文摘
骨髓增生异常综合征(MDS)是一个异构群克隆干细胞疾病的特点是血球减少和发育不良。贫血是MDS患者最常见的症状。Mitophagy和线粒体功能障碍可能参与MDS的发展。在这项研究中,我们调查了改变的mitophagy MDS患者的红细胞前体细胞。我们发现NIX-mediated mitophagy受损在骨髓有核MDS患者的红细胞(NRBC),与受损的线粒体的数量增加和增加活性氧水平可能导致细胞凋亡和无效的红细胞生成。结果表明,在GlycoA线粒体的数量+NRBC积极与环形铁粒幼红细胞的计数骨髓样本。与此同时,在GlycoA LC3B autophagy-associated水平的标志+NRBC与血红蛋白(Hb)水平正相关,并在GlycoA线粒体的数量+NRBC与Hb水平负相关高危MDS患者。我们的研究结果表明,mitophagy可能涉及与MDS贫血的发病机制相关。自噬可能是小说在MDS患者的治疗目标。
1。介绍
骨髓增生异常综合征(MDS)是一个异构群克隆干细胞疾病的特点是无效的和发育异常的造血作用[1]。MDS患者的最常见症状是贫血2]。贫血中有多个潜在的机制与MDS,不良反应等促红细胞生成素(EPO) [3),改变GDF11-mediated Smad2/3信号(4,5),和基因突变6]。最近,一些研究人员报道,线粒体DNA突变小鼠可以开发macrocytic贫血MDS-like表型(7]。线粒体功能障碍也可能导致红细胞发育不良或巨成红细胞性贫血8]。
Mitophagy,出现有缺陷的线粒体损伤或压力后,是有选择性的线粒体自噬降解。通过消除和降低线粒体去极化的,mitophagy中扮演着一个关键的角色在维持健康的线粒体池(9,10]。之间存在着函数关系mitophagy和分化的造血干细胞(HSC) [11]。因此,mitophagy受损可能导致MDS的发展。
在这项研究中,我们调查了改变mitophagy和mitophagy-associated标记红细胞前体细胞的MDS患者探索之间的关系受损mitophagy与MDS和贫血的发病机制相关。
2。材料和方法
2.1。病人的特点
共有54 MDS患者血液学部门新诊断的天津医科大学总医院、天津,中国,参加本研究从2015年7月到2016年7月。这个研究包括30男性和24岁女性平均年龄为60.5(范围27 - 79年)(表1)。这些MDS病例分类根据世界卫生组织(世卫组织2008年)骨髓肿瘤分类和急性白血病:难治性贫血(类风湿性关节炎: ),耐火嗜中性白血球减少症(RN: ),RA环形铁粒幼红细胞(rar: ),耐火血球减少与多个发育不良(RCMD: ),过剩的RA爆炸1型(RAEB-1: ),RAEB-2 ( )和德尔(5 q)综合征( )。基于国际MDS预后评分系统(入侵),有四个组:低风险组( ),intermediate-risk-1集团(= 1: );intermediate-risk-2集团(INT-2: )和高危人群( )。MDS患者分为两组:低风险组(低风险和intermediate-risk-1例)和高危人群(intermediate-risk-2和高风险的情况下)。
33 non-MDS病例没有贫血(免疫血小板减少 ,原发性粒细胞减少 )被选为控制在这项研究中,其中包括13名男性和20名女性的平均年龄52岁(范围24 - 74年)。
本研究经伦理委员会批准的天津医科大学总医院。通知书面同意从所有患者获得和控制或其监护人依照《赫尔辛基宣言》。
2.2。流式细胞术(FCM)
骨髓样本收集MDS患者的肝素抗凝管和控制。有核红细胞(NRBC)沾FITC / APC / PE-anti-GlycoA(美国BD生物科学)。检测细胞内的内生NIX和microtubule-associated蛋白质1-light链3 (LC3B) GlycoA+NRBC样本孵化与兔子反无主的抗体(美国LSBio)和兔anti-human-LC3B-PE抗体(细胞信号技术,美国)15分钟。与PBS洗涤后,样本孵化用鼠标anti-rabbit二级抗体共轭R-Phycoerythrin(美国BD生物科学)20分钟。GlycoA线粒体染色+NRBC被贴上100海里MitoTracker深红色(美国生活技术MTDR) 37°C 30分钟(12]。分析线粒体去极化,GlycoA+NRBC沾染了200人μM JC1(美国生活技术)37°C为30分钟。测量细胞内ROS水平,GlycoA+NRBC洗和resuspended染色缓冲和5 - (6)-chloromethyl-2加载 ,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸,乙酰酯(H2美国σDCFDA)在黑暗中30分钟37°C和5%股份有限公司2。细胞内荧光产品被FCM立即测量。超过30000细胞获得使用FACSCalibur流式细胞分析仪(美国BD生物科学)和分析使用CellQuest软件3.1版本软件(美国BD生物科学)。
2.3。自噬小体中观察到NRBC
排序后GlycoA微(力量、德国),排序GlycoA的纯洁性+NRBC超过95%(图1(一))。调整1×10的细胞密度6/毫升,l毫升细胞悬液孵育1毫升monodansylcadaverine (MDC, 0.05更易/ l) 37°C和5%的公司245分钟。修复免疫染色为10分钟后,自噬小体在使用荧光显微镜下观察绿色荧光(奥林巴斯、日本)。如果有超过3细胞自噬小体,那么这些被定义为autophagosome-positive细胞。细胞总数是200细胞和autophagosome-positive细胞的百分比计算。每一个实验至少重复3次。
(一)
(b)
(c)
2.4。免疫荧光
修复后,胎膜破裂,和堵塞2% BSA, GlycoA排序+NRBC涂片与rabbit-anti-human孵化LC3多克隆抗体(1:200稀释,细胞信号技术,美国)一夜之间在4°C和PBS洗3次(5分钟)。然后,卡瓦与PE-labeled孵化mouse-anti-rabbit二级抗体(1:500稀释,细胞信号技术,美国)在室温下与PBS 60分钟,洗3次(10分钟)。后的20倍μl antifluorescence安装媒体,在GlycoA LC3蛋白的表达+NRBC由荧光显微镜观察(奥林巴斯、日本)。如果有超过3 LC3的细胞,那么这些被定义为LC3-positive细胞。细胞总数是200细胞和LC3-positive细胞的百分比计算。每一个实验至少重复3次。
2.5。实时定量Transcriptase-Polymerase连锁反应(Q-PCR)
GlycoA+NRBCs被GlycoA排序微(力量、德国)。总RNA提取使用试剂盒(豆类生物USA Inc .),使用逆转录酶和cDNA生成工具(豆类生物USA Inc .)。基因表达式被Q-PCR量化(SYBR®预混料交货Taq II,豆类生物,中国)。引物序列如下:AMPK向前5-TTGAAACCTGAAAATGTCCTGCT-3 ,反向5-GGTGAGCCACAACTTGTTCTT-3 ;ULK1向前5-ACAGAGACCGTGGGCAAGT-3反向5-CGACCTCCAAATCGTGCTT-3 ;mTOR向前5-GCAGATTTGCCAACTACC-3 ,反向5-CACGGAGAACGAGGACA-3 ;和GAPDH向前5-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ,反向5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 。②生成相对量化的基因表达,2−ΔΔCt方法: 。
2.6。免疫印迹(WB)
排序GlycoA的蛋白质+NRBC溶解提取的缓冲区(生物技术,北京)。蛋白质浓度测定用皮尔斯BCA分析工具包(美国热科学)。样本分离12% sds - page凝胶,然后转移到PVDF膜(PE、美国)Trans-Blot电池系统(美国Bio-Rad)使用标准的西方墨点法程序。膜与一只兔子反探测TOM20抗体细胞信号技术,13929,(美国)在1:1000和孵化一夜之间在4°C。兔子反β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术公司,sc - 47778,美国)在1:5000年作为加载控制。山羊anti-rabbit免疫球蛋白HRP-conjugated二级抗体(圣克鲁斯生物技术公司,sc - 2054,美国)是在室温下培养1小时。洗后,电化学发光(ECL)试剂(美国32106号热科学)是用于化学发光。
2.7。统计分析
所有数据使用SPSS 21.0进行分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。数据被当作平均数±标准差。方差分析分析用于三个独立的团体。皮尔森相关分析用于分析相关,而斯皮尔曼相关分析是用于非正态的分布数据。被定义为统计意义 。
3所示。结果
3.1。自噬在GlycoA+NRBC减少高危MDS患者
自噬小体在GlycoA+NRBC MDC高危MDS组中观察到(1.83±0.46%)减少与控制(3.78±0.58%, )。没有显著区别控制和低风险的MDS组(2.78±0.92%, )(图1 (b))。在GlycoA LC3表达式+NRBC的高危MDS组(1.45±0.32%)低于对照组(3.03±0.45%, )。没有显著区别控制和低风险的MDS组(2.68±0.65%, )(图1 (c)和补充图1)。
3.2。的Mitophagy GlycoA+NRBC减少高危MDS患者
mitophagy受体的表达NIX和GlycoA LC3B+NRBC减少高危MDS患者。在GlycoA NIX的表达+NRBC高危人群( ,0.61±0.24)低于控制( ,0.79±0.16, )和低风险组( ,0.81±0.15, )。有控制和低风险组之间无显著差异( )(图2(一个))。在GlycoA LC3B的表达+NRBC在高危MDS患者( ,0.22±0.12)低于控制( ,0.43±0.22, )和低风险MDS患者( ,0.40±0.16, )。有控制和低风险组之间无显著差异( )(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。自噬调节基因的mRNA表达Q-PCR衡量
自噬的mRNA表达发起人genes-AMPK和ULK1-in GlycoA+NRBC减少高危MDS患者。在GlycoA AMPK mRNA的表达+NRBC高危人群( ,0.53±0.61)低于控制( ,1.51±1.25, )和低风险组( ,1.55±1.70, )。有控制和低风险组之间无显著差异( )(图3 (b))。在GlycoA ULK1 mRNA的表达+NRBC高危人群( ,0.64±0.91)低于控制( ,2.70±3.27, )和低风险组( ,4.98±4.76, )。有控制和低风险组之间无显著差异( )(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
自噬抑制基因的mRNA表达gene-mTOR GlycoA+NRBC在高危组( ,2.81±2.80)高于对照组( ,1.29±0.81, )和低风险组( ,0.85±0.74, )。低风险组之间没有显著差异和控制( )(图3(d))。
3.4。GlycoA线粒体功能障碍+NRBC MDS患者的测量
线粒体的数量在GlycoA (MTDR荧光水平)+NRBC高危人群( ,937.17±707.85)高于控制( ,513.49±372.33, )和低风险组( ,461.74±438.02, )。有控制和低风险组之间无显著差异( )(图4(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
线粒体跨膜电位(Δ的水平Ψ米)GlycoA+NRBC高危人群( ,0.33±0.18)低于控制( ,0.61±0.32, )和低风险组( ,0.61±0.34, )。有控制和低风险组之间无显著差异( )(图4 (b))。
在GlycoA活性氧的水平+NRBC高危人群( ,438.65±322.83)高于控制( ,242.77±136.87, )和低风险组( ,197.40 + 95.07, )。有控制和低风险组之间无显著差异( )(图4 (c))。
线粒体外膜蛋白的表达在GlycoA TOM20+NRBC高危人群( )高于控制( )( )。没有显著区别高危组和低风险组( )(图4 (d))。
3.5。相关分析与改变线粒体功能和MDS患者的临床特点
在高危MDS组,在GlycoA线粒体的数量+NRBC积极与环形铁粒幼红细胞的计数骨髓样本( , , )(图5(一个))。在GlycoA LC3B水平+NRBC与血红蛋白(Hb)水平呈正相关高危MDS患者( , , )(图5 (b))。在GlycoA线粒体的数量+NRBC与Hb水平负相关高危MDS患者( , , )(图5 (c))。GlycoA ROS水平+NRBC与Δ负相关Ψ米( , , (图)在高危MDS病人5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
MDS是一群克隆造血干细胞疾病的特点是血球减少,发育异常和高危急性髓系白血病(AML)的转换。最近的研究报道,自噬的损失在小鼠造血干/祖细胞导致骨髓衰竭和发展与年龄相关的线粒体疾病,如MDS / AML [7,13]。自噬,称为压力的适应性反应,是一个重要的方式有序降解和回收包括线粒体(细胞组件14- - - - - -16]。Mitophagy扮演一个重要角色在线粒体间隙网织红细胞成熟(17- - - - - -20.]。mitophagy受损和线粒体功能障碍可能参与无效MDS造血作用。
Mitophagy可以检测到线粒体蛋白质的降解和自噬标记如LC3B [21]。光chain-3 Microtubule-associated蛋白1 (LC3),现在作为可溶性形式(LC3A)在细胞质中,转化为一种lipidated (LC3B)一直被认为是一个autophagosomal标记在自噬激活(22,23]。
BCL2-related蛋白NIX,调节红细胞分化过程中,是一种线粒体外膜蛋白,作为线粒体受体(24]。无基因敲除小鼠可以获得温和,不致命的贫血(19]。减少NIX表达抑制mitophagy减少NIX调解自噬小体的能力。从巴西的一项研究确定的拒绝表达总在MDS和AML患者骨髓细胞25]。结果表明,拒绝降低RAEB-1 / RAEB-2 MDS患者相比健康的捐赠者。显著减少NIX的成绩单也观察到在AML myelodysplasia-related变化(AML-MRC)和新创AML而健康的捐赠者。此外,低NIX表达式是一个独立的预后因素总生存期(OS)。
在我们的研究中,我们分析了自噬小体的变化mitophagy标记MDS患者的红细胞前体细胞。NRBC的自噬水平是减少高危MDS患者与正常对照组相比。NIX和LC3B NRBC的表达显著降低高危MDS组与低风险MDS组和控制。这意味着缺陷mitophagy发生在MDS患者的红细胞前体细胞。
有多种蛋白激酶调节自噬,如雷帕霉素复杂1 (mTORC1), AMP活化激酶(AMPK)和ULK自噬蛋白。mTORC1充当主要检查点调控自噬通过PI3K / Akt通路(26]和AMPK [27,28]。mTOR和AMPK调节自噬通过磷酸化的抑制ULK1/2 [29日]。ULK可以使磷酸化,激活Beclin-1 [30.]。ULK Beclin-1复合物可以激活的激活下游信号的自噬组件(31日- - - - - -33]。轻度贫血的情况下还发现ULK1缺席导致延误取消红细胞细胞的线粒体和核糖体。mTOR的异常激活红细胞可能诱发proteasome-mediated ULK1退化,导致线粒体缺陷间隙和红细胞大红细胞症(20.]。Li-Harms et al。13岁]报道mtDNA突变的积累mtDNA突变小鼠。同时,mTOR的异常激活红细胞导致线粒体dna突变老鼠通过抑制mitophagy贫血早期红细胞祖细胞和线粒体间隙中成熟的红细胞。
在我们的研究中,我们测试了自噬调节基因的mRNA表达NRBC MDS患者和控制。它表明mRNA的表达AMPK和ULK1高危MDS组显著低于低风险MDS组和控制。mTOR mRNA表达高危MDS组显著高于低风险MDS组和控制。我们推断,增加mTOR NRBC可能抑制自噬,促进线粒体异常积累,最后导致MDS贫血。然而,也有可能,线粒体功能障碍可以激活mTOR NRBC的抑制自噬的水平。
线粒体自噬被毁后,积累在不同细胞(34]。小鼠模型中的自噬基因Atg7 HSC淘汰赛,线粒体积累在Atg7−−/Δ红细胞与改变Ψ米导致细胞死亡和贫血是类似于MDS表型(35]。TOM20蛋白,一种线粒体外膜蛋白,是一个重要的受体在线粒体蛋白导入36]。增加TOM20表明线粒体的数量增加,线粒体自噬是有缺陷的。
在这项研究中,我们发现在GlycoA线粒体的数量+NRBC增加高危MDS组,表明减少mitophagy NRBC。TOM20高危MDS组也显著高于控制和低风险的MDS组,这表明,线粒体NRBC的积累。
另外,大多数细胞线粒体ROS(约90%)是由(37]。线粒体的数量可能会增加伴随ROS增加生产。然而,增加活性氧的水平可能会损害线粒体和核基因组将诱导细胞凋亡38,39]。在细胞凋亡的早期阶段,线粒体膜电位下降。可能会有直接或间接的自噬和凋亡之间的串扰16,40]。Raza et al。41)分析细胞凋亡在50 MDS患者骨髓活检样本。细胞凋亡是很容易观察到红色的祖细胞和其他细胞从骨髓。他们认为广泛的髓内细胞死亡可能解释的悖论全血细胞减少症尽管hypercellular MDS患者骨髓。其他研究人员报道,积累MDS患者的线粒体铁导致无效造血作用[42]。
在我们的研究中,我们发现高危MDS组ROS水平较高和较低的相比,NRBC线粒体跨膜电位的控制和低风险的MDS组。我们的研究结果还表明,在GlycoA线粒体的数量+NRBC积极与环形铁粒幼红细胞的计数骨髓样本。此外,与ΔROS水平负相关Ψ米在MDS患者。我们假设受损的线粒体的积累与ROS增加MDS NRBC的生产可能会导致早期细胞凋亡和无效的红细胞生成。
在相关性分析中,我们的研究结果表明,NRBC LC3B水平与Hb水平正相关,与线粒体的数量NRBC与Hb水平负相关高危MDS患者。这里,我们推断,红细胞前体mitophagy受损可能是贫血发病机制相关MDS患者的风险增加。进一步的研究需要进行。
临床试验报道,西罗莫司,一种mTOR抑制剂,是有效的在一个子集的先进MDS患者通过激活自噬(43]。在另一项研究中,阿扎胞苷能促进细胞凋亡和自噬作为治疗高危MDS患者。这些结果表明,针对自噬可能有一个活动在MDS患者的治疗。
综上所述,我们发现NIX-mediated mitophagy在MDS患者的红细胞前体细胞受损,受损的线粒体的数量增加和增加ROS水平可能导致早期细胞凋亡和无效的红细胞生成。线粒体数量的增加在贫血NRBC低度负相关,特别是在高危MDS患者。这些结果表明,mitophagy可能包括贫血的发病机制与MDS有关,和自噬可能是小说在MDS患者的治疗目标。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Huijuan江泽民和杨Liyan贡献同样这项工作。Huijuan江和杨Liyan进行研究和分析数据。标准起草王设计研究,确保数据的正确分析,写的手稿。Gaochao张、郭贾丽芳港兴,春燕Liu和Zonghong邵协助的设计研究,负责收集数据,导致了写作的手稿。所有作者批判修订后的手稿,并最终批准的手稿。
确认
这个项目是由中国国家自然科学基金(81170472号,81400088,81570111,81500101)和应用基地和先进的技术研究项目天津(14 jcybjc27200号09 jcybjc11200)。
补充材料
补充图1:GlycoA LC3表达式+NRBC MDS的治疗和控制与雷帕霉素和3-methyladenine (3-MA)。(补充材料)