文摘

自然Gracilaria lemaneiformis硫酸多糖(GLP0、分子 )被H退化₂O₂获得七个退化的片段,即GLP1 GLP2, GLP3, GLP4, GLP5, GLP6, GLP7,分子量为106,49.6,10.5,6.14,5.06,3.71,和2.42 kDa,分别。红外光谱和核磁共振结果表明,H₂O₂降解不会改变GLP多糖的结构,而特征的内容−OSO₃H组(13.46%±0.10%)略增加比天然多糖降解后(13.07%)。修复的影响多糖分数oxalate-induced损坏人类肾脏近端小管上皮细胞(HK-2)进行了比较。当60μg / mL的多糖被用来修复受损HK-2细胞,细胞生存能力增加,细胞形态恢复,由他染色。乳酸脱氢酶释放的数量从16.64%下降受伤组修复组的7.55% - -13.87%。SOD活性增加,而MDA释放量降低了。此外,线粒体膜电位明显增加。逮捕所有分数多糖抑制S期通过减少比例的细胞S期和G2 / M期细胞的比例增加。这些结果显示,所有GLP分数表现出对oxalate-induced HK-2受损细胞修复的影响。修复能力密切相关的分子量分数。GLP2分子量约为49.6 kDa表现出最强的修复效果,并按分子量高于或低于49.6 kDa显示修复能力下降。我们的研究结果可以为抑制肾结石的形成提供参考和发展原始anti-stone多糖药物。

1。介绍

紫菜多糖具有广泛的生物活性(1]。然而,本地海带多糖无法轻易穿透细胞膜发挥其生物活性,因为他们大的分子大小和溶解度差(2,3];这样,这些多糖应用有限。多糖的生物活性与高分子量可以改善退化。乔和崔4)进行降解海藻fulvellum多糖获得三种多糖分子量较低的分数2,23岁,和36 kDa;抗氧化剂和抗凝活动增加与减少多糖的分子量。朱et al。5)显示,硫酸与低分子量(5 - 7 kDa)摘要研究显示高的抗凝效果比硫酸酯酶的分子量120 - 82 kDa。

Gracilaria lemaneiformis属于红藻门,Florideae Gigarfinales,江蓠科,Gracilaria,广泛分布在中国南方沿海地区和沿海地区附近的日本和韩国(6]g . lemaneiformis消费食品在许多亚洲国家,主要用于食品行业作为胶凝剂7]。g . lemaneiformis主要包括交替3-linked多糖(GLP)β-D-galactopyranosyl琼脂糖与−OSO₃H和4-linkedα-L-galactopyranosyl卡拉胶单位(6]。3-linked单位属于D, 4-linked单位可能D、L配置,经常发生3,6-anhydrogalactopyranosyl一半(6- - - - - -8]。有许多报道关于glp的化学结构和生物活性。GLP产生许多有益的生物活性,如抗肿瘤、抗病毒、抗氧化活动和低血糖症的属性(6,9,10]。风扇等。9孤立的酸性多糖(GLSP)与碳水化合物含量72.06%,硫酸含量的6.13%g . lemaneiformis;GLSP显著地抑制肿瘤的生长,促进脾细胞增殖和巨噬细胞吞噬作用,增加和CD8 - 2的水平⁺T细胞在血液肿瘤的老鼠。结果表明,孤立GLSP显示显著的抗肿瘤和免疫调节活动。廖et al。6]研究了低血糖和抗氧化剂的多糖提取的影响g . lemaneiformis(按;Mw, 121.89 kDa)。胃内的管理按21 d诱导一个明显的降低血糖水平。此外,GLP显然增加了活动的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总抗氧化能力和明显降低丙二醛水平肝脏,胰腺,糖尿病小鼠的肾脏。Di et al。10提取的粗多糖g . lemaneiformis毛评点)热水提取和获得三个纯化多糖,即GRPS-1-1, GRPS-2-1, GRPS-3-2,平均分子量为1310,691,和923 kD,分别。所有的多糖表现出抗氧化效果,包括abt间隙和过氧化物自由基和抑制脂质过氧化作用。

肾结石的发生率近年来逐渐增加(11,12]。目前,治疗泌尿系结石的主要处方药是柠檬酸,镁制剂、正磷酸盐、别嘌呤醇、噻嗪类利尿剂。然而,这些药物的作用机理尚不清楚,其疗效可以边际13]。因此,学者必须开发新的高效、无毒、廉价anti-stone药物科学和实际应用14]。

草酸是人体的代谢产物,主要成分为肾结石的形成。尿液中草酸达到一定浓度时,人类肾脏近端小管上皮细胞(HK-2细胞)将氧化损坏(15),这是与肾结石的形成16,17]。可以修复受损细胞,植物多糖(18,19]。

在我们之前的研究18),我们研究了硫酸盐的影响集团(−OSO₃H)六种海带多糖含量(SPSs) HK-2受损细胞修复能力。六个SPSs提取昆布属植物粳稻,Porphyra yezoensis,Gracilaria lemaneiformis(GLP),海藻fusiforme,麒麟菜gelatinae,Undaria pinnatifida,分别。六SPSs有一个窄的分子量差异(从3343年到4020年达),硫酸和他们的集团(−OSO₃H)含量为21.7%,17.9%,13.3%,8.2%,7.0%,和5.5%,分别。结果表明,多糖的修复能力呈正相关,−OSO₃H的内容。较高的多糖−OSO₃H含量表现出更好的修复受损细胞的能力。此外,分子量也是一个重要因素影响多糖的可行性。然而,GLP的抗氧化活性和修复效果与不同分子量HK-2细胞还没有被调查。在目前的研究中,自然GLP退化了H₂O₂获得八个GLP分数与不同分子量范围从2.42 kDa 622 kDa。的分数oxalate-induced HK-2受损细胞的修复效果也研究阐明肾结石形成的机制,为开发新的anti-stone药物提供实验证据。

2。实验

2.1。试剂和仪器

Gracilaria lemaneiformis硫酸多糖(GLP0)是由北京新探针生物科学与技术有限公司有限公司(中国,北京)。的样本g . lemaneiformis收集来自中国青岛省2016年9月至12月。材料分类,清洗,干立即强制空气循环在50 - 60°C。

细胞增殖测定工具包细胞计数Kit-8 (CCK-8)和乳酸脱氢酶(LDH)测定设备的购买从Dojindo实验室(熊本、日本)。苏木精和伊红染色工具包(他),5、5 ,6、6-tetrachloro-1 1 ,3,3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘(JC-1)工具包,propidium碘(π)购自上海Beyotime生物科学与技术有限公司有限公司(上海,中国)。过氧化氢,KBr (SP)和其他化学试剂均为分析纯,购自广州化学试剂公司(广州)和D₂O从σ(99.9%)。实验二次蒸馏水。

所使用的仪器包括一个酶标记工具(SafireZ、Tecan、瑞士),正直的荧光显微镜(22 di-e-d282、徕卡、德国)、流式细胞分析仪(美国BD公司FACSAria)、傅立叶变换红外光谱仪(Equinox 55、力量、德国),紫外可见分光光度计(美国瓦里安公司卡里500),电导仪(DDS-11A Leici,中国上海)和核磁共振谱仪(瓦里安力量300 MHz,德国)。

2.2。的制备g . lemaneiformis多糖

藻粉的g . lemaneiformis(直径200μ米)受到热水提取90倍体积的蒸馏水5 h在90°C根据廖等描述的方法。6)获得多糖。离心后去除残留(7000 rpm, 10分钟),三分之一的体积的上层清液集中在真空旋转蒸发器。浓溶液沉淀了三卷的绝对乙醇在一夜之间在4°C。收集沉淀,离心(3500 ,10分钟)和解决在温水中。蛋白质被使用Sevag方法。包含多糖的上层清液在蒸馏水透析72 h和真空冷冻干燥。

2.3。多糖的降解

自然GLP0降级使用之前报道的方法(20.]。短暂,1.2 g粗多糖(GLP0)称重准确、溶解在蒸馏水在70°C。后加热到90°C,反应系统很快就被添加为0.1%,0.4%,1%,3%,6%,10%,15%₂O₂解决方案。的降解反应被允许继续2 h,此时溶液的pH值调整到7.0通过添加2摩尔/ L氢氧化钠溶液。退化的解决方案集中到三分之一的原始卷60°C。产品被三次加入无水乙醇沉淀。存储的解决方案是在一夜之间和过滤。滤液在真空干燥得到降解多糖。生产力可以权衡多糖后计算。

2.4。测量平均分子量()多糖

根据文献[21),样品的粘度在水溶液中测量使用一个乌氏粘度方法30±0.2°C。后测量多糖降解前后的下降时间粘度计,特定的()和相对(粘度是根据公式计算 和 ,在那里和去离子水的下降时间,按解决方案,分别。 ,在那里样品的浓度。的通过其GLP的计算价值。 ,在那里和是常数。按, 和 (21]。

2.5。分析硫酸组的内容

硫酸组(−OSO₃H) BaCl GLP测量的内容₂明胶浊度法(18,22]。70毫克的多糖样品放置在10.0毫升1.0 mol / L盐酸溶液,然后水解物在100°C 6 h。冷却后,HCl溶液添加到刻度线。0.3%的明胶溶液准备热水(60 ~ 70°C)和存储在一夜之间在4°C。2 g的BaCl₂溶解在明胶溶液在室温下和左2 - 3小时。0.2毫升的GLP溶液浓度为1.4毫克/毫升加入1毫升BaCl₂明胶试剂和3.8毫升0.5 mol / L盐酸。之后,混合物被允许站在25°C 10 - 20分钟。空白准备用0.2毫升的水代替GLP的解决方案。发布的贝索₄悬架是测量 通过紫外可见分光光度计使用K₂所以₄作为标准,回归方程 , , ,硫酸多糖含量的百分比计算。

2.6。羧基含量的分析

GLP的羧基(−羧基)内容是由电导滴定法(18,23]。电导滴定曲线的绘制使用电导率值作为设在和相应的消耗氢氧化钠的量设在。电导滴定曲线可以分成三个部分,即电导率下降阶段(A)、(B)的平衡阶段,(C)和电导率增加阶段。三个切线从三级构造曲线,和十字路口化学计量点。一条线的交点和B行了氢氧化钠的体积(),这样多余的盐酸和−OSO₃H是消耗,线B和C的交集给出氢氧化钠的量()、过量的盐酸和co-consumed GLP的−OSO₃H和−羧基;因此,(平台部分)的体积消耗氢氧化钠的−羧基GLP的孤独。−羧基含量可根据以下公式:

(mol / L)代表氢氧化钠的摩尔浓度,(g / L)代表GLP多糖的质量浓度,45克/摩尔的摩尔质量是−羧基,和40毫升的滴定液多糖。最后的值是三个平行实验的平均值。

2.7。傅里叶变换红外光谱(ir)分析GLP (24]

多糖的红外光谱测定使用电影由干多糖和KBr小球在傅里叶变换红外分光光度计的波数范围4000 - 400厘米⁻¹4厘米的一项决议⁻¹。

2.8。¹H和¹³C NMR光谱检测(24]

大约20毫克的纯化GLP溶解在0.5毫升的氧化氘NMR管(直径5毫米),执行和分析使用瓦里安力量300 MHz分光光度计。化学变化记录了ppm (ppm)。

2.9。细胞生存能力测定多糖的HK-2细胞

HK-2细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基在37°C和5%的公司₂湿润的环境。当达到80%到90%汇合的单层膜,细胞被轻轻吹胰蛋白酶化后形成细胞悬浊液下列细胞实验。

一百毫升的细胞悬液细胞1×10的浓度⁵细胞/毫升每在96孔板接种,5%孵化有限公司₂调湿大气在37°C 24 h。培养基是被吸入,细胞被分成四组如下:(一)脱细胞培养基组(对照组的背景);(B)控制细胞没有多糖治疗(对照组样本);(C)受损组草酸:包含2.8更易/ L的无血清培养基添加草酸和孵化3 h;无血清培养系统和(D)修复组:包含60μg / mL GLP与不同分子量增加受损细胞,修复10 h。每个实验重复三个平行井。然后,改变了媒介新鲜血清DMEM培养基和10μL CCK-8被添加到每个好,孵化为1.5 h在37°C。吸光度(A)使用酶标记测量仪器在450海里。细胞生存能力计算基于以下方程。

2.10。乳酸脱氢酶(LDH)释放试验

一百毫升的细胞悬液细胞1×10的浓度⁵细胞/毫升每在96孔板接种和培养24小时。然后,细胞被分成五个组,第一节4组的意见出现了分歧2。9,E组(E)补充说:没有GLP (E)细胞治疗的后续乳沟井(样本最大酶活性控制井)。修复后12 h,分析了吸光度在490纳米LDH工具包指令。LDH释放(%)是使用公式计算如下:

2.11。苏木精和伊红染色(他)

一毫升细胞悬液细胞浓度为1.5×10⁵细胞/毫升每在接种12-well盘子和孵化24 h。细胞根据部分被分为三组2。9:对照组(A)、(B)受损组草酸,和(C)修复组按。完成了修复效果后,上层清液被吸入和细胞与PBS洗两次。板上的细胞与4%多聚甲醛固定15分钟和苏木精和伊红染色根据制造商的指示。显微镜下观察细胞形态变化,细胞核染色在紫色和粉红色或红色的细胞质。

2.12。超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量检测

细胞悬液的密度1×10⁵镀细胞/毫升每在96孔板和孵化DMEM含10%胎牛24 h。这些细胞被分为三组:对照组(A)、(B)受损组草酸,和(C)修复组按。细胞SOD活性和MDA含量测定用SOD和MDA工具包,分别根据提供的指示板。

2.13。线粒体膜电位的测量()

一毫升细胞悬液浓度为4.0×10⁵细胞/毫升每在接种6-well板24 h。细胞同步后,细胞被分组在一节2。9。孵化12 h,上层清液吸气,这些细胞被洗两次与PBS和用0.25%胰蛋白酶消化。细胞被移液悬浮,紧随其后的是离心(1000 rpm, 5分钟)。上层清液是吸气,细胞被洗PBS和离心机再次获得一个细胞颗粒。细胞被添加和resuspended彻底混合500μL PBS的微型离心机管。最后,样本沾JC-1然后分析。

2.14。细胞周期进展分析

细胞浓度和组是相同的部分2。9。媒介改变了血清DMEM培养基,然后孵化12 h达到同步。细胞被暂停,紧随其后的是离心(1000 rpm, 15分钟)。上层清液是吸气,细胞被洗PBS和离心机再次获得一个细胞颗粒。300年之后,μL PBS含10%血清加入resuspend细胞和预冷700μL绝对酒精加上不断的颤抖,与密封膜密封,储存在4°C过夜。然后,细胞离心5分钟,每分钟2000转,上层清液吸气。500年μL PBS添加洗细胞,其次是离心分离,上层清液被移除。最后,200年μLπ被添加在37°C和混合15分钟。细胞周期分析流式细胞分析仪。

2.15。统计分析

实验数据被表示为 。实验结果用SPSS 13.0软件进行统计学上的分析。之间的差异意味着实验组和对照组被图基的测试分析。 显示显著差异; 表示非常重要。

3所示。结果

3.1。退化g . lemaneiformis多糖

7从原油降解多糖得到了分数g . lemaneiformis用不同浓度的多糖(GLP0) H₂O₂(表1)。当氢的浓度₂O₂(c(H₂O₂)为0.1%,降解产品的分子量下降622 kDa (GLP0)到106 kDa,表明GLP0很容易退化。多糖的分子量迅速下降到49.6和10.5 kDa的H₂O₂分别添加浓度增加到0.4%和1%(图1)。分子量慢慢下降到6.14和2.42 kDa的H₂O₂浓度增加到3%和15%,分别。

3.2。变化的内容−OSO₃H和−羧基组前后多糖的降解

的−OSO₃H内容每个降解多糖的比例大约是13.46%(图2(一个)),这是自然GLP(图略高于13.07%2(一个))。类似地,−羧基含量的退化的分数是1.27% - -1.77%,高于1.26%的原油GLP。此外,−羧基含量增加而降低分子量的多糖(图2 (b)),但增加不明显。

3.3。结构表征GLP的傅立叶变换红外光谱

多糖的红外光谱g . lemaneiformis之前和之后的退化(图中是相似的3、表2),GLP退化后的峰值强度增加,没有新的峰出现,表明H的退化₂O₂没有造成显著影响多糖的总体结构。

3409 - 3432厘米的巅峰⁻¹的伸缩振动引起的地,2920 - 2928厘米吗⁻¹是由碳氢键的伸缩振动;附近的峰值1380厘米⁻¹是由碳氢键的变形振动。峰值约为1625厘米⁻¹是由于不对称和对称伸缩振动−羧基(24,25]。峰值为1370厘米⁻¹是信号的硫酸酯(26),峰值附近的1260厘米⁻¹对应于S = O振动的硫酸盐团体(27]。1053厘米附近的吸收⁻¹和1043厘米⁻¹是由于切断的伸缩振动,而吸光度在930厘米吗⁻¹弱,表明半乳糖是充分自由的内部醚类型(26]。

3.4。¹H和¹³C NMR光谱分析

图4显示了四个GLP的NMR谱。多糖降解前后的核磁共振光谱相似,这表明,H的退化₂O₂没有造成重大影响GLP的总体结构。异头质子的信号δ4.43 h -被分配到的β-D-galactose,信号δ5.34是归因于异头质子3,6 -α-L-galactose。峰值为930厘米⁻¹傅立叶变换红外光谱的疲软,这表明GLP包含小内生醚半乳糖(26]。它表明GLP组成β-D-galactose 6-O-sulfate-3, 6 -α-L-galactose,不同与早期文献报道[6- - - - - -8]。根据的数量和化学位移值¹³C NMR在95 - 110区间,糖和糖苷键的构象在寡糖及其糖苷可以推导出26]。如图4 (d),有两个主要的山峰在异构碳地区δ(95 - 110 ppm):终端碳颈- 1β-D-galactose在δ102.35 ppm,终端碳颈- 1 3、6 -α-L-galactose在δ99.48 ppm(表3)。

3.5。变化的可行性HK-2细胞修复后通过按不同的分子量

六个GLP分数分子量为622,106年,49.6,10.5,3.71,和2.42 kDa被用来修复oxalate-induced HK-2受损细胞。在我们的初步研究[18),我们发现,当受损细胞修复不同浓度(20、40、60、80和100μ多糖的g / mL),细胞受损细胞的可行性最初增加,达到最大值在60岁μ克/毫升,然后在较高的浓度(100年减少μ60 g / mL),这表明μg / mL是多糖发挥充分的作用。因此,60μ克/毫升的GLP被用来修复受损HK-2细胞。修复后的细胞生存能力的变化如图所示5。受损细胞的细胞生存能力仅为61.9%,这与不同的多糖在治疗后增加到79.2% - -89.5%。的修复能力nondegraded多糖(GLP0)的分子量622 kDa是最弱的,和细胞生存能力修复后为79.2%。的修复能力退化的分数GLP2分子量为49.6 kDa是最强的,和细胞生存能力GLP2修复后为89.5%。当GLP的分子量高于或低于49.6 kDa,修复能力降低。偏差越大的分子量49.6 kDa,较弱的修复能力多糖。

3.6。变化的乳酸脱氢酶(LDH)释放修复后通过按不同的分子量

LDH的释放是细胞膜的完整性的一个重要指标。LDH位于细胞质在正常情况下(28]。当细胞受到外国材料,细胞膜的结构会被破坏、细胞质酶,如LDH,将释放到细胞培养基。因此,可以定量分析细胞毒性检测LDH释放到培养基的数量来评估细胞膜的完整性(28]。

图6显示的LDH释放量的变化从受损HK-2细胞治疗后六GLP分数不同的分子量。与损伤组(16.64%)相比,在不同程度的LDH释放量减少(7.55 -13.87%)后修复各种多糖分数。这一发现表明GLP与不同分子量展出HK-2受损细胞的修复对膜的影响。此外,LDH释放量是最低(7.55%)后细胞被GLP2修理。因此,GLP2表现出最强的修复效果。当各种多糖的分子量分数高于或低于49.6 kDa,多糖的修复效果下降。这些结果根据调查结果对细胞生存能力检测到CCK-8工具包(图5)。

3.7。细胞形态学观察Hematoxylin-Eosin染色

的碱性染料苏木精一个正电荷,染色细胞核的染色质和细胞质中核糖体的紫罗兰。的酸性染料曙红一个负电荷,污渍带正电荷的蛋白质在细胞质和细胞外基质在粉红色或红色。

如图7,正常HK-2细胞之间连接紧密,细胞丰满。当HK-2细胞暴露在草酸(2.8更易/ L) 3 h,细胞失去了自然的形状,细胞数量明显减少,细胞变得集中。修复后通过按不同的分子量,与完整的形状增加细胞的数量,受损的浓缩细胞的数量减少(数字7(一)-7(e))。后被GLP2修复受损的细胞,细胞数量达到最大值和修复细胞的形态成为最接近正常细胞(图7(c))。多糖的修复效果与分子量高于或低于49.6 kDa低于GLP2。

3.8。GLP修复对超氧化物歧化酶(SOD)的影响的活动

SOD活性可以反映抗氧化系统的功能。草酸HK-2细胞受伤后,SOD活性降低为3.59±0.25 U / mL,表明细胞的抗氧化能力降低(图8(一个))。修复的细胞外SOD组高于损伤组,表明glp可以通过抗氧化损伤修复细胞。GLP2分子量约为49.6 kDa显示抗氧化能力最强的受伤的细胞。

3.9。GLP修复对丙二醛(MDA)的一代

MDA含量的变化可以反映了生物膜脂质过氧化的程度。图8 (b)展示了一代中的MDA量控制,受伤,和修复组织细胞。受伤的细胞释放了MDA的增加,表明草酸产生的细胞氧化损伤。维修组MDA含量低于损伤组,表明细胞的氧化损伤水平下降。特别是,GLP2分子量约为49.6 kDa显示最强的修复效果;MDA的含量显著( )减少到2.43±0.10 nmol / L与损伤组(7.31±0.19 nmol / L)。

3.10。线粒体膜电位的变化()

荧光探针JC-1阳离子亲脂性的染料,可以自由通过细胞膜和维护一个动态平衡在膜的两侧通过改变细胞的膜电位。JC-1线粒体与高、低不同标签通过形成J-aggregates或单体释放橙红色或绿色光,分别。因此,荧光强度比值(A / M) J-aggregates / J-monomers线粒体可以检测来确定早期细胞凋亡。

图9(一个)显示的变化HK-2受损细胞的修复后通过按不同的分子量。的活细胞的高,所以红色荧光是很强的。图9 (b)显示荧光强度比值的变化/ M的每个维修组的线粒体。A / M比正常HK-2细胞线粒体的较高(34.71),但在oxalate-induced / M比率下降到2.7受损的组织。这一发现表明,在受损的细胞明显减少。当受损细胞修复与不同的分子量,GLP / M比率在不同程度增加(9.1 - -13.08)。增加造成GLP2分子量为49.6 kDa是最明显的,和a / M比增加到13.08,这是高于其他GLP修复组。

3.11。修复前后细胞周期的变化

Propidium碘(π)是一种DNA双链荧光染料。产生的荧光强度的组合π和DNA双链DNA呈正相关,内容。被PI染色后细胞内DNA, DNA内容可以通过流式细胞仪测定。细胞周期可以根据DNA分布进行分析(29日,30.]。

图10 ()显示的变化周期GLP HK-2受损细胞修复后的分数不同的分子量。与受损组相比,S期细胞的比例明显降低(图10 (b)),而在G2 / M期细胞的比例增加(图10 (c))。被GLP2修复后,S期细胞的比例最低(41.1%)和那些在G2 / M期增加(17.6%)。因此,GLP2分子量为49.6 kDa提升细胞S期和G2 / M期最有效和表现出最强的修复受损细胞。

4所示。讨论

4.1。GLP退化和结构表征

几种方法用于降解多糖;这些方法包括酸水解、氧化降解和酶的方法。广泛使用的方法是H₂O₂退化,离解反应H₂O₂形成羟基自由基。羟基自由基的氧化物质和可以攻击多糖的糖苷键31日]。H的降解反应₂O₂是温和的,其范围可以控制在不改变多糖的主链的结构。近年来,H₂O₂退化已被广泛接受。例如,侯et al。32)进行降解昆布属植物粳稻摘要研究通过改变H₂O₂浓度、反应温度和pH值和获得七退化兆瓦的分数:1.0,3.8,8.3,13.2,35.5,64.3,和144.5 kDa。所有的这些多糖分数无显著变化,主要展出主体结构和硫酸组内容。

多糖的结构是其生物活性的基础(4,5,10,33]。半乳糖体从红色海藻具有结构基于线性交替3-linked链β-D-galactopyranose残留物(单位)和4-linkedα- d——或者α-L-galactopyranose残留或其3 6-anhydro导数(B单位)。这些半乳糖体主要分为种,B单位属于D系列,和agarans L B单位的配置(34]。“Agaran”是指多糖的骨干(→3)β- - - - - -D加-(1→4)-(第六)α- - - - - -l加)。在目前的研究中,糖的单糖组成和类型分析了GLP的残留物¹H核磁共振,¹³C NMR, ir光谱方法。的信号δ4.43和5.34 ppm¹H NMR光谱对应的H1β-D-galactose和3,6 -α分别-L-galactoptoside。的信号δ102.35和99.48 ppm¹³C NMR光谱对应的异头质子β-D-galactose和3,6 -α分别-L-galactoptoside。峰值为1370厘米⁻¹傅立叶变换红外光谱中分配给硫酸酯,和峰值为1260厘米⁻¹对应于S = O的伸缩振动26,27]。这些发现表明GLP硫酸多糖。基于光谱分析结果,按主要包括β-D-galactose 6-O-sulfate-3, 6-L-galactose(计划1)。L-galactose的存在表明GLP包含agaran结构。Duarte et al。35]表明,B单位在L配置不是最重要的,因为它的生物活性,但替换硫酸集团agaran骨干影响其生物活性。因此,替代硫酸的内容和位置小组agaran支柱可能影响GLP HK-2受损细胞的修复能力。

多糖含有半乳糖残基,很容易受到自由基的攻击,从而导致断裂链骨干的36]。因此,H GLP可以很容易地退化₂O₂。解聚与H₂O₂,一种广泛使用的方法,改变组织的多糖,但不引起不同主链结构的变化(图4)[37]。红外光谱和¹H NMR光谱按之前和之后退化(图中是相似的3、表2),并没有新的峰出现。这一发现表明,H的退化₂O₂没有显著影响多糖的整体结构。因此,主体结构的多糖降解前后略有改变。降解多糖的分子量和H₂O₂浓度呈负相关(图1);这一发现提供了获取目标多糖分子量不同的引用。

如数据所示2和3的内容,−OSO₃H和−羧基组多糖降解后分数略有增加,因为以下几点:(1)自由基产生的H₂O₂在退化将打破高度紧凑自然多糖的糖链结构,从而暴露了−OSO₃H和−羧基组的多糖和(2)降解的水溶性多糖略有增加,高于nondegraded GLP0因为大分子量的后者,导致一小部分的隐藏的酸性多糖组38,39]。

类似的结果是由以前的研究报告(38,39]。Zhang et al。39)获得多糖分数与不同分子量(725、216、124、61.9和26.0 kDa)通过H₂O₂原油的降解Monostroma latissimum多糖;的−OSO₃H组内容(21.20%、22.71%、24.73%、25.48%和27.28%,分别地)增加与减少多糖的分子量。太阳et al。38)使用H₂O₂和风险降低奶油蛋白甜饼冬青和Sarcinochrysis滨Geitler。当的分子量p .冬青从3645 kDa下降到55.0 kDa,−羧基含量从3.41%上升到8.78%。−羧基含量从5.82%上升到9.99%的分子量美国滨从2595 kDa Geitler下降到169 kDa。

4.2。GLP HK-2受损细胞的修复效果

高浓度的尿液中草酸会导致脂质过氧化;这种现象会导致过度生产活性氧(ROS)和MDA(图8 (b))和肾上皮细胞受损,导致增强附着力尿微晶的形成,促进了早期microcalculus [40,41]。过多的活性氧生成导致损耗的SOD酶活性细胞(图8(一个)草酸),表明降低了细胞的抗氧化能力。glp显示显著的抗氧化活性,有效修复细胞对氧化应激引起的草酸。SOD活性明显增加时,受损细胞修复与60μg / mL glp, MDA含量明显降低而受伤的细胞。此外,目前的结果表明,细胞生存能力降低(图5)和LDH释放到细胞外基质的数量增加(图6通过草酸)当HK-2细胞受损。HK-2受损细胞修复后通过与不同分数的GLP治疗,细胞生存能力增加,LDH释放量减少,提高了细胞形态学和活细胞的数量增加(图7)。苏和Varalakshmi42)报道,戊聚糖钠polysulfate可以减少LDH calculogenic鼠尿液分泌。与此同时,粘多糖可以防止胞质钙的变化^{2 +}草酸含量引起的肾小管上皮细胞,恢复细胞形态(43]。

线粒体膜电位(在正常细胞)是高于在受损的细胞(44]。当细胞被氧化破坏草酸,线粒体膜的通透性增加,引起Ca^{2 +}流入和线粒体去极化(45),导致下降(图9 (b))。按分数与不同分子量可以用来修复细胞的膜电位。的增加按数据的分子量有关吗8(一个)- - - - - -8(e));也就是说,细胞是最接近正常组修复后通过按分子量49.6 kDa。李等人。46)报道,灵芝atrum多糖(PSG-1)线粒体bcl - 2蛋白表达增加;多糖抑制伯灵顿易位,细胞色素c的释放,和半胱天冬酶的激活,导致增加的细胞。Sparassis crispa多糖分子量的分数75 kDa减少活性氧的积累,阻止了Ca^{2 +}涌入,预防线粒体膜电位去极化的保护PC12细胞免受L-Glu-induced损伤(45]。GLP可以修复受损的线粒体细胞因为−OSO₃H和−羧基官能团富含GLP,可以清除活性氧(24]。

在受损细胞的S期细胞比例(51.9%)增加,但在G2 / M期减少(图10)。S期细胞周期而被捕。这个结果可能是由于细胞启动了DNA修复DNA的细胞时损坏。当DNA无法修复,细胞不能进入G2 / M期和阻止S期30.]。治疗后与按不同的分子量,S期细胞的比例下降,在G2 / M期增加。因此,GLP促进细胞周期进展S期和G2 / M期,修复DNA复制。修复能力在细胞周期进展,按数字的分子量9(一)-9(E))和GLP2分子量为49.6 kDa表现出最强的修复能力。

4.3。修复与不同分子量的多糖效果的差异

GLP HK-2受损细胞的修复效应可能是由于多糖分子,这些分散的细胞修复受损细胞膜差距或坚持细胞膜草酸阻止进一步的氧化损伤;色散和粘附的多糖与其分子量(密切相关47]。(1)高分子量的多糖有限的物理性质,如高度紧凑的分子结构,分子大小,大,水溶性低,导致迁移的可能性降低细胞膜(32];多糖无法轻易扩大细胞膜发挥其生物效应。(2)例如,使用低分子肝素的生物可用性高于普通肝素,前者从而抑制动脉粥样硬化(48]。一项研究在三个退化porphyran分数(分子量为29695、6893和5876 Da)报道,分数较低分子量展出DPPH自由基清除能力强和抗氧化活性49]。太阳et al。50)降解原油紫球藻属cruentum和6降解多糖获得分数,分子量为6.53,256年,606年,802.6,903.3,和1002 kDa;分子量的多糖部分6.53 kDa对增强免疫调节能力表现出最佳的效果。(3)如果多糖分子量太低,不能形成一个活跃的生物活性聚合物结构。廖et al。6]研究了GLP的降糖效果与不同分子量在糖尿病小鼠和发现GLP高分子量(如121.89 kDa)不容易通过细胞膜发挥生物学作用;此外,与低分子量GLP(比如5 kDa)不能形成一个活跃的生物活性的高分子结构,导致生物活性降低。Cai et al。51)也报道,GSP-2的抗凝活性,28 kDa的分子量和提取g . scabrabunge低于GSP-3,高分子量的58 kDa。(4)用适当的分子量多糖有自由程度高和位阻小;他们需要更少的能量扩散到细胞膜破坏(47];因此,这些多糖表现出巨大的潜力被细胞膜吸收通过静电相互作用和修复细胞。因此,降解高分子量的多糖与适当的分子量同行可以改善其生物活性32]。适当的分子量来获取最佳的生物活性植物多糖的不同而不同。例如,孟et al。52)报道,多糖分子量的10 - 20 kDa表现出比更高的氢氧自由基清除活性多糖分子量的分数43和4.7 kDa。

肾小管细胞损伤的病理生理过程中发挥着关键作用肾石疾病。异常高草酸尿诱发肾小管功能障碍或损坏,从而促进草酸钙晶体的保留。这一现象被认为是最终形成肾结石的先决条件(53]。我们的研究结果表明,按分数可以修复oxalate-induced氧化HK-2受损细胞,和他们的修复能力与分子量的分数。这些结果可以帮助设计基于结构的药物对尿石形成与特定的操作。

5。结论

七个分数分子量为106,49.6,10.5,6.14,5.06,3.71,和2.42 kDa获得通过控制H₂O₂在原油降解GLP浓度。按由β-D-galactose 6-O-sulfate-3, 6 -α-L-galactose。H₂O₂降解不会改变GLP多糖的结构,而内容−OSO₃H和−羧基组的多糖降解后略有增加。各种多糖分数可以修复oxalate-induced氧化HK-2受损细胞。被多糖修复后,细胞活力和SOD活性增加,释放的LDH和MDA量减少,细胞形态逐渐恢复到正常细胞,线粒体膜电位增加,S期细胞的比例减少,和G2 / M期细胞的比例增加。每个多糖部分GLP的修复能力与其分子量有关。GLP2分子量为49.6 kDa表现出优越的修复效果比其他降解多糖片段和粗多糖。此外,多糖分子量很大程度上偏离49.6 kDa引发修复能力薄弱。我们的研究结果表明,退化GLP分数,特别是GLP2,可能发展成小说anti-stone多糖药物。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究工作得到了国家自然科学基金(没有。81670644和81670644)。