文摘

这次调查的目的是研究药物的影响与氰化钾PostC (KCN)功能恢复、基因表达、细胞色素c表达式,和氧化还原状态的孤立的老鼠的心脏。老鼠被分为控制和KCN组。男性的心纯种白化病老鼠逆行灌注根据Langendorff技术的不断灌注压力70而言不啻2o .稳定后,控制心受到全球缺血(5分钟),其次是再灌注(5分钟),而实验的心接受全球缺血(5分钟)5分钟再灌注的10紧随其后μmol / L KCN。心脏功能测量以下参数:最大和最小的发展压力,收缩期和舒张期左心室压力,心率,冠状流。水平的超氧化物阴离子自由基、过氧化氢、亚硝酸盐,和脂质过氧化反应指数(衡量硫代巴比土acid-reactive物质)测定在冠状静脉流出物,和过氧化氢酶的活性在心脏组织决定。伯灵顿,bcl - 2, SOD-1 SOD-2,细胞色素c进行了研究。表明,伯灵顿的表情,bcl - 2,和SOD-2基因组之间没有显著差异,而SOD-1基因的表达和细胞色素c KCN组低。我们的研究结果表明,KCN改善心肌收缩性的恢复和收缩期和舒张功能,增强过氧化氢酶活性,减少代prooxidants。然而,所有可能的机制和潜在的副作用KCN今后应该进一步检查。

1。介绍

现在发病率和死亡率的主要原因是心血管疾病。急性心肌梗死可能代表了最常见的品种在这个病理生理实体由于减少冠状动脉血流和心肌缺血。可用于挽救心肌再灌注策略,不过立即再灌注缺血心肌组织的矛盾会进一步损害称为“再灌注损伤现象。“投入了很多努力找到有效的方法来减少再灌注损伤(1,2]。

后处理(PostC)是一种策略,通过接触提供了心脏保护尚不致命的刺激开始出现再灌注。两个基本技术的心肌缺血性PostC PostC涉及和药理PostC [3]。开创性的研究给了第一个数据对缺血性PostC是由赵和同事约十年前。据报道,短暂的I / R应用于早期回流可以适用的场合,如动脉搭桥手术,器官移植,外围血管再生(4]。缺血性的有益作用PostC涉及推迟逆转酸中毒,激活的蛋白激酶C (PKC),形成内分泌物,如腺苷、缓激肽和释放内源性阿片类物质(5]。此外,激活线粒体K三磷酸腺苷通道和关闭线粒体渗透性转换孔也可能导致心脏保护(6]。缺血性PostC的积极作用可能是通过降低NO-peroxynitrite介导的信号,以及内生H2年代生产的刺激PKC -α和PKC -ε(7]。此外,缺血性PostC可能减少活性氧簇(ROS)的有害影响,记住氧化破裂再灌注期间仍是负责再灌注损伤的主要因素之一(8]。缺血性PostC是一种适应性反应引起的短时间缺血与短期交替的再灌注应用持续缺血后再灌注开始时;然而,类似的效果也可以由药物引起(9]。

氰化物是一个快速充当致命毒药可以以各种形式存在(气体、固体和液体)。其毒性的主要机制在于抑制线粒体细胞色素c氧化酶(CcO),一种酶参与终端形成复杂的呼吸链中不可或缺的生产三磷酸腺苷(ATP)。因此,细胞无法使用氧气和ATP导致细胞功能障碍和死亡(10,11]。有趣的是,氰化钾(KCN)应用在一个小浓度可能减弱心肌功能障碍,降低生产活性氧(ROS)在心脏预处理的模型(12]。

关于以上声明,提出本研究的目的是检查的影响KCN PostC药理模型的功能恢复和氧化压力参数的孤立的老鼠的心脏。

2。材料和方法

2.1。伦理批准

这项研究是在心血管医学科学学院的实验室,塞尔维亚Kragujevac大学。实验协议经伦理委员会批准了实验动物的福利的医学科学,Kragujevac大学。根据欧盟指令所有实验进行实验动物的福利(86/609 / EEC)和良好实验室规范(GLP)的原则。

2.2。动物

十六岁男性纯种白化大鼠(八周大,体重200 - 250克,从军事医学科学院,贝尔格莱德,塞尔维亚)受到研究的协议。老鼠被安置与22±2°C的温度调整12:12光/暗周期。他们消费商业老鼠食物(20%的蛋白质的老鼠食物,兽医研究所苏博蒂察,塞尔维亚)和自来水随意。

2.3。制备的孤立的老鼠的心脏

男性的心纯种白化病老鼠,分为控制和KCN组每组(8),切除和逆行灌注根据Langendorff匈牙利布达佩斯的技术(Experimetria有限公司,1062)。短期麻醉诱导后腹腔内应用氯胺酮(10毫克/公斤)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤),术前用药法与肝素抗凝,牺牲了动物颈椎脱位(第一级的动物(科学程序)法案1986年,英国)。后紧急开胸心脏骤停和快速通过与冰冷的等渗盐水过冷,心被迅速切除;主动脉插管,逆行灌注在一个常数灌注压力下(CPP) 70而言不啻2o .的组成nonrecirculating Krebs-Henseleit灌流液是如下(更易/ L): 118年氯化钠,氯化钾4.7,CaCl2×2 h22.5 O, MgSO4×7 h21.7 O, NaHCO325日,KH2阿宝41.2、葡萄糖11和丙酮酸2,平衡O为95%2+ 5%股份有限公司2和加热到37°C (pH值7.4)。

2.4。生理实验和实验协议

所有学习小组进行了30分钟的CPP 70而言不啻灌注2O(稳定)的时期。在对照组,在稳定时期之后,心中受到全球缺血灌注完全停止5分钟,5分钟再灌注的紧随其后。KCN组稳定时期之后,心中接受全球缺血持续5分钟,然后提交给5分钟再灌注的10μmol / L KCN [13]。

将传感器(换能器bs473 - 0184后,Experimetria有限公司,布达佩斯,匈牙利)在左心室心肌功能的以下参数测量在稳定和再灌注期间:左心室最大的压力发展(dp / dt max),左心室的最低比率的压力发展(dp / dt min),收缩期左心室压力(SLVP),左心室的舒张压(DLVP)、心率(HR)。冠状流(CF)测量flowmetrically在特定的兴趣点在控制小组稳定,在再灌注(R1)的第一分钟,而在最后一分钟的再灌注(R2)——KCN小组稳定,在再灌注(R1)的第一分钟,在最后一刻再灌注(R2)。对照组的平均心脏重量和KCN组非常相似(对照组- 1.1±0.02,KCN组(1.06±0.09)。

以下氧化压力参数测定spectrophotometrically(日本岛津制作所uv - 1800)使用冠状静脉废水的收集样本:脂质过氧化的指数,衡量硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS),亚硝酸盐(NO2−),水平的超氧化物阴离子自由基(O2−)和过氧化氢(H2O2)。

2.5。测定脂质过氧化指标的测量TBARS

脂质过氧化的程度冠状静脉流出物被测量TBARS估计,使用1%的硫代巴比土酸0.05氢氧化钠,孵化与冠状动脉流出物在100°C 15分钟和以530海里。Krebs-Henseleit解决方案作为一个空白的探测器(14]。

2.6。亚硝酸盐测定(不2−)

一氧化氮(NO)分解迅速形成稳定的亚硝酸盐/硝酸盐产品。无2−水平测量和用作生产指数,使用格里斯试剂。总共0.5毫升的灌流液沉淀了200年μL 30% sulphosalicylic酸,涡30分钟和离心机 。相同体积的上层清液和格里斯试剂(含1%对氨基苯磺酰胺在5%磷酸/ 0.1%萘ethylenediamine-dihydrochloride)补充说,10分钟在黑暗中孵化,以543海里。没有2−水平计算使用亚硝酸钠作为标准(15]。

2.7。超氧化物阴离子自由基(O的决心2−)

O2−水平测量在530 nm通过硝基蓝四唑反应与冠状静脉流出物三羟甲基氨基甲烷缓冲液。Krebs-Henseleit解决方案作为一个空白的探测器(15]。

2.8。过氧化氢测定(H2O2)

H的测量2O2是基于氧化酚红的H2O2在辣根过氧化物酶的催化反应16]。二百毫升灌流液的沉淀用刚做好的酚红溶液800毫升;10μL(1: 20)的辣根过氧化物酶(立即使用前)随后补充道。空白的探针,足够的Krebs-Henseleit量的解决方案是用来代替冠状静脉流出物。H的水平2O2测量在610海里。

2.9。过氧化氢酶活性测定

完成实验后,所有动物的心被冻结在−80°C,然后每个组织的0.5节在5毫升均质磷酸盐缓冲剂pH值7.4使用电子均质器,在冰上。之后,组织匀浆被离心机 在4°C为20分钟。得到的上层清液分离和储存在−80°C到测定过氧化氢酶(CAT)活性。根据Aebi猫活动的决心。稀释的心脏组织匀浆(1:7v/v)是氯仿处理乙醇(0.6:1v/v)。猫缓冲区,准备样品,10毫米H2O2被用于的决心。检测了360海里。猫的数量被表示为U / g组织(17]。

2.10。在心脏组织的基因的表达

试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示是用于隔离的总RNA。总RNA (μg)是使用高容量反向转录cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司,培育城市,加利福尼亚,美国)。实时定量PCR进行使用热科学Luminaris颜色HiGreen qPCR大师混合(美国加州福斯特城,应用生物系统公司)和SOD-1 mRNA-specific底漆,SOD-2,伯灵顿、bcl - 2,和β肌动蛋白作为管家基因表达载体,卡尔斯巴德,CA)(表1)。PCR反应是在Mastercycler ep realplex(埃普多夫,汉堡,德国)。基因表达数据分析和相对计算根据Schmittgen和Livak [18]。

表1
引物用于存在分析。
2.11。免疫组织化学

牺牲后,心被提取,在10%甲醛固定,沉浸在石蜡。Formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)部分,5μ米厚,deparaffinized、水化和柠檬酸处理缓冲区(pH值6.0)在微波抗原修复。内源性过氧化物酶活动被禁止使用过氧化氢(3%)。免疫组织化学染色法是由孵化FFPE组织部分主要鼠标anti-cytochrome C抗体(338500年,表达载体,卡尔斯巴德,CA)在室温下过夜。染色是可视化利用老鼠和兔子暴露特定合/民建联检测包含IHC工具包(ab80436 Abcam,剑桥,英国)。部分与迈耶的苏木精复染色和显微照片通过光学显微镜(日本奥林巴斯BX51)配备了数码相机。结果给出了平均计数阳性染色细胞每领域×40放大(19]。

2.12。药物

所有药物都购自Sigma-Aldrich化学GmbH,德国。

2.13。统计分析

IBM SPSS 20.0统计窗口是用于统计分析。三个具体的兴趣点进行统计分析两组:第一点是稳定(S),第二次是第一个(R1)和最后一个点的5分钟再灌注期(R2)。描述性统计是用来计算算术平均数与色散量(标准偏差(SD)和标准错误(SE))。值表示为平均值±标准错误(SE)。分布的数据被Shapiro-Wilk测试检查。数据分析使用单向方差分析(方差分析)和事后Bonferroni测试多个比较。的值 被认为是具有统计学意义,而价值观 被认为是高度显著的。

3所示。结果

3.1。Cardiodynamic参数
3.1.1。最大的左心室压力发展(dp / dt max)

在对照组,参数dp / dt马克斯在R1(3192.14±192.74)明显高于相比(2839.08±250.01)。另一方面,KCN组dp / dt马克斯值(2657.08±252.2)和R1(2645.56±220.2)是相似的;然而,注意到在R2显著增加(3370.32±210.3)与(2657.08±252.2)。此外,当控制和KCN组比较,显著降低值被发现KCN组R1为KCN(2645.56±220.2和3192.14±192.74为控制),而在R2值高出统计KCN组为KCN(3370.32±210.3和3063.66±225控制)(图1(一))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图1
KCN后处理对cardiodynamic的影响参数。(a)内和组间比较价值的dp / dt马克斯,(b)组间比较内部和价值的dp / dt, (c)内和组间比较的价值SLVP, (d)内和组间比较的价值DLVP, (e)内和组间比较价值的心率、内(f)比较,各组在冠状流的价值。 统计学意义的水平 在对照组; 统计学意义的水平 在KCN组; 统计学意义的水平 之间的控制和KCN团体;数据意味着±SE。R1:第一分钟再灌注;R2:最后一分钟再灌注。
3.1.2。左心室压力发展的最低比率(dp / dt分钟)

dp / dt最小参数值没有显著变化在对照组(−1780.6±145.96 (S和−1774.88±122在R1和R2−1730.98±112.70)。另一方面,KCN集团内的dp / dt分钟达到更多的负R2(−1989.28±103.1)相比,年代(−1690.6±145.96)。更负的观测参数发现KCN组(−1989.28±103.1)相比,对照组(−1730.98±112.70)R2(图1 (b))。

3.1.3。收缩期左心室压力(SLVP)

在R2 KCN政府后,收缩压显著增加(106.22±2.24)相比,S (90.79±1.68)。值SLVP对照组没有明显变化(94.79±1.68 (S和93.92±4.24在R1和R2为95.1±3.85),以及S(90.79±1.68)之间,KCN R1(86.48±4.37)组。比较之间的R2 KCN(106.22±2.24)和对照组(95.1±3.85),明显高于SLVP值被发现KCN-treated组(图1 (c))。

3.1.4。左心室的舒张压(DLVP)

DLVP保持不变在观察的兴趣点在对照组(1.2±0.16 (S和1.32±0.17在R1和R2为1.26±0.15)。在R1的舒张压值显著增加(1.7±0.13)KCN组相比(1.3±0.16)。显著增加KCN DLVP被注意到的组R1(1.7±0.13)相比,对照组(1.32±0.17)(图1 (d))。

3.1.5。心率(HR)

在对照组,人力资源在R1(307.28±19.46)显著增加,然后下降在R2(264.4±22.91)相比,S (284.7±22.44)。KCN组HR明显高于在R1(314.98±21.75)和S(270.7±22.4)相比,虽然没有区别R2(272.24±33.61)和S(图1 (e))。

3.1.6。冠状流(CF)

观察CF的R2显著下降(9.2±0.88)相比,在对照组(10.6±0.56)。另一方面,KCN组CF在实验时仍然保持不变(10.3±0.56和10.52±0.91在R1和R2 10±0.79)(图1 (f))。

3.2。氧化压力参数
3.2.1之上。脂质过氧化水平的指数(衡量硫代巴比土Acid-Reactive物质(TBARS))

没有区别在任意点的兴趣TBARS水平,无论是在对照组(16.19±2.28 (S和14.72±2.06在R1和R2为13.47±1.76)和KCN组(16.59±2.28和15.6±2.29在R1和R2为14.32±1.91)(图2(一个))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
KCN后处理对氧化应激的影响参数。(a)组间比较内部和TBARS值,(b)内和组间比较的价值2 −,(c)内和组间比较的价值2 −,(d)内和组间比较的价值2O2。 统计学意义的水平 在对照组; 统计学意义的水平 在KCN组; 统计学意义的水平 之间的控制和KCN团体;数据意味着±SE。R1:第一分钟再灌注;R2:最后一分钟再灌注。
3.2.2。亚硝酸盐(NO的水平2−)

在对照组,有显著增加的亚硝酸盐在R2(66.3±7.98)相比,R1(56.36±6.16)和(53.14±5.66)。在KCN治疗组,我们观察到显著增加R1(60.07±7.03)和S(51.14±5.66)相比,在R2(53.07±1.2)相比,R1低。在R2,一个显著的低水平2−KCN组(53.07±1.2)相比,发现在对照组(66.3±7.98)(图2 (b))。

3.2.3。水平的超氧化物阴离子自由基(O2−)

增加啊2−生产R1(92.91±11.25)和R2(89.63±10.83)相比,年代(74.17±10.69)被发现在对照组。此外,KCN组中,有一个下降的程度2−在R2(65.84±7.94)相比,年代(76±10.69)。KCN诱导进一步大幅下降在R2检查参数的水平(65.84±7.94)相比,对照组(89.63±10.83)(图2 (c))。

3.2.4。过氧化氢水平(H2O2)

过氧化氢中没有显著不同的兴趣点在对照组(42.39±7.06和44.88±3.43在R1和R2为40.3±5.46)。另一方面,KCN诱导显著下降,H2O2在R2(30.82±4.29)相比,年代在R1(40.39±7.06)和(42.36±3.72)相比,R2。在R2,显著降低H水平2O2观察KCN组(30.82±4.29)相比,对照组(40.3±5.46)(图2 (d))。

3.2.5。过氧化氢酶活性(CAT)

应用KCN诱导显著增加过氧化氢酶的活性(19.5±2.1)相比,对照组(15.1±1.1)(图3)。


图3
KCN后处理对心肌组织中的过氧化氢酶活性的影响。控制和KCN组之间的比较。 统计学意义的水平 对照组和KCN组之间;数据意味着±SE。
3.2.6。在心脏组织的基因表达

灌注的心KCN导致基因的表达明显降低SOD-1(0.039±0.02)相比,对照组(0.074±0.01)(图4(一))。然而,KCN没有引起显著改变基因表达的伯灵顿在对照组(0.027±0.01和0.026±0.003 KCN组)(图4 (b)),SOD-2在对照组(0.031±0.002和0.021±0.004 KCN组)(图4 (c)bcl - 2),在对照组(0.012±0.006和0.012±0.005 KCN组)(图4 (d)),而对照组。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
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图4
KCN后处理对心肌组织中的基因表达的影响。(a)的相对表达SOD-1基因控制和KCN组(b)伯灵顿的相对表达基因控制和KCN组(c)的相对表达SOD-2基因控制和KCN组,和(d)相对的bcl - 2基因表达控制和KCN组。 统计学意义的水平 对照组和KCN组之间;数据意味着±SE。
3.2.7。细胞色素c的决心

的平均计数阳性染色细胞减少73.3% KCN组(3.08±2.5)相比,对照组(12.42±3.32)(图5)。

(一)
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(b)
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图5
KCN后处理对细胞色素c的影响表现在心脏组织。(一)控制和KCN组对比。 统计学意义的水平 对照组和KCN组之间;数据意味着±SE。(b)的心脏组织细胞色素c免疫组织化学控制和KCN组。

4所示。讨论

药理PostC伟大和提出可行的策略来保护缺血性心脏与预处理类似的保护作用[20.]。由于临床急性心肌梗塞的不可预知性,PostC可能临床潜力大于预处理[8]。据报道,长时间缺血是伴随着线粒体的损伤函数,如CcO活性下降(21,22]。代的ROS在缺血条件下影响酶的活性组成呼吸链复合物,从而导致心脏损伤(23]。然而,CcO的磷酸化,抑制其活动,以及抑制有氧呼吸和ATP利用率,可能参与预防I / R-induced心肌功能障碍(12]。在这个意义上,我们假设KCN, CcO的选择性抑制剂,可以改善心脏的功能被暴露在I / R,当应用于再灌注的发作。我们所知,到目前为止,没有数据的影响KCN药理模型的后处理,在心脏保护机制负责潜在好处。

我们的研究结果清楚地表明,在再灌注的第一分钟,收缩力和心率增加控制条件,但是,这些参数开始减少5分钟以上再灌注。dp / dt max和冠状流的下降在复苏期间按照的要求表明,血管扩张心脏收缩。受损的冠状流和心率在对照组再灌注末证实缺血损害心肌功能。另一方面,KCN的应用,在第一分钟的再灌注,心肌收缩性和收缩功能逐渐恢复,再灌注持续,他们逐步改善,表现为增加dp / dt max和年底SLVP实验。此外,dp / dt分钟达到负值完成5分钟后再灌注,从而表明KCN也增强心脏的lusitropic属性。这个代理阻止ischemia-induced降低心率和冠状流。事实上,对心脏心率不变使足够的时间为有效合同。

大多数的研究检查了KCN对心脏功能的影响主要是在一个模型上进行预处理,而文献数据指的是它的影响在再灌注早期缺乏。之前显示0.5更易/ L KCN cardioplegic解决方案增强心脏功能通过增加压力和收缩性,不影响冠状动脉流量,这与我们的结果(24]。这些作者认为增加左心室收缩的结果是心肌去甲肾上腺素释放的应激反应,增加细胞内钙。其他作者也证实KCN的心血管效应,然而,在预处理的模型(12]。

我们的调查的重点是氧化应激的保护作用的角色KCN PostC模型中,由于生产过剩prooxidants被报道为主要机制I / R损伤心脏(25]。增强生产prooxidants,如O2−也没有2−在对照组发现再灌注期间,预计恢复以来的含氧血液流向缺血性心矛盾其次是增加活性氧的释放和氧化应激(26]。此外,I / R有或没有KCN灌注并不影响脂质过氧化作用,而一代的H2O2和O2−减少再灌注末KCN-treated组。不,包括在冠状流的监管,可能与过度生产O2−阿,这或许可以解释不变的价值观2−注意到初恢复流KCN组。

O2−/小时2O2动态不能被独立的抗氧化剂防御酶的活动,比如猫和草皮。我们发现SOD-1低表达的基因(CuZnSOD),发现存在于细胞质,细胞核和线粒体膜间隙,KCN治疗组(27]。然而,在再灌注急性应用KCN没有明显影响的表达SOD-2 (MnSOD)基因位于线粒体。O2−形成于线粒体可能转化为H2O2自发地或在反应催化杆(28,29日]。的另一个原因啊2−和H2O2是黄嘌呤氧化酶黄嘌呤脱氢酶转化。猫催化分解的H2O2水和氧气,KCN集团支持更高的活动减少O2−水平(28]。前面提到的研究结果表明,KCN预处理诱导剂量依赖性降低代自由基和抗氧化能力的提高12]。

活性氧的主要来源生产肯定是线粒体,在缺血性损伤,CcO贡献30 - 35%的总prooxidant形成(20.,29日]。这种酶负责转移电子从细胞色素c O2−在生理条件下,CcO活性反映了氧化能力的细胞(11,30.]。我们测量在心脏组织细胞色素c的表达显示KCN组减少75%(图5)。I / R损伤,由CcO多动症和ROS增加生产,也跟着从线粒体释放细胞色素c细胞溶质,启动细胞凋亡和细胞死亡31日,32]。因此,减少细胞色素c的表达反映了CcO活性下降,这与我们的结果。因为增加产量的O2−导致增强SOD活性,减少O2−可以解释的缺失基因表达的改变或减少杆KCN组(33]。此外,据报道,CcO减少2没有在缺氧条件下,抑制CcO原因可能是一个高水平的亚硝酸盐检测到在第一分钟再灌注后KCN灌注(34]。考虑调制的CcO活动可能减轻心肌损伤和氧化应激增加,我们可以假设观察KCN在我们调查的影响归因于降低细胞色素c表达式(21]。

五分钟的缺血不足以引起心肌坏死,事实上,所有观察到的积极作用的KCN调查不缩小梗塞面积归因于13]。再灌注的缺血性心脏刺激线粒体渗透性转换孔开放,导致线粒体细胞色素c的释放,这被认为是一个必要的事件参与细胞凋亡在这些条件35]。心肌细胞凋亡在I / R导致进一步损伤心肌功能和代理能够显著抑制可能有助于最小化心脏损伤(36]。我们研究bcl - 2细胞凋亡抑制基因的表达和proapoptotic Bax基因后KCN应用程序;然而,这个代理没有明显影响基因表达(37]。

除了这一事实药理PostC对心肌功能的保护作用已被证明到目前为止,人们不应忘记,并存病和慢性治疗人类可能影响信号通路中保护心肌功能(38]。本研究可能是一个起点为进一步研究将充分阐明KCN对心脏功能的影响在不同的模型PostC。

5。结论

根据我们的结果,我们可以得出这样的结论:KCN导致改善心脏收缩功能恢复和收缩期和舒张功能应用再灌注期间。此外,KCN应用与生产prooxidants越少,这表明减轻氧化应激作为一个可能的机制,通过它KCN触发器在I / R损伤心脏保护。当然需要进一步检查所有可能的机制和潜在的不利影响,但是现在,KCN表明承诺对急性心肌梗死的影响作为药理PostC代理。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。