氧化应激在自闭症儿童改变红细胞形状没有损失的定量蛋白质变化和膜磷脂不对称

文摘

红细胞(红血球)从灾民自闭症谱系障碍(asd)是氧化应激的一个目标。通过扫描电子显微镜,我们分析了22个自闭症儿童和红细胞形态学显示在这里,只有47.5±3.33%的加拿大皇家银行显示典型的两面凹的形状,而不是87.5±1.3%(平均±标准差)红细胞从性别和年龄的21岁健康正常发展(TD)控制。Codocytes和星形细胞约占30%的异常形状的ASD红细胞。红细胞形态变化是独立使用的抗凝剂(Na₂edta或肝素)和不同的处理程序之前的戊二醛固定,因此这表明他们没有出土文物。孵化24 h的抗氧化剂在大多数红细胞ASD患者恢复正常形态。由Coomassie染色以及免疫印迹分析membrane-cytoskeleton相关蛋白质发挥关键作用的组织,我们无法找到RBC鬼组成ASD和正常人之间的差异。磷脂酰丝氨酸(PS)暴露在细胞外膜域检查基底和erythroptosis-inducing条件。之间没有差异被发现ASD和TD样品除非aminophospholipid移位酶被N-ethylmaleimide,所增加的PS被发现在加拿大皇家银行面临外膜ASD。这些复杂的数据讨论了当前的理解的光氧化应激的模式可能会影响红细胞的形状在自闭症和其他病理条件。

1。介绍

红细胞质膜具有独特的属性,允许细胞提供一个扩展的表面气体交流与接受被动变形大,同时通过狭窄的毛细血管红细胞挤压本身,其中一些与横截面的直径的三分之一。这些不同寻常的特性是由于结构的复杂性网络支持质膜磷脂双分子层是固定在一个二维血影蛋白通过蛋白质交界中心集中在六角晶格带3,阴离子交换通道。两个主要的复合物与细胞骨架连接带3血影蛋白网络,复杂锚蛋白和肌动蛋白复杂,但是,根据最近的一项评估(1),这些带3蛋白复合物的组成不是常数。在总体上,红细胞膜含有约20个主要蛋白质和至少850小的(1]。最近的一篇论文(2]指出nonmuscle肌凝蛋白的角色活动花絮与肌动蛋白网络交互作用,对维持红细胞的形状与乐队3复合物。

膜结构,保证形状弹性和显著生理可变形性,还允许红细胞进行独特的和可逆的形状变化,从discocytes球形地球仪(球形红细胞),或凹(stomatocytes),或皱缩(echinocytes)形状。这些变化引发的各种化学和物理代理(包括pH和ATP浓度)和,在某些情况下,甚至可以发生周期性的序列(3]。在他的论文中,Rudenko [3)广泛探讨红细胞形状过渡,指出两个主要理论试图解释:(i)是一种基于生物膜的双层夫妇,这表明任何影响,扩展了外层膜相对于内部产生一个倾向于形成凸结构在细胞表面(例如,echinocytic针状体),而扩大内在传单相对于外在的支持凹陷了(例如,stomatocytic形状)4,5];(2)另一种基于带3构象的改变,从而改变细胞内的离子成分(6,7]。然而,最近的研究(8]挑战当前理论连接在一个直接的方法红细胞形状改变membrane-cytoskeleton网络的干扰。

一些病理条件与特征相关红细胞形状改变,在方差Rudenko的转换,往往随时间是稳定的(9]。例如,典型的棘手的红细胞在neuroacanthocytosis(棘细胞)是普遍,一群罕见遗传疾病(10];遗传性球形红细胞症,elliptocytosis, stomatocytosis红细胞疾病造成的突变基因编码的各种膜和骨架蛋白(11];codocytes beta-thalassemia[是很平常的事情12),也表现为氧化应激(13]。靶细胞和其他异常红细胞形状但患者被发现(14),遗传神经发育障碍伴有氧化应激和缺氧。明显缺乏beta-actin后来从这些患者红细胞中描述15]。相同的团队还描述红细胞形状异常的存在,那么令人信服的方式,减少beta-actin表达(即“经典”。nonsyndromic)自闭症患者(16]。“古典”自闭症是最常见的神经发育障碍的特点是社会和行为障碍和集体叫自闭症谱系障碍(asd)。自闭症有普遍的遗传病因;然而,epigenetically代理环境因素(如免疫失调、污染物)似乎有一个关键的角色在疾病的发展17]。氧化应激是自闭症的一种独特的特征(18,19]和深深影响红细胞膜,削弱其流动性,改变它的脂质成分,影响活动Na⁺/ K⁺atp酶(18,20.]。

慢性阻塞性肺疾病患者、慢性氧化应激改变红细胞的形状,但正常的形状是重建后适当的抗氧化药物(21]。同样地,血液中红细胞存储银行导致的累积活性氧(ROS)和氧化丙二醛等产品。随后的氧化应激导致的形成尖锐的细胞(echinocytes),微观的萌芽——和nanovesicles spiculae [22),最终溶血;所有这一切可能会阻止补充抗氧化剂(23]。此外,氧化应激引起PS外化(24与形式),但仍未澄清。

了解氧化应激改变红细胞形态和可能函数需要评估它如何影响乐队3-centered细胞骨架网络。表明氧化应激,以及其他刺激,增加乐队3酪氨酸残基磷酸化,从而显著减少乐队3锚蛋白的亲和力,导致膜骨架结构的破坏,有利于进步的质膜囊泡形成25]。然而,在氧化应激,抗氧化酶peroxiredoxin-2 (Prx2)逐步迁移到红细胞质膜,在同事的氨基域乐队3 (26,27]。乐队3氨基域也监管地方葡萄糖代谢对糖酵解ATP生产或处理,相反,对分子的生产提供抗氧化剂protection-NADPH,谷胱甘肽(28]。因此,PRX2乐队3网站绑定允许同时ATP生产和自己的抗氧化保护细胞膜的网站。

这项工作的目的是了解在ASD红细胞形状改变的程度,其分子基础,以及它如何可能影响红细胞的功能。正如我们最近证明(20.]中的beta-actin红细胞从自闭症儿童TD控制的没有什么区别,我们将我们的注意力转向带3和stomatin的量化。这些蛋白质被选中是因为乐队3细胞骨架组织中有一个关键的角色,而stomatin为数不多的红细胞膜蛋白发现差异表达在ASD白细胞29日]。

2。材料和方法

2.1。主题

22个孩子患有nonsyndromic ASD(17岁男性和5女性、年龄(平均±标准差)7.75±1.87年,年龄范围5.25 - -11.08年)和21正常儿童(14 7男性和女性,年龄(平均±SD) 9.44±1.96年,年龄范围5.25 - -11.83年)被招募Bellaria医院的儿童神经精神病学单位(IRCCS,博洛尼亚)在一个更大的研究当地伦理委员会批准(Azienda USL博洛尼亚,伊莫拉,费拉拉,公元13062年,23/07/2013;普罗特。N.1198 / CE)。这项研究是根据赫尔辛基宣言进行指导方针。书面同意是来自父母以及孩子通过图片和简化信息。nonsyndromic自闭症患者的影响,根据一个完整的临床诊断评估(节选,第五版)和全面的神经系统检查,详细的在之前的手稿,我们组(30.]。此外,患者接受一个完整的儿童评估,包括血液参数的评价和电解质,这排除了缺铁的存在(据报道,偶尔出现在自闭症儿童(31日)、溶血和脾肿大。控制正常(TD)孩子们招募了相同的当地社区和自由的认知,学习,和精神的问题。受试者没有采取任何膳食补充剂或药物在4个月前评估和在一个典型的地中海饮食。人口统计学和临床数据如表所示1(一)和1 (b)。

2.2。材料

除非另有规定,化学分析品位和从Sigma-Aldrich购买,圣路易斯,密苏里州。

2.3。加拿大皇家银行准备和形态学评估

从每一个主题,两个收集血液样本(1毫升),一个在Na₂edta在肝素钠和其他真空采血管。与扫描电镜形态学评价,我们总是把样品1 h内集合。我们比较两个准备协议。在第一个协议,旨在限制细胞的机械应力,30岁μL(全血管被转移到一个埃普多夫1.5毫升、离心机(5分钟100×g)为了单独的等离子体,这是轻轻地去除微量吸液管。细胞被固定在悬挂在寒冷的0.1 2.5%戊二醛磷酸缓冲pH值7.2在室温下2 h。在这一步中,加拿大皇家银行经历了自发沉积。上层清液是轻轻去除微量吸液管,添加磷酸盐缓冲剂,样本保持在4°C到连续的步骤。在“粗糙”协议,30岁μL(加拿大皇家银行暂停后获得聚蔗糖密度梯度和三磷酸盐清洗步骤。红细胞悬架固定在0.1 2.5%的戊二醛磷酸缓冲pH值7.2所描述的更温和的协议。细胞快速洗在pH值7.2 0.15磷酸盐缓冲剂,然后滴暂停沉积在poly-L-lysine-coated盖玻片(32]。一夜之间的附着力进行了潮湿和密封室在4°C。之后,幻灯片被清洗和后缀OsO的1%₄在同一个缓冲区1 h。温柔的进步进行酒精脱水,point-dried和标本是至关重要的。安装后常规扫描电镜存根通过银胶,标本黄金气急败坏,溅射设备(33),最后飞利浦515扫描电镜观察。形态变化是由两个不同的观察者,评估在不同的观测。整个幻灯片被评估,然后二十显微镜领域,对于每一个样本,在同一放大拍摄(1770 x级)。图像被用于红细胞的分类根据其形态。

2.4。体外抗氧化治疗

本研究进行了小组的主题,6 ASD和8道明。红细胞悬浮液从聚蔗糖梯度和洗了三次磷酸盐。红细胞悬浮液中稀释2毫升SAGM存储介质(氯化钠8.77 g / L;腺嘌呤0.169 g / L;葡萄糖9 g / L;甘露醇浓度的5.25 g / L) 250μL红细胞/毫升。三个平行样品,2.5毫升,被播种在6-well文化板块(9.6厘米²/表面积)。红细胞悬液(我)治疗抗氧化剂混合包含8μ(最终稀释)tocotrienol (Carlo Sessa SpA、米兰、意大利)溶解在二甲亚砜浓度1000 x (DMSO)和0.7μ(最终稀释)Q10(环保联合会SpA、Fiorenzuola D 'Arda、意大利)溶解在N, 1000 x N-dimethylformamide (DMF);(2)未经处理的;和(3)添加DMSO + DMF。细胞悬浊液是孵化24小时37°C 5%股份有限公司₂的气氛。40μL当时从每个收集好,离心机(5分钟100×g)删除SAGM解决方案,和固定在2.5%戊二醛扫描电子显微镜如上所述的解决方案。

鬼悬是准备如前所述20.]。

SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)进行了鬼悬浮液;凝胶是半定量的加载(相同体积的包装鬼/ lane),所述[34]。预制梯度凝胶(Mini-PROTEAN TGX没有污点蛋白质凝胶,4 - 15%的聚丙烯酰胺,Bio-Rad实验室、大力神,CA)。一些凝胶染色与考马斯亮Blue-R250 (Bio-Rad大力神,CA)。

西方墨点法后进行了sds - page和转移到硝化纤维膜20.]。以下主要使用抗体:鼠标单克隆anti-beta-actin (C4)(圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯)1:1000稀释;鼠单克隆anti-stomatin (E-5)(圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯)1:1000稀释;和鼠标单克隆SLC4A1 antianion换热器1或乐队3 (IVF12) (DSHB杂种细胞产品IVF12,沉积的DSHB詹宁斯马丁在1:30000稀释)。二次抗体ImmunoPure®山羊Anti-Mouse免疫球蛋白(H + L),过氧化物酶共轭(热科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州),并使用以下稀释:1:1:15000年,5000年和1:20000年,分别。发射极耦合逻辑:西方亮™发射极耦合逻辑(Advansta,门洛帕克,CA)是用于检测。特定的蛋白质带密度量化通过Bio-Rad GelDoc 2000参照肌动蛋白带。

2.5。磷脂酰丝氨酸暴露评价

本研究进行了小组的主题,11 ASD和10道明。磷脂酰丝氨酸(PS)暴露被流式细胞术进行评估。概述的过程由kuyper et al。35之后,小修改。红细胞表面的聚蔗糖梯度稀释后悬挂最初汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院)和分成6管检查以下条件:(1)基底,未经处理的;(2)N-ethylmaleimide (NEM);(3)渗透压休克(OS);(4)操作系统+ NEM;(5)Ca^{2 +}离子载体A23187;(6)离子载体A23187 + NEM。样品(2)、(4)和(6),红细胞表面红细胞容积(30%)与10毫米NEM孵化在37°30分钟。孵化后,样本在哈佛商学院洗,然后连续稀释16%比容之前评估或治疗。操作系统执行16%的比容10分钟在室温下与9 g / 100毫升生理盐水。治疗与Ca^{2 +}红细胞表面离子载体,23187年在16%比容与1毫米CaCl先前加载₂在孵化器3分钟,然后添加离子载体是在4μ米决赛浓度;样本在37°C孵化20分钟,然后用2.5毫米的反应是停止了Na₂edta。细胞被哈佛商学院缓冲+ 1% BSA洗3次。在装货前血细胞计数器样本,样本稀释10毫升磷酸盐,然后1毫升离心(5分钟400×g)和颗粒是孵化FITC-labelled膜联蛋白V使用膜联蛋白V-FLUOS染色设备(瑞士巴塞尔罗氏公司)根据制造商的指示。样本获得的使用与CellQuest FACSCalibur仪器和分析软件(正、意大利)。

2.6。统计分析

数据测试正常使用GraphPad Prism7,采用D 'Agostino-Pearson测试,之后适当的参数测试(学生的t独立数据)或非参数等效(Mann-Whitney)使用。差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。扫描电镜显示改变红细胞形状的红细胞ASD科目

图1显示了红细胞的形态分布在TD和自闭症的孩子。大多数加拿大皇家银行(87.5±1.3%,意味着±SD)从TD儿童正常显示典型的两面凹的形状,仅为47.5±3.33%(平均±SD)红细胞从自闭症儿童。的区别是非常重要的( )。样品之间的极低的变化使得临床特征无法关联形态形状,它显示一个高得多的变化。在异常的红细胞,codocytes和星形细胞是最代表的,而echinocytes相对较少。异常的红细胞形态没有特殊的ASD主题,而ASD主题显示不正常红细胞的形状在一个更高比例的红细胞对健康受试者。代表图像的微观领域形成一个TD和从一个自闭症,以及一个画廊的异常形态图所示2。

值得注意的是,没有发现不同的抗凝剂或使用前缀法程序。

3.2。孵化抗氧化剂恢复正常形态红细胞从ASD科目

体外抗氧化治疗带来的比例混合discocytes从47.5到82%,从而大大恢复正常形态控制水平。代表图像如图3。仅在SAGM孵化或添加DMSO + DMF车辆没有改变原来的红细胞形态。

3.3。鬼蛋白质的定性和半定量的评价没有显示明显的差异ASD和TD科目

鬼提取运行SDS-polyacrylamide梯度凝胶和沾Coomassie蓝色为了让提取的蛋白质成分的概述。如图4在定性,没有区别可以欣赏水平。特别是,乐队4.1和4.2,据报道在ASD白细胞中表达的差异29日在TD],显示相同的染色强度和ASD样本。

我们最近报道说,TD - ASD-derived红细胞没有beta-actin数量不同,根据西方墨点法评估按照最严格的标准执行(20.]。这个结果允许我们引用beta-actin量化其他蛋白质的蛋白质免疫印迹。我们选择评估带3和stomatin,选择建立在介绍中提到的动机。图5代表世行报告结果为两种蛋白质。带强度的两个研究蛋白质,相对于beta-actin量化,是相同的TD -和ASD-derived鬼样。

3.4。磷脂酰丝氨酸暴露似乎并没有在红细胞TD和自闭症的孩子不同,但是添加N-Ethylmaleimide表明自闭症红细胞进行PS增加触发器在基底条件下循环

PS外一侧的本地化的脂质双分子层评估,以评估的趋势从自闭症儿童接受erythroptosis红细胞,结果导致的氧化应激和形态异常,(即在基底条件。,没有任何治疗),当接触渗透压力或钙超载。结果,在图6显示,在PS曝光存在于基底条件下没有区别。然而,当aminophospholipid移位酶被NEM,显著( )增加PS曝光可以欣赏在ASD红细胞,表明在基础条件下,PS flippase积极从事再输入PS外层双分子层。添加NEM渗透压力或红细胞钙超载无法推出从TD和ASD科目红细胞表面之间的任何差异,虽然每个人都应该注意,而高变化百分比PS曝光后操作系统和最大PS曝光对钙超载,这两种情况下增加≈50% PS接触可能被忽视。

4所示。讨论

在目前的工作中,我们解决问题的氧化应激,从而影响自闭症题材以多种方式改变红细胞和质膜(18- - - - - -20.,30.),严重影响红细胞的形状、组成的等离子体membrane-cytoskeletal网络和接受erythroptosis倾向。尽管Ciccoli集团等人报道多个形状异常和减少β肌动蛋白在加拿大皇家银行从“经典孤独症”科目16与高光谱显微术[],我们的经验30.)没有确认形状的存在在很大程度上改变;此外,我们的准确评价β肌动蛋白的内容没有显示红细胞表面之间的差异从TD和自闭症的孩子20.]。通过研究大量的文献红细胞形状变化的决定因素,我们理解,明显缺乏形态变化与高光谱显微术可能是发现归因于所谓“玻璃效果,”被黄(6],可能取消TD和ASD红细胞的形态之间的区别。事实上,当红细胞形状变化是“固定”异常的红细胞蛋白质聚合或集群化,如beta-thalassemia或在镰状细胞性贫血,没有发生“玻璃效应”;另一方面,载玻片的接触等渗压的无缓冲的培养基有利于离子浓度的调整,使得很难区分TD的区别和ASD红细胞形态在新鲜血液样本和标准Giemsa-stained幻灯片。因此,扫描电子显微镜的形态分析更适合红细胞形状改变,所描述的那些群Ciccoli et al。通过仔细研究,考虑一些可能的工件可能影响红细胞的形状,特别是通过比较具有相同形式的自闭症和TD红细胞,我们证实Ciccoli等人的发现在超过一半的红细胞形态异常从自闭症儿童。值得注意的是,这些异常形态(i)独立使用的抗凝,确认只有一个长期保护Na₂edta可能影响红细胞的形状(36),(2)不受重复制备离心,在缓冲盐进行。值得注意的是,加拿大皇家银行从ASD没有显示奇怪的或独特的形态;而是有较高比例的改变形态中发现小红细胞从TD科目的金额。特别是,人们会期望找到echinocytes患病率,因为有许多报道实例discocytes暴露于氧化应激变成echinocytes [25,26]。然而并不是这种情况患者红细胞,尽管他们接触ROS是毋庸置疑的。我们认为ASD RBC echinocyte形状,因为他们不承担不宽松的ATP,至少在一定程度上失去了红细胞在上述氧化应激模型。

鬼的眼睛评价蛋白质分离和sds - page的彩色Coomassie蓝色不建议的发生之间的主要差异蛋白质组TD和ASD科目。这是证明了我们β肌动蛋白(20.),带3和stomatin在当下的工作。然而,为了研究≈870种不同的蛋白质位于红细胞质膜和发现可能的表达式TD和ASD对象之间的差异,每个人都应该使用一个使方法;蛋白质组学允许莫汉蒂et al。37)在加拿大皇家银行找到许多差异表达的蛋白质从老年痴呆症患者和健康人。另一方面,利用转录组的方法,Glatt et al。29日)发现数量相关的差异表达基因ASD患者的白细胞。然而,孵化与抗氧化剂混合能够几乎完全恢复正常形态在ASD红细胞氧化应激的修改protein-to-protein协会或膜蛋白本身而不是主要的定量差异。

最明显的罪魁祸首的形态异常会带3蛋白,正如上面所讨论的,在氧化环境中经历多个磷酸化,从而改变其与交界的其他蛋白质复合物(25]。然而,其他蛋白可能参与;例如,它可能值得调查新发现是否actin-myosin花絮”互动(2是受到氧化应激的影响。高级糖化终端产品中发现自闭症儿童的等离子体(19),但在ASD糖化蛋白的存在红细胞没有评估。例如,血影蛋白很容易糖化(38),其糖化将正常出现在稳态条件下,由于high-glucose浓度和红细胞的富氧环境。血影蛋白糖化发生在PS绑定的网站;因此,PS的易位从内到外脂质单层不仅提供了依据erythroptosis也有利于spectrin-based膜骨架的改变,细胞的形状修改和可变形性下降。这类事件不会发生在稳态条件下自ATP-powdered aminophospholipid移位酶不断搬迁PS内膜面(39]。在一个小鼠模型β地中海贫血(13),氧化应激导致大规模的PS外化和红细胞的损失。的确,我们仪数据不仅强烈建议增加PS外化ASD红细胞也有效的对比的活动aminophospholipid移位酶。

5。结论

据我们所知,到目前为止,氧化应激在ASD儿童不是红细胞内产生,可能是由于慢性低级(神经)炎症。尽管广泛的形状异常,增强的双分子层刚度,减少活动的Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶,需要增加补充ATP供应需要维护一个加速活动aminophospholipid移位酶,令人意外的是,氧化应激在红细胞水平似乎是有限的后果,没有临床所显示的迹象减少红细胞活动(例如,受损的外围组织氧化)一直到目前为止所描述的自闭症患者。

在纯粹的投机级别,我们之前的假设所扮演的关键角色可能PRX2的n端结构域的相互作用带3。氧化应激促进迁移的PRX2膜及其绑定乐队3 n端结构域,葡萄糖代谢处理对糖酵解ATP生产的时间更长的分数或多膜位置,因此提供所需的能量维持膜磷脂对称。此外,红细胞抗氧化防御红细胞表面非常丰富,能够应付许多外源活性氧带来的威胁。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢孩子们贡献了一个血液样本和他们的家庭。目前的工作是完全支持的ANGSA (Associazione重回Genitori Soggetti Autistici)。

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