文摘

水平的氧化应激的发生和发展是非常重要的在各种老年性疾病,如癌症。氧化应激水平也可能发挥重要作用在癌症患者对治疗的反应。我们旨在探讨血清是否8-oxo-dG作为氧化应激的标记是预测肿瘤的反应。我们使用改良ELISA与两步过滤分析8-oxo-dG血清。8-oxo-dG水平之间的关系,研究了肿瘤反应,毒性在19个食道癌病人放疗和16个胃癌病人接受化疗。在放疗和合并后的广播,化疗组,基线水平的8-oxo-dG应答患者明显低于nonresponder病人和治疗后增量大。相比,患者在治疗后血清8-oxo-dG水平降低,增加患者无进展生存时间值”的水平。尽管初步,“我们的研究结果表明,血清水平的8-oxo-dG可能被用来预测放疗和化疗的敏感性和结果上消化道肿瘤。治疗前患者8-oxo-dG水平很低,随后增加治疗后更有可能从治疗中获益。

1。介绍

食管和胃癌症发病率和死亡率的重要原因。2012年,胃癌是估计全世界第五大常见癌症和癌症死亡的第三大原因。虽然比胃癌食道癌不太常见,其高死亡率的地方这是第六全世界癌症相关死亡的主要原因。大量抽烟等风险因素,遗传背景,大量饮酒,某些食物类型和热饮料增加食道癌和胃癌的风险。一般来说,食管和胃癌症都与不良预后相关,尽管改善他们的治疗包括先进的诊断和治疗方法1,2]。预后的生物标志物可能扮演了一个重要的角色在选择有效的治疗,减少副作用,改善生活质量。目前,食管和胃癌症的治疗方法主要有手术、放疗、化疗,单独或合并使用。放疗和化疗是介导的细胞毒性效应在一定程度上诱导的活性氧(ROS),导致氧化应激。由于未成对电子,ROS是不稳定的,和其他分子发生反应,例如,脂类,蛋白质,RNA, DNA核苷酸,和国家结核控制规划,修改他们的结构和功能。因此,细胞的功能成为妥协。频繁的一个研究氧化损害是8-hydroxy-2 DNA基地脱氧鸟苷(8-oxo-dG)。8-Oxo-dG产生活性氧,例如,羟基自由基,反应在DNA或脱氧鸟苷三磷酸鸟嘌呤(dGTP)在细胞质中。之前我们已经表明,细胞外的起源8-oxo-dG dGTP的胞质内容也可以转化成8-oxo-dGTP自由基攻击(3- - - - - -5]。8-Oxo-dG分泌到细胞外环境如尿液、血液和唾液。高氧化应激可以部分解释肿瘤细胞的特点,例如,基因组不稳定性,增殖率升高,化疗抵抗,和转移(6]。

一些出版物表明氧化应激水平,与8-oxo-dG测量尿液或血清,可以是一个有用的生物标志物对放疗和化疗的癌症患者(7- - - - - -9]。此外,一些研究小组表明8-oxo-dG和MTH1蛋白质的水平,一个8-oxo-dGTPase,扮演了一个重要的预后角色在食管和胃癌症10- - - - - -12]。然而,商业ELISA试剂盒用于检测细胞外8-oxo-dG不具体13),和其他chromatographic-based方法,例如,高压液相色谱(HPLC)和电化学检测或液相色谱与质谱检测(质/ MS),是昂贵的,需要精密的仪器设备及高技能的人员,而不能经常用于肿瘤诊所。因此,我们建立了一个敏感的和具体的方法,我们首先筛选血清样本债券Elut列上,分离出一部分包含8-oxo-dG,然后使用这个分数来确定8-oxo-dG通过改良ELISA酶标法(3,14]。

我们以前报道的水平辐射诱导尿和血清8-oxo-dG可以作为一个标记来确定个体辐射敏感性乳房以及头部和颈部癌症患者(15- - - - - -17]。在目前的研究中,我们调查了8-oxo-dG血清水平之间的关系和食管和胃癌症的治疗结果以及therapy-related副作用。患者的血液样本收集在两个时间点:(1)肿瘤治疗和(2)开始前两周后完成治疗。8-oxo-dG的水平在他们使用我们的改良ELISA法测定血清。

2。材料和方法

2.1。病人

35恶性肿瘤患者(第四阶段III)招募了2015年3月至2015年7月期间,在常州肿瘤医院接受放疗或化疗。患者两种不同的诊断进行了研究:19与食管和16个胃癌。所有患者取得了明显的病变。总组患者由29男性和6个女性,年龄在34岁到79岁,中位年龄为66年。他们都没有收到以前的放疗或化疗。肿瘤的组织学检查和/或细胞学上证实。肿瘤的临床分期确认结果的基础上通过x光检查,计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和其他成像检查。所有的病人有一个东方合作肿瘤学集团(ECOG)≤2的性能状态,骨髓储备充足,肝功能正常,正常的心脏功能,正常的肾功能。此外,病人没有之前的恶性肿瘤史。这项研究是按照道德标准和执行中国常州肿瘤医院伦理委员会批准的医嘱2015 sy - 001 - 01)。

2.2。治疗

患者中,19个当地先进的食道癌患者接受放疗与6兆电子伏光子。规划目标卷(PTV)包含的主要肿瘤站点和利润率大约1.5厘米。处方剂量的PTV在30 60 Gy分数在6周。16胃癌患者接受标准化疗药物组合:叶酸,氟尿嘧啶,铂(FOLFOX4) 4次2周。

2.3。反应评估

肿瘤反应是评估根据响应评估标准固体肿瘤(RECIST) [18]:完全缓解(CR)被定义为一个完整的消失,所有疾病的客观证据,部分响应(PR)被定义为至少降低30%的总和最长的直径(LD)的肿瘤以基线和直径为参考,进步的疾病(PD)被定义为增加20%的总和的LD肿瘤或外观的一个或多个新的损伤,和稳定的疾病(SD)被定义为充分收缩,公关和足够的增加对PD的资格。在这项研究中,取得了CR患者或公关是归类为救援人员和所有剩余的患者被认为是nonresponders。

2.4。后续

身体检查,测量癌胚抗原CA199和胸苷激酶1(扩散的标记)的水平,和全身ct在第一年每3个月,每6个月之后来评估治疗的反应。无进展生存(PFS)从研究条目,直到疾病进展的时候,死亡,或者一天最后的随访中,哪个是第一位的。肿瘤放射治疗组(RTOG)得分模式(19)是用来评估急性核辐射胸壁皮肤和食管粘膜毒性。为了便于统计分析,我们分类显示病人的副作用RTOG分数2,3,4为中度或重度组。根据NCI-CTC化疗的毒性分级,(可以在4.0版本http://www.oncology.tv/SymptomManagement)。

2.5。ELISA测定血清8-Oxo-dG

3毫升的血液样本中收集管无抗凝。大约两小时后,血清分离通过离心法管250 g×20分钟。8-Oxo-dG使用修改后的竞争ELISA测定如前所述[3,4,16]。所有样品都是盲目地编码和分析。健康生物标志物提供的酶联免疫试剂盒是瑞典AB。简单地说,800年μl血清使用C18固相萃取债券Elut过滤列(瓦里安,CA)如前所述14]。过滤步骤需要删除的产品除了8-oxo-dG和单克隆抗体的交叉反应。纯化的样本lyophilised通过添加PBS和重组为1毫升。过滤步骤重复了一次。90年μl进一步纯化处理样品的检测8-oxo-dG根据公司提供的协议。样品的吸光度是使用一个自动读取在450 nm ELISA板读者。每个样本一式三份分析,样品属于一个个别病人进行分析使用相同的96 - ELISA板。标准曲线8-oxo-dG (0.05 -10 ng / ml)成立为每个板覆盖的范围8-oxo-dG样本。改良ELISA方法的验证是由HPLC-EC过去研究[4]。对比改良ELISA和HPLC-EC方法呈线性相关人类血清中的浓度范围( , )。没有ELISA和HPLC-EC结果未经过滤的样本之间的相关性。

2.6。测量血清TK1

的浓度血清TK1 (STK1p)测量使用一个商业工具基于一种改进的化学发光(ECL)点污点分析所描述的制造商(SSTK有限公司、深圳、中国)。3μl的血清样品直接应用于硝化纤维膜一式两份。鸡的血清样本探测anti-TK1 IgY抗体提高对肽(剩余195 - 225,GQPAG PDNKE NCPVP GKPGE AVAAR KLFAPQ)。TK1肽点缀在不同浓度(2.2,6.6,和20点)作为质量控制标准。膜上的点的强度是由CIS-l成像系统(SSTK有限公司、深圳、中国)。的强度TK1已知浓度的质量控制标准,STK1p的浓度计算和表示为点。STK1p试验的详细描述,看到陈et al。20.]。在这项研究中,2.0下午STK1p被用作风险阈值。

2.7。测量血清CA199

血清CA199水平测量使用ADVIA半人马®XP自动免疫分析系统(德国西门子医疗诊断,埃朗根)根据制造商的协议。血清CA199水平≥37 U / ml被认为是异常。

2.8。统计方法

统计分析、配对样本t以及和独立样本t以及使用。卡方检验是用来确定8-oxo-dG浓度的变化之间的相关性和肿瘤治疗的反应或严重的副作用。使用kaplan - meier生存曲线和生存率较无进展生存分析单变量分布。一个值低于0.05被认为是表明一个显著差异。

3所示。结果

3.1。血清8-Oxo-dG和临床病理特征之间的联系

合并组患者的基线8-oxo-dG浓度与肿瘤分化程度显著相关。高度分化的肿瘤患者有更高的8-oxo-dG血清(0.48±0.30 ng / ml)相比差或未分化肿瘤患者(0.25±0.17 ng / ml)(表1)。血清8-oxo-dG显著相关的肿瘤标志物CA199和性别,而不是TK1(表1)。

3.2。协会8-Oxo-dG血清水平的变化与肿瘤之间的反应

调查如果8-oxo-dG血清水平的变化与肿瘤相关的反应,我们将患者分成2组:那些显示客观缓解(CR + PR)和个人没有响应(PD + SD),分别。此外,肿瘤反应之间的关系和8-oxo-dG被调查患者放疗(食道癌)或化疗(胃癌)作为单独的组和合并后的集团之一。8-oxo-dG浓度的变化列于表2。我们发现血清8-oxo-dG的变化与肿瘤有关的反应。在表38-oxo-dG的水平在每个治疗组的血清提出了基于响应前和治疗后2周。如表所示38-oxo-dG的水平增加,合并后的集团,CR +公关,从0.21到0.38 ng / ml ( )。放射治疗患者的增加从0.25到0.43 ng / ml ( )和对化疗病人从0.17到0.27 ng / ml(无意义的)。SD + PD组,减少或没有发现改变8-oxo-dG 8-oxo-dG的水平治疗后比较基线水平。在探索基线血清8-oxo-dG水平是否能预测放疗和化疗的结果,我们分析了基线血清8-oxo-dG和肿瘤之间的关系反应在不同的治疗组。总体结果表中给出3表明,CR +公关组相比有较低的基线8-oxo-dG SD + PD组。这些观察结果表明,患者基线水平低的血清8-oxo-dG之后显著增加治疗对治疗更敏感。

3.3。血清8-Oxo-dG水平的变化之间的联系和放疗或化疗的副作用

调查如果8-oxo-dG血清水平的变化与急性副作用,我们比较了患者治疗前后血清8-oxo-dG浓度严重的副作用的浓度病人显示几乎没有副作用。放疗组中,我们发现,增加血清8-oxo-dG水平密切相关急性皮肤反应和急性食管粘膜反应( 和0.018,分别地)。患者在化疗组,增加血清8-oxo-dG似乎更容易遭受3或4度骨髓抑制和胃肠道反应的3或4度与浓度下降的患者相比,尽管组之间的差异没有达到统计学意义( 和 职责。)(表4)。

3.4。血清8-Oxo-dG水平和无进展生存率之间的关联

PFS中值为9个月(范围,2-17数月)。图1(一)显示所有患者血清的kaplan meier生存曲线8-oxo-dG水平下降或增加。血清浓度的变化8-oxo-dG被减去基线浓度计算浓度的治疗前血清8-oxo-dG放疗或化疗后两周。病人的血清8-oxo-dG相比下降,增加患者血清8-oxo-dG浓度大大延长了平均PFS (PFS,中值没有定义和8个月)。数据1 (b)和1 (c)显示kaplan meier生存曲线接受放疗和化疗的患者,分别。相比,患者血清8-oxo-dG下降,放疗患者增加血清8-oxo-dG浓度有显著长值PFS,虽然差异没有达到统计学意义的放疗组(中位数PFS,放疗组和中没有定义和7个月没有定义与化疗组中定义, 和0.001,分别地)。

中位随访时间是9个月。在17个月的一些患者进行了随访。在研究期间,4 35例(11.4%)死亡。由于低死亡率,有意义的关联血清测定8-oxo-dG水平和死亡是不可能执行。

4所示。讨论

在目前的调查中,我们使用一个改良ELISA方法检测血清8-oxo-dG的病人。细胞外8-oxo-dG源于8-oxo-dGTP核苷酸池中当自由基与dGTP反应。MTH1水解8-oxo-dGTP 8-oxo-dGMP。8-Oxo-dGMP进一步脱去磷酸,8-oxo-dG从内部被释放到细胞外环境,它可以检测和使用它作为氧化应激的标记(3,4]。我们发现8-oxo-dG基线水平的反应患者的血清(化疗和radiotherapy-CR +公关)相比显著降低水平nonresponder病人(SD + PD) (0.21±0.15 ng / ml和0.52±0.34 ng / ml,职责)。当分解结果分为放疗和化疗组,我们还观察到一个显著的低水平的8-oxo-dG CR +公关组相比SD + PD组放疗患者(0.25±0.14,0.46±0.25 ng / ml, ),而化疗组,8-oxo-dG只是无意义的低水平的CR +公关比SD + PD组(0.17±0.16,0.37±0.32 ng / ml,职责)。数据表明8-oxo-dG降低患者血清开始前肿瘤治疗有更好的预后比8-oxo-dG程度更高的患者建议8-oxo-dG的基线水平的血清食管和胃癌患者预后的价值。

这些结果也符合先前公布的数据在卵巢,肾,肝细胞癌和肺癌(8,14,21,22]。结果表明,有一个关联8-oxo-dG水平,肿瘤大小,并在肾细胞癌临床分期。

另一个有趣的发现是水平的变化的观察8-oxo-dG治疗后(表3)。结果表明,水平8-oxo-dG CR +公关组显著增加,几乎2倍,治疗后与基线水平相比。相反,水平8-oxo-dG SD + PD组(所有患者,放疗和化疗组)治疗后没有增加,并有可能进一步降低。应该注意,基线水平的8-oxo-dG SD + PD组高,表明SD + PD患者已经在应力状态和细胞无法应付额外的活性氧诱导的治疗。高基线水平的氧化应激SD + PD组可能有各种原因包括高代谢活动由于大型肿瘤负担,肿瘤侵犯,类型的肿瘤。在这种情况下,细胞可能会死,不产生额外的8-oxo-dG公开。相比之下,患者CR +公关组织氧化应激较低;因此,他们能够应付和排泄8-oxo-dGTP诱导升高的治疗。总结的结果和一些建议机制,介绍了在讨论中提出了在图2。

个人8-oxo-dG水平治疗前后有预测价值时考虑到副作用的治疗方法。中提供的数据表4表明radiotherapy-treated病人的8-oxo-dG水平治疗后增加,增加的风险严重皮肤反应和严重粘膜反应,而与化疗组相比,没有8-oxo-dG水平之间的相关性和急性副作用观察。

这里给出的结果表明,有可能区分CR +公关组的SD + PD组考虑基线8-oxo-dG以及8-oxo-dG水平治疗后的变化。然而,这些团体之间有重叠表明8-oxo-dG分析无法预测对治疗的敏感性。我们计划研究其他因素,例如,氧化应激蛋白的表达研究的蛋白表达与排泄8-oxo-dG组合是否会更好地预测治疗反应。

CA199是一个肿瘤相关生物标志物主要用于监测肿瘤治疗的效率,但并不是恶性疾病的诊断。TK1有扩散的生物标志物用于复发和生存的恶性肿瘤患者的预后和初癌和恶性肿瘤的早期发现健康检查(23,24]。而CA199和8-oxo-dG相关,与8-oxo-dG TK1没有关联,表明8-oxo-dG血清中可能不会与肿瘤增殖率,而是与体内肿瘤的存在。在这方面,CA199像8-oxo-dG与血清TK1没有关联。这是与之前的研究结果相一致的肿瘤患者(23]。因此,我们应该记住,不同的肿瘤相关生物标志物反映不同肿瘤的性质,应该结合使用。

癌症治疗的目的是优化肿瘤的概率控制在最小化不必要的急性或副作用。然而,由于没有测试为个体预测可供临床使用的无线电和化学敏感性,交付的最大剂量是适应少数敏感的患者表现出严重的副作用。因此,开发预测测试将允许对大多数的癌症患者接受高剂量,希望改善肿瘤控制和减少副作用。

我们之前的研究表明,细胞外8-oxo-dG可以作为生物标志物预测癌症患者对放疗的敏感性,当考虑到副作用(15- - - - - -17]。我们建立了辐射诱导氧化应激的剂量-反应关系使用8-oxo-dG全血样品在辐照后血清。乳腺癌的收集血液样本以及头部和颈部癌症患者,都有不同程度的治疗后的副作用。患者分为对辐射敏感的和normo-sensitive组根据他们的急性或晚radiotherapy-induced副作用,例如,急性皮肤反应在乳腺癌,在头部和颈部癌症患者放射性骨坏死。我们发现辐射诱导的剂量反应8-oxo-dG血清对辐射敏感的和normo-sensitive病人之间的不同。normo-sensitive组,基线水平的8-oxo-dG低相比,那些对辐射敏感的群体,而且,增加治疗后都大。然而,2 - 3周后开始放射治疗水平8-oxo-dG敏感患者的尿液增加,达到类似于normo-patients水平。这些数据可能表明对辐射敏感的patiients排泄8-oxo-dG慢的方式。利用蛋白质组学的方法,我们可以显示多种抗氧化蛋白,例如,SOD1, PRDX2,和PARK7 normo-sensitive患者中表达下调和一些抗氧化蛋白,例如,BLVRB和PRDX2调节对辐射敏感的乳腺癌患者(16,25]。这些结果表明,抗氧化蛋白的表达以及氧化应激水平发挥着重要作用在乳腺癌的敏感性和“头部和颈部癌症患者放疗。的预测化疗的影响,需要进一步的调查。与先前的研究一致(9),我们发现一个重要的预后价值8-oxo-dG食管和胃癌症血清。患者基线8-oxo-dG水平较低,增加治疗后更有可能受益于放疗或化疗。我们的发现是新的但是应该考虑初步由于低的患者数量在这个研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

没有利益冲突。

作者的贡献

阿里倒Khavari和永平刘贡献了同样的工作。

确认

本研究支持的瑞典辐射安全权威,斯文和莉莉Lawskis基金会,常州的科技计划项目,江苏省(批准号CE20165052),常州市卫生局项目(批准号ZD201616),江苏省卫生部门(批准号Z201616),江苏省“333人才培养工程”(批准号2016 3 - 0727和BRA2017114),和“人才培养工程”的主要医疗创新常州(批准号2016 czlj021)。作者要感谢副教授Siv奥斯特曼从业的宝贵意见和讨论。