文摘

心房纤维母细胞的分化成myofibroblasts在心房纤维化起着至关重要的作用。钠tanshinone花絮磺酸盐(ds - 201)的水溶性衍生物tanshinone花絮”,已被证明有强有力的antifibrotic属性。然而,ds - 201保护作用的血管紧张素ⅱ- (Angⅱ)心房纤维母细胞的诱导分化成myofibroblasts仍有待阐明。在这项研究中,人类心房纤维母细胞刺激了Angⅱ存在与否的ds - 201。然后,α光滑的肌肉肌动蛋白(α第三sma),胶原蛋白,胶原蛋白表达和活性氧(ROS)生成测量。转化生长因子的表达β1 (TGF -β1)和下游信号的TGF -β1如磷酸化Smad2/3也决定。结果表明,ds - 201显著预防Ang II-induced人类心房纤维母细胞迁移和减少Ang II-inducedα第三sma,胶原蛋白,胶原蛋白的表达。此外,增加活性氧的生产和表达TGF -β1刺激和二世也显著地抑制了ds - 201。与这些结果一致,ds - 201显著抑制Ang II-evoked Smad2/3磷酸化和periostin表达式。这些结果和实验涉及n -乙酰半胱氨酸(抗氧化)和一个anti-TGF -β1抗体表明ds - 201防止Ang II-induced myofibroblasts心房纤维母细胞的分化,至少部分通过抑制氧化应激和抑制TGF -的激活β1信号通路。所有这些数据显示的潜在效用ds - 201治疗心脏纤维化。

1。介绍

心房颤动(房颤)是最常见的心律失常之一,已成为一个严重的疫情在世界各地。虽然心房病理生理学已被广泛研究,有有限的可用治疗房颤患者(1]。众所周知,心房纤维化导致心房结构重构中扮演一个关键的角色在房颤的开发和维护2,3]。抑制房颤心房纤维化可能是一个合理的方法预防和治疗。

它已经表明,心房纤维化通常起源于nonmyocyte生长和细胞外基质(ECM)蛋白质沉积(4- - - - - -6]。为主要nonmyocytes,成纤维细胞进行分化转化成myofibroblasts,特点是收缩蛋白的表达,比如α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma),生产大量的ECM组件,如胶原蛋白I、III,极度参与心房纤维化(7,8]。此外,心房纤维化的发展和myofibroblast分化已被证明非常受血管紧张素ⅱ(Ang II)和下游信号通路的激活通过可溶性细胞因子如转化生长因子-β1 (TGF -β1)(6,9- - - - - -11]。因此,抑制Ang II-induced myofibroblast分化可能是治疗心房纤维化的重要手段。

丹参,也被称为丹参是一种传统的中草药,多年来被广泛用于治疗各种疾病,包括冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化和脑血管疾病(12,13]。钠tanshinone花絮磺酸盐(ds - 201,分子结构如图1)是一种水溶性的导数tanshinone花絮”的最从丹参提取的药物活性单体。据报道,ds - 201或tanshinone花絮可以诱导血管舒张14- - - - - -16),抑制炎症反应(17- - - - - -19),防止动脉粥样硬化(20.- - - - - -23),心脏损伤(24,25),和肥大26- - - - - -28]。此外,ds - 201或tanshinone花絮”已被证实能抑制肾纤维化(29日,30.),膀胱纤维化(31日),和肺纤维化32,33),以防止TGF -β、辐射和降心脏纤维化34- - - - - -36]。此外,tanshinone花絮”已被临床证明有效治疗肝纤维化患者和严重肺炎(37]。然而,没有研究调查了ds - 201对盎II-induced myofibroblasts心房纤维母细胞的分化。


图1
ds - 201的分子结构。

因此,在目前的研究中,我们调查了ds - 201对盎II-induced myofibroblast分化转化,我们的数据表明,ds - 201防止Ang II-induced myofibroblast分化转移通过抑制氧化应激和TGF -β1人类心房纤维母细胞信号通路。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

ds - 201(纯度≥98%)是经国家食品和药物控制机构(中国,北京)。和二世是购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。成人心室成纤维细胞和纤维母细胞medium-2从ScienCell购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。抗体αsma、磷酸化Smad2/3和总Smad2/3买来圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。TGF -抗体β1和GAPDH是获得细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。胶原蛋白的抗体,胶原蛋白三世,periostin获得Abcam(美国Cambridge, MA)。细胞计数设备8 (CCK8)解决方案,2 ,7 二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA),总超氧化物歧化酶(SOD)测定包、过氧化氢酶(CAT)测定包、和n -乙酰半胱氨酸(NAC)从Beyotime购买(上海,中国)。

2.2。细胞培养

成人心室成纤维细胞在纤维母细胞medium-2培养,和细胞通道3 - 7倍。

2.3。细胞生存能力分析

人类心房纤维母细胞(1×104/)被播种在96孔板和融合发展。然后,细胞缺乏血清12 h,紧随其后的是刺激和ds - 201(0、5、25、50、100和200μ米)24 h。细胞生存能力在450纳米测量与CCK8解决方案使用光谱马克斯M5标(分子器件、桑尼维尔,美国)。

2.4。细胞增殖检测

人类心房纤维母细胞(1×104/)被播种在96孔板和融合增长到50%。然后,细胞缺乏血清12 h,紧随其后的是刺激和二世没有或在ds - 201(5、25、50和100μ米)24 h。细胞增殖是通过添加10测量μL CCK8解决方案为4 h孵化后的井和37°C。然后,每个的OD值测量的光谱吸光度的马克斯M5标450海里。

2.5。免疫印迹

人类心房成纤维细胞(3×105井/镀)是3.5厘米,融合发展,缺乏血清12 h。然后,细胞暴露于Angⅱ(0.5μ米)没有或ds - 201(5、25、50和100μ米)24 h。在一些实验中,成纤维细胞被使用NAC(10毫米)或一个anti-TGF -β1抗体(2μg / mL),紧随其后的是刺激和II (0.5μ米)24 h。然后,细胞收获和细胞溶解在冰冷的里帕裂解缓冲(Beyotime)补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。样本的蛋白质分离与钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。膜被封锁的5%脱脂奶粉1 h在室温下的解决方案。阻塞膜与抗体探测αsma(1: 200),胶原蛋白我(1:1000),胶原蛋白3 (1:1000),TGF -β1(1:1000)磷酸化Smad2/3(1: 200),总Smad2/3 (1: 200), periostin(1: 1000),和GAPDH一夜之间(1:1000)在4°C。洗后与含有0.05%渐变20的磷酸盐,膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(圣克鲁斯生物技术)的主要抗体。然后,膜处理增强化学发光试剂(默克密理博,沃特福德,英国)和蛋白质信号成像使用ChemiDoc XRS (Bio-Rad实验室)。ImageJ被用来测量条纹的密度。

2.6。细胞迁移实验

细胞迁移是衡量使用transwell迁移钱伯斯8.0μm-sized多孔膜(美国纽约康宁合演,康宁)。人类心房成纤维细胞(3×104)被添加到上层钱伯斯和暴露于Angⅱ(0.5μ米)没有或ds - 201(5、25、50和100μ米)24 h。然后,剩下的细胞在参议院被使用棉签和膜固定,然后沾0.5%结晶紫。迁移到众议院的细胞数。

2.7。测量细胞内活性氧(ROS)

人类心房纤维母细胞暴露在Ang II (0.5μ米)没有或ds - 201(5、25、50和100μ米)1 h。然后,细胞和纤维母细胞medium-2洗和随后孵化DCFH-DA (10μM)为30分钟37°C。孵化后,细胞的荧光强度是决定使用光谱马克斯M5标仪(美国分子器件、桑尼维尔CA) (488/525 nm)和荧光图像捕获的evo倒置显微镜(AMG,磨溪,佤邦,美国)。

2.8。测量细胞内SOD和CAT的水平

人类心房纤维母细胞暴露在Ang II (0.5μ米)没有或ds - 201(5、25、50和100μ米)1 h。细胞溶解产物被准备,蛋白质浓度测定用BCA蛋白质分析。然后,SOD和CAT的水平是衡量各自的工具根据制造商的指示。

2.9。数据分析

所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)的意思。结果分析了单向方差分析(方差分析)其次是事后比较。 被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。ds - 201对细胞活力的影响

确定是否ds - 201治疗诱导细胞死亡,ds - 201在纤维母细胞生存的影响被检测到。人类心房纤维母细胞刺激了ds - 201(0、5、25、50、100和200μ米)24 h,和细胞CCK8解决方案进行可行性分析。结果显示各组之间无显著差异(图2),这表明在200年的最大浓度μ米,ds - 201不影响纤维母细胞的发育能力。因此,我们使用的最高浓度的ds - 201是100年μ在后续的实验中。


图2
ds - 201对细胞活力的影响。人类心房纤维母细胞暴露在ds - 201(0、5、25、50100和200μ米)24 h。使用CCK8测定细胞活力测定。数据显示平均±标准差4个独立的实验,提出了%的控制价值(第一栏)。
3.2。ds - 201防止Ang II-Induced人类心房纤维母细胞纤维化反应

心房纤维化反应成纤维细胞,成纤维细胞分化myofibroblast, fibroblast-derived ECM蛋白质沉积,成纤维细胞迁移、增殖,在心房纤维化中发挥导入的作用。探索ds - 201的影响和II-induced纤维化反应,myofibroblast分化和ECM蛋白质沉积是首先调查。心房纤维母细胞暴露在Ang II (0.5μ米)没有或存在ds - 201(0、5、25、50和100μ米)24 h。然后,细胞溶解产物都准备好了,和的表达α第三sma,胶原蛋白,胶原蛋白与西方墨点法确定。数据显示α第三sma,胶原蛋白,胶原蛋白表达显著增加Angⅱ刺激但减少了ds - 201治疗(图3)。我们还研究了ds - 201独自的影响α第三sma,胶原蛋白,胶原蛋白表达,结果显示各组之间无显著差异(补充图1和补充图2)。结果表明,ds - 201防止Ang II-induced myofibroblast分化和ECM蛋白表达。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
图3
ds - 201防止Ang II-induced心房纤维母细胞纤维化反应。心房纤维母细胞暴露在Ang II (0.5μ米)有或没有ds - 201(0、5、25、50和100μ米)24 h。(一)的表达α分析了sma西方墨点法,代表三个独立实验的图像显示。的比例αsma规范化GAPDH是计算。(b)胶原蛋白的表达我被免疫印迹分析,和代表三个独立实验的图像显示。胶原蛋白的比例我规范化GAPDH是计算。(c)胶原蛋白的表达三世被免疫印迹分析,和代表三个独立实验的图像显示。胶原蛋白的比例三世规范化GAPDH是计算。显示所有数据平均值±SD和表示为褶皱的变化。 与控制(第一栏); 与Angⅱ; 而Angⅱ。

成纤维细胞的迁移也发现使用transwell室迁移试验。人类心房纤维母细胞被添加到包含多孔过滤器和上院对待Ang II (0.5μ米)有或没有ds - 201(0、5、25、50和100μ米)。24小时后,通过膜的细胞迁移数。结果表明,Angⅱ显著增加迁移的细胞与车辆的对照组相比,和ds - 201治疗显著地抑制Ang II-induced纤维母细胞迁移(数据4(一)和4 (b))。ds - 201的影响和II-induced纤维母细胞增殖也决定。数据显示细胞增殖显著增加了Angⅱ刺激但减少ds - 201治疗(图4 (c))。作为一个整体,这些结果表明,ds - 201防止Ang II-induced人类心房纤维母细胞纤维化反应。

(一)
(一)
(b)
(b)
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(c)
图4
ds - 201防止Ang II-induced细胞迁移和细胞增殖。(a)心房纤维母细胞被添加到上层室包含多孔过滤器然后Angⅱ(0.5处理μ米)有或没有ds - 201(0、5、25、50和100μ米)。24小时后,这些细胞被固定和与结晶紫染色。的细胞迁移到较低的房间数。代表图像的细胞迁移(规模酒吧,200所示μ米)。(b)定量评估3个独立的细胞迁移实验。(c)心房纤维母细胞刺激了Angⅱ在没有或在ds - 201(5、25、50和100μ米)24 h。然后,由CCK8测定细胞增殖测定。显示所有数据平均值±SD和表示为%值(第一栏)的控制。 与控制(第一栏); 而Angⅱ。
3.3。ds - 201防止Ang II-Induced氧化应激

由于生产过剩的活性氧已经证明为心房纤维化(38,39),ds - 201的影响和II-induced ROS生成检测。心房纤维母细胞被刺激和II (0.5μ米)没有或存在ds - 201(0、5、25、50和100μ米)1 h。与DCFH-DA然后,细胞被染色,DCF的荧光强度是衡量使用标在488/525 nm。结果表明,细胞内活性氧显著增加在Ang II-treated纤维母细胞,但减少了ds - 201治疗(图5(一个))。类似的结果也荧光图像(图所示5 (b))。抗氧化酶的活动,比如SOD和CAT,也是衡量。数据显示,SOD和CAT含量显著减少了Angⅱ刺激但是ds - 201治疗(数据恢复5 (c)和5 (d))。我们还研究了ds - 201独自ROS生成的影响,结果显示各组之间无显著差异(补充图3)。这些数据表明,ds - 201防止Ang II-induced氧化应激。

(一)
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(b)
(b)
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图5
ds - 201抑制Ang II-induced氧化应激。心房纤维母细胞暴露在Ang II (0.5μ米)有或没有ds - 201(0、5、25、50和100μ米)1 h。(a)细胞被染色和DCFH-DA DCF的荧光强度是衡量使用标在488/525 nm。(b) DCF荧光也由荧光显微镜、监控和代表三个独立实验的图片所示(规模酒吧,100μ米)。(c, d)水平的SOD和CAT测量各自的工具根据制造商的指示。所有数据显示平均±标准差3独立实验,提出了%的控制价值(第一栏)。 和反对; 与Angⅱ; 而Angⅱ。

进一步确定抗氧化的影响和II-induced心房纤维化反应成纤维细胞,这些细胞被使用NAC 1 h,紧随其后的是刺激与Angⅱ24 h。结果表明,南汽显著抑制和II-inducedαsma表达和ECM沉积(图6)。作为一个整体,这些结果表明,ds - 201防止Ang II-induced心房纤维母细胞的分化myofibroblasts通过抑制氧化应激。


图6
南汽抑制Ang II-induced心房纤维母细胞纤维化反应。心房纤维母细胞使用NAC(10毫米)1 h,紧随其后的是刺激和II (0.5μ米)24 h。的表达α第三sma,胶原蛋白,胶原蛋白免疫印迹分析,和代表三个独立实验的图像显示。的比例αsma,胶原蛋白,胶原蛋白三世规范化GAPDH是计算。显示所有数据平均值±SD和表示为褶皱的变化。 与控制(第一栏); 而Angⅱ。
3.4。ds - 201防止Ang II-Induced TGF -β1激活

先前的研究已经表明,TGF -β1在心房纤维化中发挥着关键作用11,39]。特别,它表明,在缺乏TGF -β1和2是不能诱发心脏肥大和纤维化体内40]。因此,ds - 201的影响和II-induced TGF -β1激活了。心房纤维母细胞暴露在Ang II (0.5μ米)有或没有ds - 201(0、5、25、50和100μ米)24 h。细胞溶解产物都准备好了,并使用西方墨点法分析了蛋白质。结果表明,TGF -的表达β1与Angⅱ刺激显著增加,但减少针对ds - 201治疗(图7(一))。我们还发现,ds - 201仅对TGF -没有影响β(补充图1表达4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图7
ds - 201防止Ang II-induced TGF -β1人类心房成纤维细胞活化。心房纤维母细胞暴露在Ang II (0.5μ米)有或没有ds - 201(0、5、25、50和100μ米)24 h。(一)表达TGF -β1是由免疫印迹分析,代表三个独立实验的图像显示。TGF -的比率β1标准化GAPDH是计算。(b)磷酸化(p)的Smad2/3被免疫印迹分析。代表三个独立实验的图像,光密度分析磷酸化Smad2/3规范化Smad2/3显示。(c)的表达periostin被免疫印迹分析,和代表三个独立实验的图像显示。periostin规范化的配给GAPDH是计算。 与控制(第一栏); 而Angⅱ。

Smad2/3的磷酸化,TGF -的下游信号β1,也是决定。数据显示,ds - 201显著抑制Ang II-evoked Smad2/3磷酸化(图7 (b))。此外,periostin TGF -是众所周知的β1-inducible基质蛋白。然后我们调查了ds - 201是否会影响periostin表达式。结果表明,periostin的表达显著增加,以应对和二世,而ds - 201减少其表达式(图7 (c))。总的来说,这些结果表明,ds - 201防止Ang II-induced TGF -β1激活。

进一步确定封锁TGF -的影响β1盎II-induced心房纤维化反应成纤维细胞,这些细胞被使用一个anti-TGF -β1抗体1 h,紧随其后的是刺激与Angⅱ24 h。结果表明,anti-TGF -β1抗体显著抑制Ang II-inducedαsma表达和ECM沉积(图8)。作为一个整体,这些结果表明,ds - 201防止Ang II-induced分化的心房纤维母细胞通过抑制myofibroblasts TGF -的激活β1信号通路。


图8
TGF -的封锁β1抑制Ang II-induced心房纤维母细胞纤维化反应。心房纤维母细胞和anti-TGF——进行预处理β1抗体(2μg / mL) 1 h,紧随其后的是刺激和II (0.5μ米)24 h。的表达α第三sma,胶原蛋白,胶原蛋白免疫印迹分析,和代表三个独立实验的图像显示。的比例αsma,胶原蛋白,胶原蛋白三世规范化GAPDH是计算。显示所有数据平均值±SD和表示为褶皱的变化。 与控制(第一栏); 而Angⅱ。

4所示。讨论

众所周知,Angⅱ,据报道被激活在各种心血管疾病,如心肌梗死,高血压41,42),在心房纤维化中起着重要作用,促进分化的心房纤维母细胞到myofibroblasts [43]。因此,识别新的预防和治疗方法针对Ang II-induced myofibroblast分化具有很大的临床意义。在目前的研究中,我们评估了ds - 201对盎II-induced心房纤维化的影响,结果表明,ds - 201阻止Ang II-induced myofibroblast分化通过抑制氧化应激和表达下调TGF -β1人类心房纤维母细胞信号通路。

成纤维细胞的分化myofibroblasts特点是αsma表达和ECM蛋白质沉积。先前的报道(44- - - - - -46),我们的数据在这个研究表明,Angⅱ显著增加纤维母细胞迁移,αsma表达,和胶原蛋白的生产。然而,DS201预防和治疗II-induced心房纤维化反应成纤维细胞剂量依赖性的方式。这些结果与以前的研究一致表明,ds - 201抑制TGF -β、辐射和降心脏纤维化34- - - - - -36]。

越来越多的证据表明了氧化应激作为一个重要的病理心脏重塑机制(38,39]。先前的报道(44,47),我们的研究结果表明,Angⅱ显著增加细胞内ROS代成纤维细胞。目前的结果清楚地表明,ds - 201显著抑制Ang II-induced ROS生成和增加了酶的激活可清除ROS SOD和CAT等心房纤维母细胞,这是符合这些报告的其他调查人员(48,49]。虽然机制ROS介导心房纤维母细胞的分化myofibroblasts仍不清楚,我们的实验涉及NAC表明氧化应激的抑制作用显著防止Ang II-induced心房纤维母细胞纤维化反应。这些结果与以前的研究一致表明,ROS Angⅱ——或者TGF -是必要的β1-inducedαsma表达和myofibroblast分化(44,50]。因此,目前的研究结果强烈表明,ds - 201防止Ang II-induced心房纤维母细胞的分化myofibroblasts通过阻断氧化应激。

TGF -β1起着重要的作用在心脏重构和纤维化的发病机制。在转基因研究中,TGF -β1超表达与纤维化相关的老鼠的心(51,52]。此外,大量的证据表明肾素-血管紧张素系统和TGF -之间的直接联系β1,这表明TGF -β1行为下游Angⅱ(53]。与之前的研究一致,我们的数据还显示,Angⅱ显著增加TGF -β1表达和Smad2/3磷酸化,而用ds - 201治疗剂量依赖性抑制TGF -的表达增加β1和激活Smad2/3。Periostin, TGF -β诱导基质蛋白,已经证明为纤维化(通过调节ECM分子如胶原、纤粘连蛋白54]。Periostin淘汰赛导致减少纤维化和肥大后压力过载,而periostin-overexpressing转基因小鼠与老龄化发展自发肥大(55,56]。符合这些报告,我们的结果表明,periostin表达式大大增加了Angⅱ刺激,但其表达下降,相应的ds - 201治疗后肝纤维化。

尽管一些先前的研究ds - 201的影响关注Ang II-induced TGF -β1信号通路的激活,先前的报道表明,tanshinone花絮减毒TGF -β1的表达在肺纤维化32)在慢性肾脏疾病(57),在一定程度上与我们的结果一致。此外,我们的实验涉及anti-TGF -βTGF - 1抗体表明封锁β1信号通路显著抑制Ang II-induced纤维化反应。综上所述,目前的结果表明,ds - 201防止Ang II-induced分化的心房纤维母细胞通过下调myofibroblasts TGF -β1信号通路。

根据我们目前的研究结果和那些发表的报告,可想而知,ds - 201对于心房纤维化的预防和治疗有一定的意义。然而,潜在的机制,特别是ds - 201的目标,尚未完全阐明。因此,需要进一步的调查,以便更好地探索ds - 201的治疗潜力。

5。结论

总之,我们已经描述了ds - 201的保护作用和II-induced myofibroblasts心房纤维母细胞的分化和分子机制参与本研究。我们的数据表明,ds - 201阻止Ang II-induced心房纤维化通过抑制氧化应激和抑制TGF -β1信号通路。这些新的发现表明ds - 201的潜在应用纤维化疾病的预防和治疗的临床实践。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Tangting陈,李妙乐,Xuehui风扇进行了实验。骏程进行了数据分析。金立群小王和小君程设计的实验和写的手稿。

确认

这项工作得到了泸州城科技办公室的基础(2015 - 42)。作者欣然承认杨Yan博士(医学电生理学的教育部重点实验室和研究所的心血管研究、西南医科大学)提供钠tanshinone花絮磺酸盐。

补充材料

这个辅料文件包含4位数。这些结果显示ds - 201的影响αsma,胶原蛋白,胶原蛋白三世,TGF -β1表达和ROS生成。补充图1:ds - 201的影响αsma表达。心房纤维母细胞暴露在ds - 201(0、5、25、50和100μ米)24 h,然后的表达α分析了sma西方墨点法。补充图2:ds - 201的影响第三我胶原蛋白和胶原蛋白的表达。心房纤维母细胞暴露在ds - 201(0、5、25、50和100μ米)24 h,然后我胶原蛋白和胶原蛋白的表达三世被免疫印迹分析。补充图3:ds - 201在ROS生成的影响。心房纤维母细胞暴露在ds - 201(0、5、25、50和100μ米)1 h,然后ROS的产生是衡量DCFH-DA染色。补充图4:ds - 201在TGF -的影响β1的表达。心房纤维母细胞暴露在ds - 201(0、5、25、50和100μ米)24 h,然后TGF -的表达β1被免疫印迹分析。(补充材料)