%含水乙醇产量化合物1(15毫克)和复合2(10.8毫克),分别。1和2的结构¹核磁共振,¹³女士的理化性质,分析。1和2的纯度分别为96.2%和94.7%,分别根据面积归一化法。两个孤立的1和2被用作参考标准。化合物1和2在PEF量化使用高效液相色谱方法。高效液相色谱使用的设备是一个安捷伦1260系列高效液相色谱系统配备一个二极管阵列检测器,一个autosampler,开放实验室cd chemstation工作站(美国安捷伦)。分析进行一个Eclipse加列(3.5μm, 100毫米×4.6毫米id、美国安捷伦科技)从5%使用梯度洗脱B(乙腈)到80%(水含有0.1%甲酸)在35分钟1.0毫升/分钟的流量。检测是在280海里。所有的分离进行了25°C。PEF的冻干粉末溶解在50%甲醇浓度为0.61毫克/毫升。所有样品和移动0.45过滤阶段μm膜滤器(微孔),然后脱气前超声波浴使用。识别的1和2的色谱仪PEF进行通过比较他们的保留时间()与标准确定。每个校准曲线的线性回归方程建立了策划的每个标准化合物注射量与平均峰面积。1和2的定量数据从各自的标准曲线计算。

2.13。统计分析

结果表示为平均值±标准偏差(SD),和所有化验进行至少一式三份。是由使用SPSS 20.0统计分析软件(美国SPSS,芝加哥,IL)。测试所有值为正态分布和方差相等。均质差异确认时,数据分析通过单向方差分析(方差分析),其次是Turkey-Kramer测试进行事后分析。是由学生的其他统计评估以及。差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。总酚和总类黄酮含量不同答:wilkesiana提取

我们总酚含量、WF、PEF使用Folin-Ciocalteu测定方法。如表所示1,我们、WF、PEF包含261.1±2.5,87±3.1,661.4±5.2μ分别g GAE / mg提取。也获得了类似的调查结果从我们的总类黄酮含量的测定、WF、PEF,显示为152.6±3.8,38±3.5,306.5±7.5μ分别g RE / mg提取。定量分析表明,PEF包含总酚醛树脂和总类黄酮的含量最高,暗示PEF polyphenol-enriched分数。

3.2。的影响不同答:wilkesiana提取物的生产

人们普遍认识到,NO-inhibitory效应是一个重要的指标来评估抗炎剂的有效性(14,42]。因此,不同的影响答:wilkesiana提取原始LPS-stimulated没有生产264.7巨噬细胞决定。L-NAME,伊诺的抑制剂调节没有生产,作为一个积极的控制。如图1(一),没有生产,测量作为培养介质亚硝酸盐浓度,显著增加了有限合伙人的治疗比未经处理的控制细胞。然而,上述改变明显缓解了PEF预处理以及L-NAME预处理,而其他测试提取显示无显著减少。进一步的细胞毒性分析表明,无论PEF, L-NAME或其他测试提取没有影响的可行性原始巨噬细胞(图264.71 (b)),这意味着减少生产可能不是由于PEF的细胞毒性效应。这些体外数据显示抗炎PEF的潜力。因此,我们关注PEF在随后的细胞和动物实验。

3.3。脉动电场对炎症介质的产生的影响(没有和铂族元素₂)

PEF LPS-stimulated生产没有的效果和铂族元素₂进一步确定。我们可以看到数据2(一个)和2 (b)PEF预处理明显抑制生产的和铂族元素₂LPS引起的治疗剂量依赖性的方式。图2 (c)表明,PEF没有任何细胞毒性在10 - 200的浓度μ克/毫升。这些结果清楚地表明,PEF LPS-induced没有抑制作用和铂族元素₂生产可能不是由于细胞毒性的影响。

3.4。脉动电场对伊诺和cox - 2的表达

伊诺和cox - 2酶中扮演至关重要的角色的合成和铂族元素₂分别在炎症(43]。因此,伊诺和cox - 2的蛋白表达是决定LPS-stimulated生264.7中巨噬细胞的免疫印迹分析。如图3(一个)、PEF预处理明显抑制LPS-induced伊诺和cox - 2蛋白表达方式存在剂量依赖的相关性。也观察到类似的结果伊诺的mRNA水平测定和cox - 2(图3 (b))。这些结果表明,PEF-mediated抑制和铂族元素₂生产的差别可能是由于对这些伊诺和cox - 2的基因。

3.5。脉动电场对促炎细胞因子(TNF -的生产α,il - 1β和il - 6)

大量研究表明,肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6,三个著名的和早期分泌促炎细胞因子,参与了急性期反应和全身炎症(4,44]。根据图中给出的elisa4生264.7巨噬细胞处理有限合伙人显示严重的炎症反应,表现的显著增加的上述促炎细胞因子水平。然而,这些归纳有效地扭转了PEF预处理方式存在剂量依赖的相关性。这些数据强烈支持的治疗潜力PEF调节炎性反应。

3.6。脉动电场对NF -的激活κB

先前的报告得出的结论是,NF -κB是一个关键的转录因子调节促炎细胞因子表达和调节炎症反应(14,45]。评估是否激活NF -κB被PEF预处理抑制LPS-stimulated生264.7巨噬细胞,核易位的NF -κB / p65亚基被免疫印迹分析检查。如图5(一个),仅与LPS刺激后,在细胞核中p65显著增加;然而,LPS-induced易位p65从胞质细胞核明显抑制了PEF预处理方式存在剂量依赖的相关性。进一步评估潜在的分子机制,PEF IKK的LPS-stimulated磷酸化的抑制效果α/βNF -κB,我κB -α以及我的退化κB -α也调查,这表明NF -的激活吗κb .正如预期的那样,LPS-induced这些信号分子的磷酸化被PEF预处理明显抑制。此外,有限合伙人治疗引起的突出的我κB -α降解而未经处理的控制细胞;然而,PEF预处理明显恢复我的蛋白质水平κB -α(图5 (b))。这些结果表明,抑制炎症介质脉动电场对生产的影响和促炎细胞因子的失活是由于NF -κB在LPS-stimulated生264.7巨噬细胞。

3.7。PEF MAPKs的磷酸化的影响

已是不争的磷酸化MAPKs在激活NF -中扮演重要的角色κB在LPS-stimulated巨噬细胞(46,47]。获得更好的理解底层机制,三个MAPKs包括细胞外signal-regulated激酶的磷酸化(ERK1/2) c-Jun n端激酶(物),和p38被免疫印迹检测分析。提出了图6,LPS-induced ERK的磷酸化、物和p38被PEF预处理有效抑制,表明脉动电场施加抗炎效应部分通过衰减MAPKs刺激的磷酸化有限合伙人的待遇。

3.8。脉动电场对APAP-Induced肝损伤的影响

据报道,政府的过度剂量APAP即老鼠可能会导致严重的肝细胞坏死,急性肝损伤。APAP-induced早期激活先天免疫细胞和肝细胞坏死引起的肝脏炎症,进而影响的严重性APAP-induced肝毒性(48]。PEF的抗炎效果的观察在前面的实验中,我们进一步研究了PEF的王亚南APAP-induced肝损伤。提出了图7,老鼠接受APAP即(500毫克/公斤体重)显示严重肝毒素的效果突出的证据增加血清ALT和LDH的活动,这是与早期的研究一致(7,22]。然而,PEF预处理(100、200和400毫克/公斤体重)连续7天前APAP即政府显示出剂量依赖性还原效应对这些APAP-caused增加。类似的结果是获得MPO活性的测定,另一个重要指标,反映了损伤和炎症的程度(49]。进一步组织病理学分析提供了支持证据生化参数分析(图8)。正常组织结构提出了一种典型的肝细胞架构在未经治疗的对照组。的部分肝脏样本APAP-intoxicated老鼠暴露出大量的组织学变化,表现为严重的肝细胞变性和坏死,胞质空泡形成,炎症细胞浸润。有趣的是,PEF预处理明显改善这些APAP-induced损伤小鼠的肝脏中。这些数据表明,PEF防止APAP-induced急性肝损伤。

3.9。脉动电场对APAP-Induced肝脏炎症的影响

评估PEF APAP-induced肝脏炎症的影响,血清浓度和mRNA水平的几个促炎的因素进行调查。根据elisa和rt - pcr分析,APAP即政府显著增加的TNF -水平α,il - 1β,il - 6与未经处理的对照组相比,表明严重的炎症反应APAP-intoxicated老鼠的肝脏。然而,这些异常增加明显抑制了PEF预处理(图9和图S1)。的mRNA水平单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α),两个广义促炎趋化因子积极参与炎症反应和免疫细胞吸引到的炎症,也决定,这提出了一个极端的结果一致性(图S1)。这些结果表明,PEF缓解APAP-induced肝损伤通过抑制促炎因子的表达。

3.10。脉动电场效应通常APAP-Induced激活,MAPKs, NF -κB

越来越多的证据表明CCl APAP即或通常的表达增加₄醉酒小鼠肝脏(22,23]。此前报道,APAP即政府显然诱导TLR3和TLR4的表达水平与未经处理的对照组相比,而脉动电场预处理明显抑制这些海拔(数字10 ()和10 (b)),暗示表达下调NF -κB-mediated炎性级联。因此,MAPKs和NF -的激活状态κ进一步调查。正如所料,MAPKs磷酸化和NF -的激活κB显著抑制了PEF预处理(图10 ()),结果是密切与前面LPS-stimulated生264.7巨噬细胞中观察到的。综上所述,这些体内结果表明,PEF防止APAP-induced肝毒性和肝脏炎症可能通过失活TLR / MAPK / NF -κB信号通路。

3.11。识别和定量测定PEF的主要组件

为了更好地理解相关的主要成分PEF的活动,主要的多酚类化合物,1和2,被ODS柱层析法纯化和半制备的反相高效液相色谱法。识别这两种纯化化合物通过光谱技术和比较光谱数据与以前公布的数据50,51]。他们的结构被确定为corilagin(1)和geraniin(2)。最后,1和2是由高效液相色谱定量分析。色谱图的标准和PEF解决方案如图11和定量数据如表所示S1,这表明geraniin (286.1μg / mg)在PEF主要多酚化合物,其次是corilagin (54.2μg /毫克)。

4所示。讨论和结论

天然多酚类化合物,丰富了水果,蔬菜和谷物,吸引了广泛的关注,由于他们的药用价值25,28,29日]。通过文献检索,我们发现很少有报告连接抗炎和王亚南的多酚成分的影响答:wilkesiana并揭示了潜在的分子机制。在这项研究中,一个polyphenol-enriched分数(PEF),分级的汤答:wilkesiana通过柱层析法Diaion HP-20树脂,被发现有效地抑制LPS-stimulated炎症反应在原始264.7巨噬细胞以及肝炎症APAP-induced通过抑制肝损伤小鼠的TLR / MAPK / NF -κB信号通路。此外,我们发现geraniin corilagin,两个主要的多酚类化合物存在于PEF,是负责任的,至少在某种程度上,PEF的抗炎效果。我们的研究结果提供了一个更好的理解的积极总酚和类黄酮含量之间的关系答:wilkesiana及其抗炎和王亚南活动。

LPS-stimulated生264.7巨噬细胞产生过度的炎症介质和促炎细胞因子和作为实验方便模型来评估候选药物的抗炎活性(3,4,44]。在目前的研究中,我们发现,原料的预处理和PEF(200 264.7巨噬细胞μg / mL)没有显著地抑制和铂族元素₂生产伊诺和cox - 2基因的差别,对这些基因的转录水平(数字2和3)。此外,PEF也显示抑制LPS-induced TNF -α,il - 1β,il - 6生产原始巨噬细胞(图264.74)。这些数据表明PEF的抗炎作用及其治疗炎性疾病的潜力。PEF的抑制作用APAP-induced肝损伤和肝炎症假说提供了支持证据。众所周知,增加活动的ALT、AST、LDH酶是诊断肝细胞损伤的指标(45,52]。与早期的研究一致,血清活动ALT、AST、LDH和APAP即政府后显著增加,而这些海拔下降了PEF预处理(100 - 400毫克/公斤体重)(图7),这表明PEF APAP即可以保护肝细胞免受毒性作用。组织病理学分析提供视觉王亚南的证据PEF,所体现的恢复对histomorphological变化(图8)。尽管广泛承认的毒性药物代谢的氧化应激在APAP-induced肝损伤中起着至关重要的作用,人们越来越意识到浸润炎症细胞和炎症也可能与发病机理(17,18,53- - - - - -55]。越来越多的证据表明,急性APAP即中毒的循环水平增加许多促炎细胞因子(56- - - - - -58]。在我们的研究中,APAP即政府诱导突出生产几个促炎因子在等离子体和mRNA水平;然而,PEF预处理明显逆转这些变化(图9和图S1)。还应该指出,MPO是另一个生物标志物指示炎症细胞的浸润,尤其是中性粒细胞组织,通常被视为一种急性肝损伤,肝脏的压力,或未知的炎症刺激(49,59]。在这里,APAP即管理导致MPO活性显著增加;然而,PEF预处理可以明显争议这个增加(图7)。在此基础上,建议PEF可以减弱APAP-induced肝脏炎症和随之而来的急性肝损伤。

NF -κB是一个关键的转录因子参与细胞的炎症反应。如果条件,NF -κB是隐藏在细胞质的灭活与我互动形式κB -α。刺激时,细胞外的刺激,激活IKKs引起我的磷酸化和随后的退化κB -α然后促进NF -核易位κB,最终导致促炎基因的转录10- - - - - -12]。在这个工作中,PEF预处理能有效地抑制NF - LPS-induced核易位κB / p65单元(图5(一个)),表明NF -的失活κb .此外,免疫印迹分析显示,IKK的磷酸化α/β,我κB -α和NF -κ我和退化κB -α由有限合伙人或APAP即也逆转了PEF预处理(数据5 (b)和10 (b)),支持NF的失活κ由PEF B。从这些数据,很可能PEF-mediated抑制LPS或APAP-induced炎症介质和促炎因子表达的抑制作用主要归功于PEF NF -κB通路。

NF -κB也受各种细胞激酶激活,尤其是MAPKs,一个家庭的丝氨酸/苏氨酸激酶主要包括物、ERK1/2和p38。越来越多的证据表明,激活MAPKs参与炎症介质的产生和促炎细胞因子以及通过NF -伊诺和cox - 2的表达κLPS-stimulated生264.7 B激活巨噬细胞和drug-intoxicated肝脏14,42,44,60]。因此,激活MAPKs是另一个重要的评估炎症反应的分子机制。我们的研究结果表明,ERK1/2的磷酸化,物和p38由有限合伙人或APAP即显然是被PEF预处理(数据6(一)和10 ())。这些发现表明MAPKs的抑制PEF可能导致PEF-mediated抑制NF -κB通路。

先前的研究已经表明,通常作为重要的监管机构承认其为病原体外生的分子模式(pamp)和抑制释放压力或垂死的细胞在组织损伤(18,61年- - - - - -63年]。一些报告显示激活的参与TLR3或TLR4 APAP-intoxicated老鼠的肝脏。TLR3激活增强磷酸化物的表达,导致APAP-induced肝损伤(48]。TLR4-KO老鼠报道相对免受APAP-caused肝坏死和器官功能障碍(22]。我们的数据表明,APAP即政府造成TLR3和TLR4的表达增加,进而促进了MAPKs的激活和NF -κB和炎症介质的后续生产和促炎的因素,最终导致加重肝损伤。然而,所有的变化都明显恢复了PEF预处理(图10),说明PEF的王亚南APAP-induced急性肝损伤可以通过调解能力TLR / MAPK / NF -κB信号通路。

化学调查显示,PEF是一个丰富的多酚类化合物(表1),特别是geraniin和corilagin(图11和表S1),它已被证明王亚南展出和抗炎活动。CCl Geraniin可以保护小鼠免受₄全身的肝毒性,抑制LPS-induced炎症介质的表达和促炎细胞因子通过抑制Akt-mediated NF -κB通路(64年,65年]。Corilagin预防GalN / LPS-induced衰减肝损伤的氧化应激和细胞凋亡66年]。结果表明:corilagin可以抑制schistosomiasis-induced通过miR21肝纤维化/ smad7 / ERK通路(67年]。最近的一项研究也报道,corilagin施加抗炎效果表达下调TLR4信号分子来改善极端炎症状态在脓毒症68年]。因此,geraniin和corilagin PEF和其他多酚成分可能主要影响因素对其抗炎和王亚南活动负责。

总之,当前研究的结果清楚地表明,PEF发挥抗炎作用LPS-stimulated生264.7巨噬细胞和APAP-induced小鼠肝毒性的失活主要是通过NF -κB通过TLR的封锁和MAPK通路激活。此外,PEF被发现的抗炎活动高度关联的多酚成分。这些研究结果为进一步的应用提供科学证据polyphenol-enriched分数答:wilkesiana在炎症性疾病的治疗药物。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Hongtan吴、庞海悦和Yupei陈了同样工作。

确认

支持的研究项目为大学的优秀青年人才,福建省和厦门医科大学博士启动基金项目(K2016-09)和厦门市政管理局的格兰特科技(3502 z20161229)。

补充材料

补充1。图S1:脉动电场对mRNA的促炎因子水平的影响APAP-intoxicated老鼠。老鼠intragastrically管理与PBS或脉动电场(100、200和400毫克/公斤体重)每天一次连续7天前一个管理APAP即(500毫克/公斤体重)。老鼠被杀死后6 h APAP即挑战。肝组织的总RNA被孤立和reverse-transcribed cDNA(一)TNF - rt - pcr分析α,(b) il - 1β(c) il - 6, (d) MCP-1, MIP-1 (e)α信使rna水平。GAPDH是作为内生控制。结果显示为均值±SD ( )。不同的字母代表统计差异 在团体Tukey-Kramer的测试。

补充2。表S1:校准曲线和多酚类化合物在PEF的内容答:wilkesiana。