文摘
氧化应激诱导高尿酸血和肾素-血管紧张素系统密切相关,以及发病和进展的心血管疾病(CVD)和慢性肾脏疾病(CKD)。因此,重要的是治疗高尿酸血减少氧化应激。我们之前发现benzbromarone,促进尿酸排泄的代理,有直接的自由基清除效果在体外。benzbromarone的抗氧化效果进行评估在活的有机体内通过口服benzbromarone 4周与血管紧张素ⅱ,salt-induced模型大鼠高血压。Benzbromarone没有改变血浆尿酸水平或血压显著降低的水平先进氧化蛋白质产品,氧化应激的标记。此外,dihydroethidium染色后的肾脏显示减少氧化应激benzbromarone管理。这些结果表明benzbromarone有直接的抗氧化效果在活的有机体内预防心血管疾病和慢性肾病和巨大的潜力。
1。介绍
肾素-血管紧张素系统(RAS)的激活密切相关的进展和发展心血管疾病(CVD)和慢性肾脏疾病(CKD) [1,2]。有人建议,血管紧张素ⅱ(ANG II)不仅增加血压与血管紧张素ⅱ1型受体(AT1)也产生活性氧(ROS)通过激活NADPH氧化酶(3,4]。过多的活性氧促进血管收缩、增殖和血管平滑肌肥大细胞,诱导内皮细胞功能障碍和血管壁的炎症反应,可导致心脏或肾脏功能障碍和衰竭(5]。
高尿酸血也被报道与心血管疾病和慢性肾病6- - - - - -8),血管疾病已报告由氧化应激(9]。在高尿酸血,多余的尿酸是由血管细胞或组织(10,11]。然后,细胞内尿酸激活NADPH氧化酶,产生活性氧。尿酸过多也会造成一个恶性循环通过激活局部RAS,进而增加氧化应激(12]。因此,为了防止心血管疾病和慢性肾病,重要的是要抑制尿酸产生的氧化应激。
Benzbromarone治疗剂,已经用于临床防治高尿酸血超过30年。它促进尿酸的排泄尿液通过抑制近端管尿酸转运体1 (URAT1) [13]。之前我们已经表明,benzbromarone直接清除活动对超氧化物自由基,减少产生的细胞内ROS水平和二世以及尿酸在血管内皮细胞(14]。因此,我们预测,benzbromarone对URAT1-independent氧化应激具有抗氧化作用。
RAS激活已被报道参与hyperuricemia-related器官损伤(15- - - - - -17]。在目前的研究中,我们评估benzbromarone的抗氧化活性在活的有机体内使用血管紧张素ⅱ和salt-induced高血压大鼠模型。Benzbromarone口服接种大鼠4周,在此期间他们监控氧化应激标记,血压和肾脏功能。结果相比模型老鼠olmesartan处理,抗氧化活性的AT1受体阻滞剂。这些老鼠作为积极的控制(18- - - - - -20.]。
2。材料和方法
2.1。材料
Chloramine-T购买从Nacalai Tesque Inc .(日本京都)。甲基纤维素400、benzbromarone dihydroethidium(她)和ANGⅱ和光纯化学工业有限公司购买的kouichi(日本大阪)。Olmesartan是一种礼物第一三共制药有限公司(日本东京)。所有其他化学物质都是最高的等级和从商业来源获得。
2.2。动物
六个男Sprague-Dawley (SD)老鼠从Kyudo有限公司购买(传奇、日本)。f23实验协议进行审核和批准(- 275)的动物保健和使用委员会医学院熊本大学。通知之前提交给日本政府开始这项研究。老鼠实验中使用与普通实验室chow,美联储允许免费使用水,保持在一个常规12小时的光暗周期。
2.3。的制备和II-Salt-Infused高血压大鼠模型
高血压模型(ANG II-salt)老鼠准备管理ANGⅱ和生理盐水的老鼠根据以前报道的方法(21,22]。总之,生理盐水(1%)是在饮用水、和ANG II (120 ng /分钟)是使用一个植入皮下注入渗透微型真空泵(ALZET模型2004;库比蒂诺Durect Corp .), CA)。老鼠被随机分为4组:(1)控制老鼠,sham-operated;(2)ANG II-salt老鼠与车辆管理;(3)ANG II-salt老鼠管理与benzbromarone(200毫克/公斤/天);和(4)和II-salt老鼠服用olmesartan(5毫克/公斤/天)。车,benzbromarone, olmesartan通过胃管对28天的日常管理。啮齿动物比人类通常有降低血清尿酸盐水平由于尿酸酶的存在。因此,我们服用高剂量的benzbromarone基于临床前安全数据由Urinorm®。 Blood pressure was measured by the tail-cuff method using a BP-98E manometer (Muromachi Kikai, Osaka, Japan). In brief, conscious rats were placed in a restrainer on a warming pad and allowed to rest inside their cages before blood pressure was measured. Rat tails were placed inside a tail cuff, which was inflated and released several times to allow the animal to be conditioned for the procedure. Twenty-four-hour urine was collected from inside metabolic cages. Plasma was obtained by centrifugation of blood sample at 3000 rpm for 10 min and stored at −80°C until analysis. Blood pressure, blood sample, and urine sample were obtained at 0, 2, and 4 weeks. The survival rate of each group was monitored over the 4-week period.
2.4。测量的生理参数
肌酐(Cr)和血液尿素氮(BUN)测定使用LabAssay™肌酐(Wako纯化学工业有限公司,日本大阪)和UNB-test Wako (Wako纯化学工业有限公司,日本大阪),分别。总蛋白(TP)和尿蛋白使用布拉德福德(U-pro)测定方法。
尿酸(UA)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)测量使用LabAssay尿酸(Wako纯化学工业有限公司,日本大阪)和转氨酶CII-test Wako (Wako纯化学工业有限公司,日本大阪),分别。所有的程序都按照制造商的指示执行。
2.5。肾脏组织病理学
收获肾组织在4%多聚甲醛固定。组织是嵌入在石蜡块和切割在2μ米厚度的组织学检查。肾组织石蜡标本,是沾染了周期性acid-Schiff (PAS),苏木精和伊红()),或者Azan-Mallory污渍。
2.6。氧化应激指标的测量
高级氧化蛋白质产物(AOPPs)被使用之前报道的方法测量(23]。血浆样本稀释10倍与磷酸盐(PBS)。血浆样品稀释(200μL), 10μL 1.16碘化钾(KI)和20μ我添加了醋酸。孵化后30分钟,吸光度测量在340 nm使用荧光标(光谱萤石,Tecan Group Ltd .) Mannedorf,瑞士)。AOPP浓度计算使用chloramine-T从标准曲线。
2.7。检测活性氧(ROS)在肾组织中
荧光染料她是用来检测活性氧在肾脏如前所述24]。Seven-micrometer cryosections肾组织的染色superoxide-sensitive染料她(100μmol / L)轻防护和湿润室为30分钟37°C。三个实验的结果被量化为荧光强度。
2.8。统计分析
结果报告为均值±SD。统计学意义是评估使用方差分析(方差分析),其次是Tukey-Kramer事后测试。对所有分析, 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。生化参数的变化和血压后Benzbromarone的管理
benzbromarone管理在2周后,血压和II -和salt-treated组高于对照组。无论是benzbromarone还是车辆治疗影响收缩压(SBP)、舒张压(菲律宾)。相比之下,SBP olmesartan-treated组显示显著降低(图1(一))和(图类似1 (b))2周,持续4周。
(一)
(b)
表1显示了生化参数的变化。尽管增加尿蛋白和血尿素氮(BUN)测定观察benzbromarone和车辆组,没有肌酐的变化。因此,对肾功能(表benzbromarone没有影响1)。相比之下,olmesartan组显示抑制尿蛋白质和面包。这些标记的肾功能的变化主要取决于ANGⅱ的作用。AST和ALT值benzbromarone-treated组的周4 0周后相比略有增加,但值在正常范围内被发现在人类,几乎相同的啮齿动物。因此,benzbromarone没有引起明显的肝损伤。在星期4,尿酸水平略增加vehicle-treated组,尽管剩下的所有其他组织包括benzbromarone组低。因此,各种治疗尿酸的影响是微不足道的。
3.2。Benzbromarone对氧化应激的影响
vehicle-treated组有显著提高等离子体浓度的先进氧化蛋白质产品(AOPPs) 2周后,与olmesartan benzbromarone-treated组,显示显著减少AOPPs(图2(一个))。此外,她肾组织的染色显示增加vehicle-treated组的荧光强度和减少强度olmesartan——和benzbromarone-treated组(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。在肾脏组织形态学变化Benzbromarone管理工作
肾组织受到不是和他走时染色形态学变化的考试4周后benzbromarone管理。观察肾小管扩张vehicle-treated组但不是benzbromarone-treated组,表明benzbromarone往往会抑制这种损伤(数据3(一)和3(b))。系膜细胞增殖并不是所有组中观察到,而间质纤维化是所有组中观察到,揭示了Azan-Mallory染色(图3(c))。
4所示。讨论
经过2周的管理和二世和盐、高血压、尿蛋白排泄增加,和等离子体AOPP的水平,增加氧化应激标记,观察vehicle-treated组(图1、表1)。相比之下,benzbromarone治疗减少AOPP的水平,这表明benzbromarone可能表现出抗氧化效果在活的有机体内(图2)。肾组织形态学检查(图3)表明,benzbromarone-treated集团倾向于抑制肾小管扩张,与vehicle-treated组。DHE-stained细胞的抑制benzbromarone组表明氧化应激状态的改善可能对肾脏等器官有保护作用。benzbromarone-induced减少氧化应激的可能机制是通过URAT1的RAS激活或抑制。然而,我们的研究结果清楚地表明,正是olmesartan施加抗高血压效果和减少尿蛋白排泄。因此,benzbromarone对RAS激活在这个实验中没有影响。此外,血清尿酸水平观察低ANG-II-infused高血压模型大鼠比正常的老鼠,这表明URAT1-inhibitory benzbromarone效果可能不负责减少氧化应激。啮齿动物一般显示血清尿酸盐水平低于人类由于尿酸酶的存在,把尿酸盐尿囊素(15]。综上所述,benzbromarone的抗氧化作用是独立于它的抑制作用在RAS和URAT1。
Benzbromarone抑制尿酸段氧化应激通过抑制尿酸的吸收到血管内皮和平滑肌细胞(11]。此外,benzbromarone报道部分抑制voltage-driven尿酸盐转运体1 (URATv1),细胞外尿酸排出,在肾小管细胞25]。有趣的是,benzbromarone减少两urate-dependent ROS (26)和(27通过抑制URATv1)水平。URAT1 URATv1存在于各种组织,包括血管平滑肌和内皮细胞。进一步的研究是必要的澄清benzbromarone是否会影响URAT1和URATv1 CKD或心血管疾病。尽管尿酸生产的抑制剂,如别嘌呤醇,也有抗氧化作用由于黄嘌呤oxidase-inhibitory行动28),benzbromarone被认为是优越的,因为它可以陷阱ROS来自黄嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶。事实上,最近的高尿酸血或心脏衰竭患者临床报告表明benzbromarone改善内皮细胞功能的血流介导扩张(FMD)和胰岛素抵抗,导致有效的器官保护(29日,30.]。
我们所知,我们的研究是第一个报告,benzbromarone施加直接的抗氧化效果在活的有机体内。它已经表明,细胞内的RAS激活ROS来自尿酸(12]和benzbromarone的直接抗氧化作用可能有助于抑制局部RAS激活高尿酸血。相反,一些研究已经表明,hyperuricemic患者通常有高血压31日,32)由于系统性RAS激活后,海拔在尿酸水平15- - - - - -17]。诱发性氧化应激密切相关器官损伤(5];因此,benzbromarone,直接减少氧化应激由于RAS,可能是一个有价值的临床代理可以用于器官保护。基于药物信息benzbromarone (Urinorm) benzbromarone的剂量是比较高在活的有机体内研究;因此,需要进一步的临床研究来澄清benzbromarone的抗氧化活性。此外,由于benzbromarone略微增加血清ALT水平,其安全性还需要临床评估。我们推测,在人类血清尿酸盐水平高于在啮齿动物,benzbromarone可能作为一种抗氧化剂在低浓度。
相反,olmesartan AT1受体阻滞剂(ARB),也有很高的抗氧化活性,与先前[效果类似报道18- - - - - -20.在与ANG-II-induced高血压模型大鼠。然而,ARBs药物可以提高血清尿酸水平(33]。因此,慢性肾病患者的血清尿酸水平接收arb通常监控。从实现的角度从抗氧化剂和antihyperuricemics协同治疗效果,olmesartan联合治疗和benzbromarone CKD患者高尿酸血可能是一个更好的选择。
5。结论
在这项研究中,我们发现benzbromarone施加抗氧化活性,独立的RAS的封锁或URAT1 AII-induced ROS在活的有机体内。我们的研究结果表明,benzbromarone不仅可以降低尿酸acid-dependent氧化应激诱导细胞内吸收的尿酸通过URAT1还nonuric acid-dependent ROS,比如来自NADPH氧化酶激活和II。因此Benzbromarone可能是有用的作为一种抗氧化剂预防心血管疾病和慢性肾病。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Nanako Muraya和Daisuke Kadowaki同样这项工作。
确认
本研究在一定程度上支持jsp (KAKENHI 24790160),肾脏基金会,日本(4肯尼迪打败),KUMAYAKU校友研究基金。