文摘

二尖瓣疾病与胸主动脉瘤的发展有关。这种关联的潜在分子机制仍需要澄清。这里,我们评估的循环水平T和B淋巴细胞子集与血管疾病的发展二叶主动脉瓣和三尖瓣主动脉瓣患者,没有胸主动脉瘤。我们推出的循环水平MAIT, CD4 + IL−17 +,和NKT T细胞亚群水平显著降低在二尖瓣疾病情况下,相比三尖瓣主动脉瓣病例存在或缺乏胸主动脉瘤。三尖瓣主动脉瓣患者当中,这些细胞高也在那些受胸主动脉瘤。也获得了类似的数据通过检查CD19 + B细胞,天真的B细胞(IgD + CD27−),内存unswitched B细胞(IgD + CD27 +),内存交换B细胞(IgD−CD27 +),和双重否定B细胞(DN) (IgD−CD27−)。这些细胞产生更低的受试者与二尖瓣疾病患者对三尖瓣主动脉瓣。全部,我们的数据表明,二尖瓣疾病患者显示T和B淋巴细胞的数量减少细胞的子集。建议未来的研究理解这个观察分子机制及其病理生理意义。

1。介绍

二叶主动脉瓣疾病(BAV)是一个相对频繁的先天性障碍,影响了全球大约1.3%的人口与男性患病率3:1 (1]。BAV与瓣膜及血管疾病的发病率增加(1]。BAV是一个重要的风险因素诱发的发展胸主动脉瘤(TAA) [1,2]。的分子机制之间的联系BAV和主动脉疾病仍需澄清2]。

近年来,积累的证据表明,增加主动脉壁的炎症导致动脉瘤的开发和发展3- - - - - -5]。炎性细胞因子和渗透的CD3 + CD4 + CD8 + CD68 + CD20 +细胞已经被证明是大幅增加在人类动脉瘤标本马凡氏综合症患者和家庭和零星的TAA3- - - - - -9]。B淋巴细胞也发现动脉瘤的渗透到墙上显著贡献他们的扩张和发展10]。大量的免疫/炎症细胞已经被我们组主动脉组织中也发现从24 BAV TAA比控制患者主动脉,但在个体水平较高与三尖瓣主动脉瓣(TAV)和受TAA [11]。然而,评估他们的表型及其可能的差异并不在我们的研究(11]。因此,一些动物模型的实验研究表明,主动脉的衰减免疫/炎症阻止或延迟主动脉瘤的发展(3- - - - - -6]。药物或基因辅助T淋巴细胞和损耗γδT细胞,观察T细胞的一个子集,降低动脉瘤的进展(12- - - - - -15]。然而,目前,没有文学的类型的表型数据确实存在免疫/炎症细胞数量及其相关BAV患者和抗议者之间的差异,有或没有相伴TAA。

因此,在这项研究中,我们评估,首次BAV受试者是否有典型的签名在外周血免疫细胞水平和表型,尤其是在T细胞和B细胞的子集,对抗议者主题相伴TAA的存在与否。另一方面,存在典型的分子,细胞,和基因资料在BAV TAA相比TAV患者TAA继续体现在文学,充分强调,证明在我们先前的研究[9,11,16,17]。

2。对象和方法

2.1。BAV和抗议者科目

我们的研究包括总共25 BAV科目(19雄性和雌性6;平均年龄:56.7±13.5年)和35 TAV科目(23男性和12女性,平均年龄:66.4±7.1年)。他们被随机选择从病人接受手术替换或单位的日常保健筛查心脏手术(巴勒莫大学外科学系和肿瘤学),通过使用适当的排除标准为动脉硬化或其他心血管疾病、结缔组织疾病、炎症性疾病(血液感染,胃肠道、泌尿生殖、肺、神经、内分泌和包括炎症性疾病和肿瘤)。他们从2015年1月至2016年12月入学。此外,我们选择BAV和TAV个人有或没有TAA,作为评估适当的控制并发症,为同一组。此外,他们属于同一种族,因为他们的父母和祖父母出生在西方西西里。

选修或紧急手术治疗(使用Bentall-De波诺和Tirone大卫外科技术,尽可能)与互补tubular-ascending主动脉切除患者进行BAV和TAV TAA评估后主动脉横径大小。主动脉直径是术前的评估以及手术室由多角度(由一位有经验的医生飞利浦Ie 33。心肺旁路的机构之前)。主动脉瓣环的尺寸,并发主动脉窦,近端升主动脉(上图sinotubular结的2.5厘米),和主动脉弓评估和展示在表1。

人口统计学和临床数据,包括并发症,获得病人的医疗记录(表1)。在所有BAV和TAV情况下,高血压是通过使用β受体阻滞剂治疗。

血液样本被收集到EDTA-coated管从所有个人注册和目前的招生单位的心脏手术。他们被运送到实验室,收集后1 - 2小时内处理。

2.2。伦理研究批准

我们的研究按照道德标准执行的赫尔辛基宣言世界医学协会;收到当地伦理委员会的批准(APUNIP0094517数量),和所有的参与者把他们的知情同意。数据加密,以确保病人的隐私。所有尺寸都是由医生盲目的方式。

2.3。抗体面板和Multiparametric流式细胞术分析评估循环水平和T细胞和B细胞的表型的子集

从全血中分离EDTA之后,100年μ可行的PBMC的l (外周血单核细胞)是沾染了单克隆抗体的不同组合。T细胞和B细胞的表型特征子集,细胞外标签与anti-CD8执行_FITC,anti-CD161_体育,anti-CD3_{儿童早期开发},anti-CD4_PC5.5,anti-CD16_FITC,anti-CD56_体育,anti-IgD_FITC,anti-CD27_PC5.5,anti-CD19_{儿童早期开发}(贝克曼库尔特、迈阿密、FL)。活细胞中封闭的一面向前/散射(SSC / FSC)淋巴细胞。细胞内染色,细胞被permeabilized Cytofix / Citoperm (BD生物科学)。最后,与anti-IL-17A细胞被染色_FITC(MiltenyiBiotec)、清洗和分析。所有测量是用青色ADP流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特、迈阿密、FL)相同的仪器设置。至少105个淋巴细胞获得和分析使用FlowJo(树明星)软件。白细胞计数和微分与常规血液学分析仪测定。总淋巴细胞的绝对计数的计算是通过增加T细胞和B细胞的相对大小和绝对淋巴细胞计数。

2.4。统计分析

在数据报告1和2MAIT绝对数量的水平,CD4 + IL−17 +和NKT T细胞(T舱检查),和CD19 + B细胞,天真的B细胞(IgD + CD27−),内存unswitched B细胞(IgD + CD27 +),内存交换B细胞(IgD−CD27 +),和双重否定(DN) B细胞(IgD−CD27−) (B室评估)表示为均值±SD。使用SPSS统计分析软件版本20。准确地说,我们使用方差分析(方差分析)测试(由Bonferroni纠正),执行所有组之间的比较。未配对t以及(韦尔奇纠正)是利用两组之间的分析数据。差异被认为是重要的时值< 0.05得到的不同群体之间的比较。

3所示。结果

3.1。病人和控制特点

所有BAV和TAV病人特点归纳在表格1。在年龄方面的显著区别BAV和抗议者的病人。BAV患者显著小于TAV例(56.7±13.5和66.4±7.1年,分别地。 )。没有显著差异体现在两组之间的男性和女性的数量,以及主动脉扩张的大小BAV和抗议者之间的情况。TAA的危险因素中,未发现显著差异。我们只观察到在BAV情况下不显著瓣膜并发症患病率相比TAV病例。

3.2。循环水平的差异在BAV T子集,TAV的病例

我们最初的循环水平相比Mucosal-associated不变的T (MAIT)细胞在BAV与TAV情况下有无TAA。MAIT细胞代表小说innate-like T细胞亚群组成的1% - -10%的外周血T细胞(18- - - - - -20.]。他们调解一个关键的角色在immune-dysregulated疾病和其他疾病,如感染、炎性疾病,和其他18- - - - - -20.]。我们观察到的平均血压MAIT细胞,表达了在绝对数字,BAV和抗议者之间明显不同的团体,有或没有TAA(见图1(一))。准确地说,四组之间的比较(见图1(一))表现出显著差异( ,通过方差分析测试修正Bonferroni所有有效的比较),血液水平最低的BAV组和两个TAV组更为显著。弱,但意义重大,这两者之间的区别是评估BAV组( ,由t韦尔奇以及纠正)。两者之间的不同,抗议者团体,MAIT细胞的平均血压明显高于( ,由t韦尔奇以及纠正)。同样,MAIT细胞的平均水平的比较BAV和抗议者之间并不复杂( ,由t以及纠正了韦尔奇)和BAV和抗议者之间复杂的( ,由t以及纠正了韦尔奇)(参见图明显不同1(一))。

关于另一个类似的结果观察T细胞的子集,也就是说,CD4 + IL−17 +,它有一个公认的作用,导致高血压、血管功能障碍,和损害(21- - - - - -24]。最近的证据表明,这种T细胞子集也参与的发展主动脉瘤(12,22- - - - - -24]。循环水平的CD4 + IL−17 +,表示在绝对数字,四组中明显不同( ,通过方差分析测试修正Bonferroni所有有效的比较(见图)1 (b))。TAA与更高的意思是CD4 + 17 + IL−抗议者组水平。没有区别BAV和抗议者科目没有TAA评估。相比之下,意味着循环CD4 + 17 + IL−水平造成明显高于抗议者与BAV学科受到TAA ( ,由t韦尔奇以及纠正)。

此外,我们还研究了关于T舱NKT细胞的循环水平,因为他们参与动脉粥样硬化的成因,冠状动脉疾病,和动脉瘤25]。平均水平的比较中表达的绝对数量NKT细胞在四组显示显著差异( ,通过方差分析测试修正Bonferroni所有有效的比较(见图)1 (c))。此外,NKT人口明显代表抗议者情况下比BAV情况下,存在或没有TAA ( 和 ,由t以及纠正了韦尔奇、职责;尤其是,他们的一半BAV与抗议者情况下没有TAA)(见图1 (c))。两个TAV组之间未发现差异,而明显高于平均水平的NKT细胞在BAV TAA影响评估与BAV科目没有影响( ,由t以及纠正了韦尔奇(见图)1 (c))。

3.3。B细胞数量的循环水平的变化

介绍的研究表明,B细胞造成慢性免疫/炎症病理生理学的TAA [3- - - - - -10]。因此,我们也评估中表达的意思是循环水平的绝对数量CD19 +细胞,天真的B细胞(IgD + CD27−),内存unswitched B细胞(IgD + CD27 +),内存交换B细胞(IgD−CD27 +),和双重否定(DN) B细胞(IgD−CD27−;即。,exhausted memory cells) (see Figures2(一个)- - - - - -2 (e)在四组。关于CD19 +细胞,观察四组之间的显著差异( ,通过方差分析测试修正Bonferroni所有有效的比较(见图)2(一个))。此外,比较检测到明显高于平均水平的抗议者CD19 +细胞组与TAA与抗议者组没有TAA ( ,由t韦尔奇以及纠正)。没有其他差异观察(见图2(一个))。同样的,表达的意思血液水平的绝对数量IgD + CD27−(天真)B四组中明显不同的子集( ,通过方差分析测试修正Bonferroni所有有效的比较(见图)2 (b))。他们在BAV结果更明显和抗议者团体TAA,较高的平均值在抗议者( ,由t韦尔奇以及纠正)。BAV两组之间未发现差异,而较高的平均值进行评估与TAA抗议者与抗议者没有TAA ( ,通过方差分析测试修正Bonferroni所有有效的比较(见图)2 (b))。

同样,意思表达水平的绝对数量IgD + CD27 + (m . unswitched B细胞(见图)2 (c))是比较不同的四组( 通过方差分析测试修正Bonferroni,所有有效的比较)。最高的平均值被发现在抗议者TAA,大大不同于那些BAV受到TAA(他们3倍TAA) ( ,由t以及纠正了韦尔奇(见图)2 (c))。

有趣的是,一个相反的趋势观察BAV和抗议者团体对IgD−CD27 + (m .切换)患者B子集水平,没有TAA(见图2 (d))。的意思是循环水平IgD−CD27 + (m .切换)B子集表示的绝对数量在BAV更明显没有TAA与BAV TAA ( ,由t韦尔奇以及纠正;在BAV TAA,值是BAV TAA)的半数。两者之间的显著差异也发现抗议者组(不与TAA, ,由t以及纠正了韦尔奇)和TAA BAV和抗议者之间的影响( ,由t以及纠正了韦尔奇(见图)2 (d))。

最后,DN的平均循环水平B细胞中表达的绝对数量(见图2 (e))有显著不同的四组中( 通过方差分析测试修正Bonferroni,所有有效的比较)。然而,最低的值被发现在BAV TAA,与没有TAA BAV大大不同 (由t以及纠正了韦尔奇)和与TAV TAA ( ,由t韦尔奇以及纠正)。没有观察到两者之间的差异TAA组(见图2 (e))。

4所示。讨论

我们的研究表明,BAV与减少的循环水平T和B淋巴细胞的子集。BAV病人表现出显著减少所有T和B子集的检查,对抗议者个人、小趋势增加(但不明显)在那些TAA(见图1和2)。准确地说,他们已经MAIT和NKT细胞子集的最低水平。平均水平的CD4 + IL−17 +细胞子集BAV两组相似。但他们也反映TAV病人的模式没有TAA, BAV患者的差异可能他们无法clonically扩大和功能结果不佳,鉴于TAA的增加趋势不并发症(见图1 (b))。同样的结果也已经获得了(参见图2(一个)- - - - - -2 (d))在所有B评估子集,除了DN B细胞子集。最后这显示一个逆趋势更加明显水平BAV个人没有TAA与BAV个人TAA,但是就像那些抗议者没有TAA(见图2 (e))。不同,TAV个人有或没有TAA显示大量的T细胞和B子集分析,增加了重要的趋势在那些受到TAA(见图1和2)。因此,获得的数据达成一致从我们先前的研究结果发现BAV TAA条件(9,11,16,17,26]。此外,他们另外确认我们之前建议的存在BAV个体独特的细胞,分子和遗传机制与TAA发作(11]。

先前的研究的证据表明,淋巴细胞发挥重要作用在主动脉瘤的开发和发展。T淋巴细胞浸润在动脉瘤壁丰富的患者(3- - - - - -9]。B淋巴细胞也发现动脉瘤的渗透到墙上显著贡献他们的扩张和发展10]。大量的T和B免疫/炎症细胞已经被我们组主动脉组织中也发现从24 BAV TAA比控制患者主动脉,但在个体水平较高与三尖瓣主动脉瓣(TAV)受TAA [11]。动物研究显示,损耗的T和B淋巴细胞延迟疾病的进展(3- - - - - -6]。药物或基因辅助T淋巴细胞和损耗γδT细胞,T细胞的一个子集,是,的确,观察到减少动脉瘤的进展(12- - - - - -15]。

令人惊讶的是,尽管存在BAV与TAA对抗议者的发病率更高,首先我们的数据表明,该瓣膜缺陷与减少某些T和B淋巴细胞的循环水平子集,通常参加慢性免疫/炎症发展的过程常见的心血管疾病,如TAA [6,10,18- - - - - -25]。这个数据可能显示,T和B淋巴细胞活化不可能的独特因素,这有助于增加率与BAV TAA的发展主题。可能,可能是推测,可能是导致BAV本身条件和妥协之间的密切关系T和B室。建议未来的研究测试这个假说和理解背后的分子机制循环淋巴细胞水平降低与BAV科目。先前的研究已经表明,BAV病人更频繁地携带突变NOTCH1基因(27- - - - - -33]。此外,BAV条件呈现一起升主动脉扩张一直还演示了与其他罕见变异显著相关NOTCH1基因(32,33]。Notch信号是一种重要的炎症细胞成熟和监管机构动员(27]。因此,它是可能的缺陷等级信号导致管制BAV患者炎症细胞。

5。结论:我们建议和推荐

获得的数据表明,BAV学科水平显著降低在所有T和B子集。他们让我们提出一些重要的建议,可能导致研究的新途径。总结在表2。首先,这个典型形象T和B淋巴细胞似乎表明子集BAV个人可能有一个适当的应对慢性组织损伤,和早于TAV的个人,通常开发TAA疾病在老年年龄(17]。因此,这种临床情况似乎反映了所观察到的老年人,在先前的研究证明从我们和其他组织(34- - - - - -36]。换句话说,免疫系统在BAV情况下可能会出现“旧的免疫系统“改变了特定clonotypic组件,增加先天/炎症隔间,因此更容易受到内部和外部压力,脆弱,残疾,和疾病(34- - - - - -36]。同意这个建议,非常显著水平的CD68 +单核细胞已经被我们观察到和其他团体在主动脉标本BAV例TAA [3- - - - - -9,11]。这可能会证明他们的高发病率的慢性免疫/炎症性血管和主动脉并发症,如TAA,年龄TAV科目。

此外,这改变了T和B免疫档案BAV病人,尽管评估只从定量的角度,可能会引导我们可能假设的存在之间的密切关系BAV本身条件和T和B淋巴细胞隔间妥协。事实上,它可能在BAV个人推测存在的生理改变通路参与两个进程或目标没有详尽的调查在我们的研究中。事实上,动脉瘤的形成和发展是一个复杂的过程的结果,更多的途径,如切口,toll样receptor-4 TGF -β等等,和他们的下游组件可能扮演相关角色,强调优雅在模型中提出了在我们最近的评论发表在著名期刊(26]。这也可以的情况下一些蛋白酶,其功能已被报道防护或根据动脉瘤的位置或恶化TGF -β信号,最近展示了能够激活一个自分泌il - 1β信号通路作为招聘的先天免疫细胞通过CCL2IL-1动脉外膜β(37]。

在我们的例子中,一个通路介导这些函数是Notch通路,以4型跨膜受体(Notch1-Notch4)在人类。在特定的情况下,我们的注意力集中于等级1。它已被证明有多效性的影响:干细胞/祖细胞命运;成年细胞的生命周期调节和代谢调节多个步骤的T细胞和B细胞在中枢和外周淋巴器官发展;和心血管系统等的发展,充分描述在我们最近的评论(27]。此外,BAV明显与罕见但高度渗透exonal突变NOTCH1基因(27- - - - - -33一起,BAV呈现升主动脉扩张一直还演示了与其他罕见变异显著相关NOTCH1基因(32,33]。因此,切口的损伤信号一直也显示参与动脉瘤的开发和进展,总结了2017年由Yassine优雅和同事(38)和最近证明了我们小组在最近的一项研究(数据没有显示)。

当然,更多的是强制性的和更大的研究来证实这些有前途的结果以及我们的假设。复制我们的结果从一个非常大的样本量的可能性可能会给检测潜在的分子,细胞和基因生物标记翻译在日常临床实践。反过来,他们可能同意识别高危BAV学科发展TAA,对他们的治疗提供一个适当的指导,可能不同于那些与TAA TAV的主题。这可能同意我们显示特定的临床建议手术方法适用于BAV TAA患者的情况。药物疗法的选择更合适的手术有或没有复合主动脉根部替换代表当前心血管研究的主要对象。基于我们之前的和当前的数据,我们建议超越主动脉的直径和增长率的值作为唯一参数手术建议(39]。手术策略不仅会考虑临床特征的分子,细胞和基因的每个人,尤其是对于BAV条件。这将是有趣的开始讨论个性化治疗和手术的建议,特别是BAV条件的情况下。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

卡梅拉r . Balistreri博士是参与的概念和设计研究。Drs。Antonino通用Marullo Calogera皮萨诺,乔凡尼Ruvolo人口参与研究的招生。Drs。卡梅拉r . Balistreri索尼娅Schiavon,西尔维亚Palmerio,西尔维奥•却是无法进行实验并获得数据。Drs。卡梅拉r . Balistreri和贝卢斯科尼却是无法获得执行的结果和分析。Drs。卡梅拉r . Balistreri Giuseppina Colonna-Romano Giacomo Frati,朱塞佩Mazzesi,乔凡尼Ruvolo, Elena Cavarretta和塞巴斯蒂安。Sciarretta参与数据解释。Drs。 Carmela R. Balistreri, Giacomo Frati, Elena Cavarretta, and Sebastiano Sciarretta were also involved in drafting the paper. Dr. Carmela R. Balistreri was involved its critical revision and supervision. All authors participated in the study, and they reviewed and approved the final version of the paper. Drs. Carmela R. Balistreri, Sebastiano Sciarretta, Elena Cavarretta, Antonino G. M. Marullo, and Giacomo Frati equally contributed to this work.

确认

作者欣然承认Matteo Bulati博士,曾参与获取数据。这项工作是支持由意大利教育部大学和研究,卡梅拉·r·Balistreri,乔凡尼Ruvolo教授,朱塞佩Mazzesi (000134 _rdb_2014”关注的细胞和分子机制,保护和修复BAV与抗议者病人作为个性化治疗小说工具”)。