文摘
神经干细胞(nsc)蕴含着巨大的潜在治疗阿尔茨海默病(AD)通过细胞替代和营养因子的分泌。番茄红素是一种强有力的β类胡萝卜素抗氧化剂,已被证明在先前的研究改善氧化损伤。然而,目前还不清楚如果番茄红素可以与nsc诱导生长因子的分泌,以及预处理与番茄红素是否会允许nsc分泌足够的营养因素减少氧化损伤神经元。我们与番茄红素培养nsc预处理,然后应用lycopene-treated-NSC-conditioned媒体(Ly-NSC-CM)主要神经元文化接触叔丁基氢过氧化物(t-BHP)诱导氧化损伤。我们发现番茄红素促进了神经生长因子的分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)和血管内皮生长因子(VEGF)与国家安全委员会。此外,Ly-NSC-CM减少氧化应激和t-BHP-induced细胞凋亡减少。我们发现一个凋亡效应相关的伯灵顿/ bcl - 2的表达,抑制细胞色素C, caspase-3分开。此外,Ly-NSC-CM增加突触蛋白的水平,包括synaptophysin (SYP)和突触后密度95 (psd - 95),并激活的PI3K / Akt途径培养的神经元。总的来说,这些数据表明,从t-BHP-induced Ly-NSC-CM可以保护神经元氧化损伤。
1。介绍
阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病。广告表现为认知障碍和记忆,大大增加发病率由于老化。细胞外和细胞内淀粉样β蛋白(Aβ)存款被广告的一个重要病理特征(1- - - - - -4]。先前的研究表明β也与线粒体,导致线粒体功能障碍和氧化应激增加(5- - - - - -8从活性氧(ROS)。线粒体ROS生产过剩造成年龄和线粒体功能障碍,出现在广告中,破坏蛋白质和DNA;此外,ROS被释放后细胞凋亡时,损害其他细胞导致细胞毒性多米诺效应(9,10]。此外,ROS导致神经传递的干扰和逐渐增加的风险开发广告(11]。实验,人工生成活性氧的方法之一是接触叔过氧化丁氢过氧化物(t-BHP),一个稳定的产生大量的自由基,引发氧化应激及其反应(线粒体功能异常和细胞凋亡)体外(12]。事实上,我们以前的研究表明,t-BHP引发淀粉样蛋白聚集在培养的神经元13]。
神经干细胞(nsc)自我更新的前体的神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞;常见的胎儿发育期间,他们还居住在专业领域如subventricular区(SVZ)和subgranular区(SGZ)在成人中枢神经系统(CNS)。令人信服的证据证实神经干细胞(nsc)施加大量有益和移植后治疗效果在实验神经退化疾病模型。nsc修复受损组织,不仅身体取代细胞还分泌神经营养或免疫调节因子(14,15]。在缺氧条件下,nsc既定的产生和分泌神经营养因子和激素,如神经生长因子(神经生长因子),脑源性神经营养因子(BDNF)和血管内皮生长因子(VEGF)。这些因素形成一个复杂的生物活性在本地网络和提高目标组织的功能和结构(16,17]。实验证据发表确认NSC-secreted因素的神经保护效应在广告18,19]。此外,据报道,nsc预处理增强营养因子的分泌的细胞因子(20.]。例如,在小鼠诱导缺血性脑损伤,细胞移植前预处理与il - 6的nsc移植治疗效果增强线粒体抗氧化酶和VEGF的分泌20.]。
在临床应用方面,NSC分泌可能有显著的优势,超过NSC本身的使用。分泌nsc可以绕过免疫与细胞疗法相关的兼容性问题,疾病本身,和其他相关问题,还可以减少细胞培养和维护的时间和成本。自分泌nsc可以大批量生产,储存很长一段时间,和重用(与植入细胞),他们提供一个更有成本效益的治疗的优势。NSC-conditioned介质可以被用于再生医学提供一个显著更大的治疗从相同的外生nsc池中获益。
番茄中番茄红素是类胡萝卜素主要是和其他红色水果,是一种非常有效的抗氧化剂,所以即使比β-胡萝卜素。番茄红素显示不同的神经生物活性与炎症、癌症和氧化损伤。这些属性是否有疗效的广告最近开始检查。据报道,迄今为止,番茄红素显著降低amyloid-induced在培养的神经元和神经毒性改善内存赤字和线粒体氧化应激β1-42-injected老鼠(21- - - - - -23]。然而,番茄红素的影响细胞因子的分泌和神经营养因子nsc和神经保护的能力条件培养基是未知的。本研究试图确定番茄红素预处理的影响在NSC分泌和神经保护的能力条件培养基,以及探索假定的观察到的影响机制。
2。材料和方法
2.1。海马nsc和大脑皮质神经元的主要文化
C57BL / 6 j小鼠获得从南方医科大学动物实验中心(牌照号码44002100007907),出生后24小时内使用。所有的程序都是研究所的伦理委员会批准的实验室动物科学,暨南大学。主要脑皮质神经元培养如前所述[24,25与一些修改)。简单地说,大脑皮层和海马解剖从新生儿C57BL / 6 j小鼠,脑膜和血管细胞的分离哈佛商学院(Gibco)。海马细胞在杜尔贝科resuspended修改鹰的介质(DMEM)和F12 (1: 1;D / F;镀Gibco)分离神经元,然后在一个25厘米2细胞培养瓶在2×105细胞在D / F /毫升含有2% B27 (Gibco)的补充。如果媒体支持nsc, 20 ng / mL bFGF(σ)和20 ng / mL EGF(σ)被添加到D / F除了B27。细胞培养在37°C公司为5%2并提供完整的媒介(主要D / F:供应D / F = 1: 1)每三天(25];同时,neurospheres离心法分离的650了5分钟,然后进一步使离心后收集的主要媒介是在3500年为5分钟。一半的中等每3天了。文化被用于实验9天。
大脑皮层是切成小块,用0.125%胰蛋白酶(Gibco)分离为20分钟37°C,并通过细胞过滤器过滤(Gibco)。皮层细胞离心后得到10005分钟和镀poly-D-lysine-coated文化板块D / F含10%胎牛血清(的边后卫;Gibco)和50毫克/毫升链霉素/青霉素(Hyclone)。这些细胞被维护在一个孵化器在37°C下5%的股份有限公司2/ 95%啊2。4小时后,媒介取代Neurobasal媒介(Gibco)含2% B27补充。一半的媒介是每三天更换一次。文化被用于体外实验在第七天。评估神经元的形态和nsc,细胞被观察到使用与相差光学显微镜(莱卡)。
2.2。细胞治疗
番茄红素是购买从国家控制药品和生物制品研究所(广州)和溶解在四氢呋喃(四氢呋喃)包括0.025%丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)阻止过氧化物的形成。股票的解决方案是受光照和湿度和储存在−80°C。在每个实验之前,THF-lycopene的原液稀释D / F的最终浓度。四氢呋喃车辆的数量在培养基从未超过0.1% (v / v),浓度已被证明不影响化验(结果类似于应用vehicle-free控制介质)(26]。D / F用作车辆控制媒体。叔必和必拓(t-BHP)从阿拉丁购买(中国),在D / F稀释,储存在4°C。组神经元最初分配给六个浓度组(0μ2.5米,μ5米,μ10米,μ米,20μM, 40μM t-BHP)和暴露24 h,识别工作的剂量。Neurobasal被用作车辆控制媒介这些主要神经元的文化。nsc的先决条件是用不同浓度(0μ0.1米,μM, 1μ米2μ米,4μ米,8μM, 16μ米)的番茄红素24小时,之后媒体收集(NSC-conditioned媒体)。神经元是使用NSC-conditioned媒体4 h,然后暴露于t-BHP 24 h在每个实验中。
2.3。细胞生存能力分析
细胞生存能力评估使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)方法根据制造商的指示(Beyotime,中国)。短暂,nsc或神经元培养96 -孔板治疗如上所述在细胞治疗(参见图1 (b),2 (b),2 (d)),然后孵化后额外4 h在37°C添加5毫克/毫升MTT的媒介已经在盘子里。MTT的解决办法是删除,彩色甲瓒晶体于150年解散μL二甲亚砜。光密度测量值(OD)使用一个iMark微型板块吸光度读者(Bio-Rad) 570海里。细胞生存能力表示为信号的比值获得的治疗组,对照组以百分比形式(即。对照组= 100%)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
(c)
(d)
2.4。NSC分泌(条件培养液)集合
老鼠主要海马nsc被播种在25厘米2培养瓶(2×105细胞/毫升),并且在confluency达到80%,服用2μM番茄红素稀释股票“细胞治疗”中描述的24 h。他们轻轻洗了三次磷酸盐(PBS Gibco)和介质换成新鲜的D / F。这个(条件)培养基提供了从nsc 6 h后然后离心机在1610年为5分钟。上层清液被储存在4°C之前使用实验(控制NSC-conditioned介质,NSC-CM;lycopene-treated-NSC-conditioned Ly-NSC-CM)。处理媒体与Neurobasal稀释介质用于体外。
2.5。ELISA的媒体
NSC-CM和Ly-NSC-CM媒体测试没有稀释的神经生长因子水平,表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子1 (igf - 1)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),并使用适当的VEGF ELISA (CUSABIO、武汉、中国)根据制造商的指示。
2.6。测量细胞内的活性氧
二乙酸二氯荧光素试验(DCFH-DA Beyotime,南京,中国)是用来确定细胞内ROS水平。总之,DCFH-DA稀释只是之前使用10 D / Fμ工作浓度。老鼠主要皮质神经元被播种在six-well盘子和培养7天,然后处理条件之一的媒体(见NSC分泌(条件培养液)集合)。每次治疗后,条件培养基被除去,神经元是用PBS洗净;然后他们被孵化DCFH-DA (10μ在黑暗中M)为20分钟37°C。DCFH-DA孵化后,神经元是洗前和收集。一个BD FACSAria流式细胞分析仪(美国BD生物科学)是用来测量荧光强度变化(细胞内ROS)检测波长488 nm。
2.7。测定线粒体膜电位(ΔΨm)
ΔΨm是测量与JC-1线粒体膜电位测定工具包(Beyotime、上海、中国)。初级皮层神经元被镀到poly-D-lysine-coated six-well盘子和培养7天,然后接受媒体的条件之一。每次治疗后,神经元在37°C JC-1处理30分钟根据制造商的指示,使用荧光显微镜和代表图像得到。单体的荧光峰(绿色,534 nm)和聚合(红、594 nm)进行了分析。红色比绿色荧光被用来量化的ΔΨm皮质神经元在每个治疗组,这样一个更大的红色:绿色比率代表了更多的极化,完整的线粒体膜。
2.8。免疫荧光
主要国家安全委员会和神经元被镀在poly-D-lysine-coated six-well板7天。条件培养液治疗后,媒介提供了和PBS的细胞被洗了三次;他们然后用4%多聚甲醛固定30分钟。然后nsc神经元permeabilized 0.3% Triton x - 100在PBS为15分钟。被屏蔽后3%牛血清白蛋白(BSA)和PBS室温1 h, nsc在PBS和神经元又洗了最后孵化一夜之间在4°C的anti-MAP 2, anti-nestin或anti-cleaved caspase-3抗体(1:200年,细胞信号技术,美国)。细胞被洗PBS和孵化两种二次抗体(TRITC-anti-rabbit (555 nm)和兔DyLight 488 -反- 1:400年,细胞信号技术,美国)2 h。一个10分钟孵化DAPI用于复染色细胞核。最后,荧光图像捕获在一个数字化的显微镜(德国徕卡),并测定了荧光强度ImageJ软件。
2.9。TUNEL分析
终端原位生物素化的UTP缺口末端标记(TUNEL)试验进行确定使用原位细胞凋亡细胞死亡(POD)检测设备(凯基生物生物技术、江苏、中国)。条件培养液治疗后,神经元在盖玻片培养poly-D-lysine-coated six-well板块7天冲洗三次与PBS和固定刚做好的4%多聚甲醛在室温下20分钟。细胞被封锁在3% H2O2与PBS 15分钟然后在冰冷的0.1% permeabilized Triton x - 100与PBS 10分钟。TUNEL-positive(凋亡)神经元被识别和统计分析制造商的指示。核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI Beyotime,南通、江苏、中国),和TUNEL的数量+——/ DAPI+神经元转换为DAPI总数的百分比+核四个不重叠的领域/盖玻片。
2.10。免疫印迹分析
条件培养液治疗后,神经元是收获和细胞溶解冰在细胞裂解缓冲(Beyotime、南通、江苏、中国)30分钟。总细胞蛋白质离心机在4°C和1160020分钟,蛋白质浓度测定使用增强的BCA分析工具包(Beyotime、江苏、中国)。等量的蛋白质12% sds - page分离(Beyotime、江苏、中国)量化GAPDH,细胞色素C, caspase-3, caspase-3裂解,伯灵顿,bcl - 2和8% sds - page量化β微管蛋白、SYP PSD95, PI3K p-PI3K, Akt, p-Akt。分离蛋白被电转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF微孔,美国)。1小时的膜被封锁5%脱脂奶粉(Beyotime、江苏、中国)Tris-buffered盐水渐变20 (TBST)为0.1%。与TBST洗后,膜被孵化与适当的主要抗体蛋白质上面列出的(所有的兔子,1:1000年,细胞信号技术,美国)在一夜之间在4°C。与TBST洗涤后,细胞膜在辣根peroxidase-conjugated二次孵化1 h抗体(anti-rabbit 1: 5000年,细胞信号技术,美国)。与增强化学发光信号测量工具(美国微孔ECL)凝胶成像系统(美国Billerica的微孔,MA),并使用一个软件数量结果可视化。
2.11。评估细胞色素C的释放
主要收集鼠标cerebrocortical神经元和用PBS胞质分数每次治疗后做准备。细胞在500年resuspendedμL缓冲区(pH值7.5,1.5毫米MgCl220毫米HEPES-KOH 10毫米氯化钾,1毫米钠EDTA, 1毫米亮抑酶肽,1μ使用Pyrex g / mL chymostatin)和均质玻璃均质器和B型杵(40中风)。匀浆离心机在4°C, 1160020分钟生成胞质分数,而这些上层清液(蛋白质)收集免疫印迹分析使用单克隆抗体对细胞色素C。
2.12。统计分析
所有数值数据提出了均值±SEM ( )。单向方差分析(方差分析)和学生的适当的,以及用于分析组间显著差异。差异与 被认为是重要的。GraphPad Prism 5.3 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)是用于生成图表。
3所示。结果
3.1。Lycopene-Induced分泌神经生长因子,VEGF和BDNF nsc
首先,确定了海马nsc巢蛋白的分析蛋白表达使用免疫荧光(图1(一))。nsc被暴露于一系列番茄红素浓度(0.1μ米到16μ米)24 h来确定剂量(图工作1 (b))。MTT比色细胞生存能力。我们发现2μM番茄红素治疗最大的细胞生存能力增强和显著减少16岁可行性μm .因此,上层清液收集Ly-NSC-CM表示与2预处理μM番茄红素或D / F(车辆)预处理(NSC-CM), D / F中没有预处理也作为控制。我们发现水平的神经生长因子,VEGF和BDNF Ly-NSC-CM明显高于NSC-CM和D / F ( ;数据1 (c),1 (e),1 (f))组。EGF在场,但组间无显著差异( ;图1 (d)),而bFGF和igf - 1没有检测到。
3.2。t-BHP-Induced Ly-NSC-CM增加细胞生存能力和减少神经突损伤的神经元
我们使用MAP-2免疫反应性来确定皮层神经元(图2(一个)),然后暴露一系列t-BHP浓度(2.5μM - 40μ米)24小时确定剂量。细胞生存能力是通过MTT试验评估。t-BHP诱发剂量依赖性降低培养神经元(图的可行性2 (b))。神经元是用NSC-CM预处理和Ly-NSC-CM 4小时前处理10μM t-BHP 24小时。形态变化与t-BHP毒性被相差显微镜检查(图定性评估2 (c))。许多已经扩展形成神经突解剖网络控制文化。然而,在t-BHP-treated神经元,神经元细胞体变小了,探明短或不再可见。t-BHP-induced形态学的改变似乎是阻止通过与Ly-NSC-CM预处理。10后细胞生存能力显著下降了50%μM t-BHP接触( ;图2 (d)),而细胞生存能力NSC-CM和Ly-NSC-CM-pretreated组vehicle-treated控制的增加到73%和88%,分别为( ;图2 (d))。这些结果表明,lycopene-induced NSC分泌可能增强神经元生存和减少氧化损伤。
3.3。在t-BHP-Treated Ly-NSC-CM抑制细胞内ROS生成神经元
氧化应激诱导的细胞内活性氧过剩代上游t-BHP-induced机制被广泛接受为一种可能的神经毒性。细胞内ROS水平是衡量光纤荧光测定术期间接触到10μM t-BHP 24小时。ROS的产生(图3(一个))明显高于控制t-BHP-induced神经元(大约573%的对照组, )。NSC-CM预处理Ly-NSC-CM t-BHP-induced ROS生成明显减少,大约286%和108%的对照组,分别为( ;图3 (b))。Ly-NSC-CM抑制t-BHP-induced ROS生成更多比NSC-CM ( ;图3 (b))。
(一)
(b)
3.4。Ly-NSC-CM抑制丧失ΔΨm t-BHP-Treated神经元
线粒体膜电位去极化(ΔΨm)是一个重要的事件在诱导细胞凋亡的线粒体途径,通常与氧化应激有关。相对于对照组,10μM t-BHP 24小时诱发显著减少(膜的去极化)初始ΔΨm,基于减少JC-1荧光在596 nm(红色),与此同时增加荧光在534海里(绿色)。Ly-NSC-CM预处理4小时后,观察恢复ΔΨm(图4(一))。红色:绿色荧光比率为32% t-BHP组低于对照组( ;图4 (b));NSC-CM和Ly-NSC-CM预处理明显加速恢复ΔΨm ( ;图4 (b))。Ly-NSC-CM明显比NSC-CM更有效( ;图4 (b))。
(一)
(b)
3.5。Ly-NSC-CM减毒t-BHP-Induced皮层神经元凋亡
进一步调查Ly-NSC-CM是否可以影响细胞凋亡在初级皮层神经元的文化,我们用裂解caspase-3 immunolabeling检测神经细胞凋亡。如图5(一个),immunolabeling裂解caspase-3只是t-BHP组中检测到。NSC-CM和Ly-NSC-CM显著降低裂解caspase-3 immunolabeling。基于裂解的相对比例caspase-3-positive细胞(细胞)总额的%,裂解的百分比caspase-3-positive细胞与对照组相比显著增加,经过10 43%μM t-BHP接触( ;图5 (b));治疗与NSC-CM Ly-NSC-CM显著衰减增加,分别为28%和15%,( ;图5 (b))。比NSC-CM Ly-NSC-CM明显更有效衰减增加( ;图5 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
然后我们调查了番茄红素的影响在培养的海马神经元t-BHP-induced凋亡使用TUNEL分析(图5 (c))。众多TUNEL-positive细胞(绿色)观察t-BHP-treated文化(47%的神经元),并显著减少观察控制文化(5%; ;图5 (d))。预培养和NSC-CM Ly-NSC-CM显著降低TUNEL-positive细胞百分比的29%和14%,分别为( ;图5 (d));此外,Ly-NSC-CM TUNEL-positive细胞的百分比显著减少超过NSC-CM ( ;图5 (d))。这些结果表明,NSC分泌物也凋亡。
3.6。Ly-NSC-CM阻止t-BHP-Induced Apoptosis-Mediated蛋白的表达在皮层神经元
进一步研究Ly-NSC-CM t-BHP-induced神经元损害的抗凋亡作用,我们量化caspase-3裂解,完整的caspase-3,伯灵顿,bcl - 2,通过免疫印迹和细胞色素C蛋白表达。结果显示,孵化与t-BHP造成一个健壮的伯灵顿增加水平和bcl - 2水平明显下降,导致一个大约增加了二伯灵顿/ bcl - 2比例。然而,Ly-NSC-CM预处理明显逆转这一趋势( ;图6 (b))。同样,裂解caspase-3和细胞色素C显著降低;裂解的比率caspase-3完整caspase-3明显拒绝Ly-NSC-CM组相对于t-BHP集团( ;数据6(一)和6 (c))。因此,Ly-NSC-CM对t-BHP-induced凋亡的影响可能至少部分是由调节线粒体凋亡通路。
(一)
(b)
(c)
3.7。从t-BHP-Induced Ly-NSC-CM保护皮层神经元突触损伤
确定Ly-NSC-CM预处理对t-BHP-induced神经元损伤的影响突触功能的蛋白质表达,免疫印迹的突触标记SYP PSD95受雇。SYP的水平和PSD95 NSC-CM显著增加,Ly-NSC-CM组相对于t-BHP组( ;数据7(一)和7 (b))。这些数据表明,Ly-NSC-CM能有效地调节突触蛋白的表达(SYP和PSD95)作为一个假定的神经保护作用。
(一)
(b)
3.8。从t-BHP-Induced Ly-NSC-CM保护皮层神经元氧化损伤通过激活PI3K / Akt通路
因为PI3K / Akt通路参与凋亡和prosynaptic监管,我们决定如果这些激酶参与了神经保护的Ly-NSC-CM磷酸化PI3K和Akt蛋白免疫印迹。NSC-CM和Ly-NSC-CM显著增加磷酸化PI3K的表达( ;图8(一个))和磷酸化激酶( ;图8 (b));Ly-NSC-CM组明显更有效地移植两种蛋白质相比NSC-CM组。
(一)
(b)
4所示。讨论
氧化应激是由一个失衡的生成和清除活性氧(ROS),从而导致氧化损伤组织和细胞(27,28]。ROS主要是线粒体呼吸链在能量代谢中产生。在生理状态下,抗氧化防御系统能有效地清除活性氧,因此自由基的生成和间隙可以保持动态平衡(29日,30.]。然而,在病理状态,大量的ROS了机体抗氧化防御能力,导致损伤膜脂质、蛋白质、核酸和其他形式的氧化损伤,进而导致各种疾病包括神经退行性疾病、衰老和癌症(31日- - - - - -34]。
在这项研究中,我们使用t-BHP诱导氧化损伤实验。t-BHP外源氧化稳定剂,在分解产生大量的自由基,可以诱导多种形式的体外氧化压力,最终导致线粒体功能障碍和细胞凋亡35- - - - - -37]。据报道,t-BHP会导致神经元氧化应激导致细胞内ROS upregulation,线粒体的功能损伤,最终DNA损伤和神经细胞凋亡19,20.),现象与氧化应激损伤机制是一致的广告。因此,我们使用t-BHP建立神经元氧化损伤模型在初级新生小鼠皮层神经元。
番茄红素的能力,然后评估中起到承诺自然,诱导治疗有益神经营养因子的表达和分泌。我们确定番茄红素剂量低至2μM能促进神经生长因子的分泌,脑源性神经营养因子,VEGF在nsc但对表皮生长因子的分泌的影响微不足道,与没有bFGF和igf - 1的分泌。接下来,我们想要到达的最佳浓度10μM t-BHP损伤模型。根据多次实验的结果及相关文献,10μM t-BHP决定的最佳浓度和24小时为最佳t-BHP曝光时间来评估细胞死亡和伤害,有大约50%的神经元生存在这个协议(23]。
到了意味着lycopene-mediated神经营养浓缩NSC媒体(即。,Ly-NSC-CM) and a model system to asses neuronal cell death relevant to AD, we tested the neuroprotective potential of Ly-NSC-CM. Media were collected and added to 10 μM t-BHP-treated神经元。光学显微镜分析表明,突触明显破裂或恶化,在10和神经核是半透明的μM t-BHP组,表明突触损伤和细胞死亡。另一方面,Ly-NSC-CM组显示显著减少突触损伤,与突触恶化的大幅度减少,神经元形态接近对照组。这表明Ly-NSC-CM对神经元和突触可能有保护作用,还可以促进神经突触损伤的修复。依照这些发现,蛋白质含量SYP和PSD95 Ly-NSC-CM组明显高于t-BHP组。综上所述,这些数据表明Ly-NSC-CM能有效对抗突触t-BHP-induced氧化应激诱导的损害,这可能与调节synaptic-related蛋白表达。此外,Ly-NSC-CM防止细胞死亡。因此,Ly-NSC-CM预防神经损伤在突触和全细胞水平。
然后我们进一步测试t-BHP刺激神经元的能力生产大量的活性氧和媒体的能力条件降低ROS水平ΔΨm的流式细胞术分析。NSC-CM和Ly-NSC-CM都显著降低活性氧的水平,从而抑制t-BHP-induced神经元氧化损伤。然而,Ly-NSC-CM有更好的效果比NSC-CM恢复正常ΔΨm t-BHP-induced神经元损伤。
接下来,我们评估保护细胞凋亡,其中包括分析凋亡通路的影响。的表达裂解caspase-3被免疫荧光测量,与Ly-NSC-CM组显示水平显著低于t-BHP组。因此,Ly-NSC-CM阻止caspase-3蛋白的激活,这表明细胞凋亡的预防。TUNEL分析进一步证实了Ly-NSC-CM的凋亡效应。进一步探讨凋亡机制,伯灵顿的表情,bcl - 2, caspase-3 caspase-3裂解,和细胞色素C被免疫印迹检测。伯灵顿的水平、细胞色素C和裂解caspase-3 Ly-NSC-CM组明显低于t-BHP组,而凋亡bcl - 2蛋白的表达明显调节。因此,Ly-NSC-CM有效地对抗t-BHP-induced神经元氧化损伤,抑制神经细胞凋亡。这可能是有关apoptosis-related蛋白质的直接监管。然而,Ly-NSC-CM的目标和机制在调节apoptosis-related蛋白质的表达和synaptic-related蛋白质仍需要进一步探讨。
我们的研究表明,PI3K和Akt蛋白的磷酸化Ly-NSC-CM组显著调节。研究表明,PI3K / Akt信号通路是一个细胞增殖的关键调节器,分化、细胞凋亡、衰老。PI3K激活酪氨酸激酶受体,nontyrosine激酶受体,和细胞外信号,如胰岛素受体。受PI3K Akt激活,影响细胞凋亡以各种方式(38,39]。它被报道,Akt激活规范的proapoptotic效果不好通过促进磷酸化的坏和允许坏逃离bcl - 2 / Bcl-X复杂。另一方面,Akt bcl - 2促进凋亡的影响(bcl - 2位于线粒体膜和PI3k / Akt下游因子(40,41]。此外,人们已经发现,Akt激活后,磷酸化caspase-9在Ser196灭活,进一步抑制caspase-3和其他的激活下游分子线粒体凋亡信号级联(42- - - - - -45]。进一步说,发现了一种蛋白激酶的激活增强bcl - 2启动子的活动,增加循环的活动AMP-response元件结合蛋白(分子)和抑制线粒体释放apoptosis-related因素,如细胞色素C,如果。PI3K / Akt的激活也提供了重要的分子基础的起始细胞凋亡的细胞对氧化应激,缺血、缺氧/复氧,和β毒性(44,46- - - - - -48]。此外,它已被证明,Akt可以调节糖原合成酶的活性,促进神经元存活和凋亡,减少神经原纤维缠结,修复神经元突触损伤(49]。它也被报道,PI3K / Akt通路的激活与突触形成和长期记忆通过长期势差50]。结合这些先前的发现,upregulation Ly-NSC-CM PI3K / Akt的代表一个可能的机制防止神经元t-BHP引起的氧化损伤。
5。结论
从广泛的角度来看,在大多数情况下,Ly-NSC-CM比NSC-CM更有益。这些数据表明,预处理nsc番茄红素可以增强抗氧化能力,增强nsc的生长因子的分泌。总的来说,我们的数据是第一个证明番茄红素中起到与已知条件培养液治疗(Ly-NSC-CM)足以抑制氧化损伤主要由氧化剂t-BHP皮质神经元诱导,最有可能通过PI3K / Akt通路。
然而,我们的研究存在一定的局限性。首先,我们评估的神经保护效应NSC-conditioned媒体,而不是潜在的抗炎作用和影响β低聚物。其次,我们没有探索问题,如氧化还原信号和干扰线粒体的功能,还应该被t-BHP。最后,这项研究仅限于在体外实验中,尽管未来的研究集中在体内的效果。然而,我们的研究结果提供了新的理论和实验依据氧化应激相关广告病变的预防和治疗。
的利益冲突
作者不存在相互矛盾的关系。
作者的贡献
Cuiqin黄和Danhui Gan同样这项工作。
确认
作者要感谢工作人员的病理生理学,暨南大学脑科学研究所的(广州,广东省,中国)的技术援助。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81471236和81471236号),优秀青年教师的培训项目在广东省高等教育机构(没有。YQ2015024)和特殊基础重大科技计划项目(没有广州的城市。201506010095)。