文摘

Tanshinone花絮”是一个重要的组件,是孤立的从丹参(丹参),这是众所周知的,有益心血管健康。在这项研究中,我们确定的影响Tanshinone花絮”和它的底层机制的行动在缺氧/复氧(A / R)细胞系模型。诱导/ R损伤之前,老鼠cardiomyocyte-derived细胞系H9c2刺激了8μ米的Tanshinone花絮48小时。与A / R组相比,Tanshinone花絮治疗显著增加细胞活力和乳酸脱氢酶活性降低。Tanshinone花絮调节14-3-3ηbcl - 2表达和促进线粒体外膜易位,用压敏电阻器阴离子通道1。此外,预处理与Tanshinone花絮减少活性氧的生成和细胞色素c的释放,灭活caspase-3,阻止线粒体渗透性转换孔开放,减少凋亡细胞的比例。此外,治疗Tanshinone花絮减少丙二醛水平,从而提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性。沉默的表达14-3-3η由腺病毒了上述结果。这些新发现表明,预处理与Tanshinone花絮缓解H9c2细胞损伤与A / R损伤和upregulation 14-3-3η,从而促进bcl - 2易位线粒体外膜,防止线粒体渗透性转换孔开放,减少细胞色素c的释放,防止caspase-3激活和抑制细胞凋亡。

1。介绍

丹参(丹参)是一种传统中药,在全球范围内用于改善血液流动和血瘀(1]。Tanshinone花絮(听)是一种天然的活性成分是来自丹参。之前的研究表明,听起着生物的作用在抗氧化和抗炎活动在活的有机体内(2,3]。最近,听——已经证明提供各组织缺血再灌注损伤的保护(4- - - - - -6]。有趣的是,在鼠在活的有机体内研究,结果表明:梗塞大小显著降低心肌缺血模型,使用听了一个星期(7]。然而,本研究只涉及病理结果包括生物标记物的氧化应激和细胞凋亡;行动的机制涉及这一现象没有了。

再灌注损伤中起着重要的作用在缺血性心血管疾病引起的死亡8]。缺血预处理(IPC)和药物预处理(PPC)是最常见的策略来预防致命的再灌注损伤(8,9]。然而,临床结果在IPC和PPC略微成功(9]。最近,Abdukeyum et al。10]建议营养预处理(NPC)可以被视为一种新颖的有益方法缓解致命的再灌注损伤,这证实了我们之前的研究中,这是进一步定义(11]。与IPC相比,人大有非影响和涉及更可行的实现方法11,12]。

中发挥着重要作用的蛋白质的bcl - 2家族mitochondria-mediated凋亡[13]。以前的研究已经表明bcl - 2可以抑制线粒体渗透性转换孔注射(mPTP药物)通过直接绑定打开压敏电阻器阴离子通道1 (VDAC-1)也被认为是注射的mPTP药物门离子交换(11,13]。注射的mPTP药物会导致流出proapoptosis因素,如细胞色素C的流出(cyt C)和激活半胱天冬酶的级联(14]。如何用VDAC-1 bcl - 2绑定机制发生没有描述。我们以前的研究表明,14-3-3η促进蛋白质的易位到线粒体(未发表的结果)。因此,我们推测,14-3-3η是一个可行的目标TSN-mediated心血管效应,提出的作用机制涉及到14-3-3η支持bcl - 2可能促使进入线粒体,它结合VDAC-1。证实这一假设,我们使用一个缺氧/复氧(A / R)模型在H9c2细胞模拟再灌注损伤和调查周围的关系,14-3-3η由RNAi技术。此外,我们也评估潜在的相互作用和功能在14-3-3η、bcl - 2和VDAC-1在这个模型。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和A / R损伤模型

细胞培养组件从生活购买技术(苏格兰佩斯利)。AD14-3-3ηRNAi (5-AAGCTTCTGAG GCAGCGTATA-3),AD-scrRNAi (5-TTC-TCCGAACGTGTCACGT-3)和老鼠cardiomyocyte-derived细胞系H9c2是购自上海Genechem有限公司有限公司(上海,中国)。听是购自中国药品生物制品研究所的分析(中国,北京)。H9c2细胞培养在high-glucose杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),含10%胎牛血清的边后卫。细胞培养在37°C O 95%₂和5%的公司₂孵化器。A / R治疗和缺氧预处理(APC)方法进行如前所述[15,16]。总之,细胞治疗与不同浓度的听(2,8,32μ米)在不同时间实验前(12、24、36和48小时)。调查周围的心脏保护,细胞被分成七个组:对照组(1):细胞被孵化high-glucose DMEM含有10%的边后卫没有adenovirus-silencing 14-3-3η和A / R感应;(2)A / R组:H9c2细胞暴露在缺氧通过孵化缺氧3 h和媒介reoxygenated 2 h和再氧化介质(如前所述)(15];(3)听+ A / R组:细胞治疗8μ米听48小时前/ R的感应;(4)听+ AD14-3-3ηRNAi + A / R组:细胞治疗8μ米听48小时和AD14-3-3感染ηRNAi 48小时前/ R的感应;(5)AD14-3-3ηRNAi + A / R组:细胞被感染AD14-3-3ηRNAi 48小时前/ R的感应;(6)AD-scrRNAi + A / R组:细胞被感染AD-scrRNAi 48小时前/ R的感应;和(7)APC + A / R组:细胞治疗与APC和孵化high-glucose DMEM含有10%的边后卫前24小时/ R的感应。

2.2。乳酸脱氢酶(LDH)活性和细胞的可行性分析

LDH是心肌细胞的胞内酶,释放到培养基中细胞损伤。因此,治疗后,上层的收集和LDH的活性是由一个微型板块读者(美国大力神Bio-Rad 680年,CA)。细胞生存能力评估是由甲基噻唑基四唑试验(MTT)。总之,细胞被镀在96 -孔板的密度1×10⁵细胞/。治疗后,节中描述2。1细胞培养,MTT(0.5毫克/毫升)磷酸盐(PBS) 4小时37°C在黑暗中。然后,媒介在150年取代μl二甲亚砜(DMSO)和分析标。

2.3。测定脂质过氧化和抗氧化酶的活动

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)是最重要的生物标志物评估氧化应激。治疗后,细胞裂解的上层清液收集和测量根据制造商的指导方针。所有收集的上清液测定使用标仪(美国大力神Bio-Rad 680年,CA)。SOD, MDA工具包用于测量和氧化酶是购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。

2.4。隔离的线粒体和胞质分数

在终止/ R模型,收集细胞,用冰冷的PBS洗两次。然后,细胞resuspended 1 x细胞溶质萃取缓冲区和均质冰。匀浆被转移到一个新的管和涡15秒。然后,均化缓冲被放在冰15分钟和离心机3000×rpm / 10分钟在4°C,丢弃颗粒。接下来,上层清液被转移到一个新的地铁和离心机在12000 rpm 30分钟在4°C沉淀线粒体。上层清液,含有胞质蛋白,免疫印迹分析冷冻和储存。净化线粒体颗粒与1 x细胞溶质溶解提取缓冲和离心机在12000 rpm 30分钟在4°C。颗粒和线粒体溶解resuspended缓冲区和放在冰30分钟。然后,混合物是涡30秒和离心机13000 rpm 10分钟在4°C。含有线粒体蛋白质颗粒,被免疫印迹分析评估。

2.5。线粒体通透性转换孔测量注射(mPTP药物)

如前所述(执行注射的mPTP药物17]。总之,线粒体在肿胀resuspended缓冲区(5 l KH更易₂阿宝₄120 l更易与氯化钾,10更易/ l (pH值7.4),20更易与l拖把)0.25毫克/毫升,添加到200年μmol / l CaCl₂诱导孔。然后,吸光度是由分光光度计在520海里每30秒30分钟。这个试验的负控制30 nmol / l环孢菌素A。

2.6。Coimmunoprecipitation化验

A / R损伤,引起心肌细胞在radioimmunoprecipitation放在冰和均质试验(里帕)裂解缓冲(Solarbio,北京)蛋白酶抑制剂。匀浆是离心机在10000 g×15分钟在4°C,沉积物是丢弃。上层清液中蛋白质浓度是衡量bicinchoninic酸(BCA)测定。100年μg蛋白加入anti-VDAC-1(圣克鲁斯、钙、美国),anti-Bcl-2 (Abcam、剑桥、马、美国),和anti-14-3-3η(美国Abcam、剑桥、MA)在33μ每1克蛋白质μg抗体和孵化隔夜4°C。蛋白质A / G +珠子(美国圣克鲁斯,CA)用冷洗净PBS之前使用和添加到混合物中。混合物在4°C孵化4小时和离心机600 g×3分钟在4°C。球团矿与precold PBS洗了三次。免疫沉淀反应复杂混合1 x钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(SDS /页)凝胶样品缓冲和煮5分钟;然后,分析了蛋白质免疫印迹分析。

2.7。免疫印迹分析

蛋白质提取使用里帕裂解缓冲,含有蛋白酶抑制剂。萃取离心机在12000 g×25分钟在4°C去除不溶性颗粒。总共30μ克蛋白质中煮1 x sds - page样品缓冲5分钟和10% sds - page凝胶分离。然后,蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,由甲醇和激活了Tris-buffered盐水10%脱脂牛奶,含0.1% Tween-20 (TBST) 2小时20°C。然后,膜与初级抗体针对VDAC-1孵化,bcl - 2, 14-3-3η,β肌动蛋白(ZSGB-Bio,中国),或cyt C(圣克鲁斯、钙、美国)在4°C一夜之间,3次洗15分钟,孵化与相应的辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体2小时20°C。然后,膜与增强化学发光孵化(ECL)试剂1分钟和蛋白质是由gds - 8000 UVP可视化照片扫描仪和图像实验室软件(美国Bio-Rad大力神,CA)或预照光x射线胶片(富士胶片、东京、日本)。蛋白质的强度乐队是由图像实验室软件评估(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.8。荧光和共焦显微镜

为VDAC-1评估,bcl - 2和14-3-3ηcolocalization,心肌细胞放在confocal-only板(巢,无锡,中国)。治疗后,节中描述2。1permeabilized与4%多聚甲醛固定细胞,0.5% Triton x - 100 (PBS稀释)冰,和阻止5%牛血清白蛋白(BSA)缓冲区(在PBS稀释)。然后,细胞培养过夜的goat-anti-VDAC-1 (1: 50), rabbit-anti-Bcl-2(1: 50),和mouse-anti-14-3-3η(1:200)在4°C。随后,细胞培养在孵化器37°C,洗了三次与PBS和孵化橙色驴抗体免疫球蛋白,红、绿驴anti-rabbit IgG驴anti-mouse免疫球蛋白(美国Abbkine雷德兰兹,CA)。细胞核被染为3分钟了。4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)在黑暗中在20°C。然后,细胞成像使用共焦显微镜(700年蔡司LSM,德国)。Colocalization VDAC-1、bcl - 2, 14-3-3η分析了禅宗2.1 SP1软件(蔡司、上海、中国)。为了便于展示数据,我们决定把绿色变成蓝色,蓝色变成黄色,橙色为绿色。为每个组,至少6细胞被随机评估和所有实验进行三次。

2.9。Caspase-3活动分析

Caspase-3活动是由Caspase-3活动分析工具包(Beyotime、上海、中国)。总之,创建一个标准曲线用不同浓度的标准p-nitroanilide(机构)。收集细胞,用冰冷的PBS洗。然后,细胞被孵化15分钟在冰和离心机在16000 g×15分钟,和上层清液被转移到一个新管。上层清液是孵化与混合试剂(检测缓冲区和Ac-DEVE-pNA) 37°C 2小时使用标和分析。

2.10。流式细胞术分析细胞内活性氧(ROS)和心肌细胞凋亡

ROS通过流式细胞术分析之前,收集细胞治疗后部分中描述2。1与荧光探针10孵化μ米2 ,7二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA、注册机、南京,中国)。然后,样本在600×g离心5分钟,洗了三次与冷PBS,通过流式细胞术和分析(激励:488海里;排放:525海里)。心肌细胞凋亡是由膜联蛋白V /π工具包(BestBio、上海、中国)。总之,细胞被洗冰冷的PBS和收集。然后,细胞resuspended 1 x膜联蛋白V绑定缓冲(250μl),细胞和5μ在4°C l膜联蛋白V-FITC染料和孵化15分钟在黑暗中。细胞混合10μl propidium碘染色,在4°C的环境中5分钟在黑暗中,并通过流式细胞术分析。

2.11。统计分析

给出的数据 。组之间的差异进行了分析使用单向方差分析其次是最低差事后测试使用SPSS 11个体差异。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。听——预处理对LDH活性,细胞生存能力,14-3-3η表达H9c2细胞/ R

LDH经常作为标志来预测心肌细胞条件。MTT检测进行评估心肌细胞生存能力。评估听在心肌细胞的影响,我们测试了不同浓度的听H9c2细胞受到/ R损伤。与A / R相比,治疗8μ米听和APC显著减少LDH活动( 和提高细胞生存能力 ;数据1(一)和1 (b))。此外,我们发现一个依赖于时间的保护作用听H9c2细胞/ R损伤。如数据所示1 (c)和1 (d)显示,LDH活动时间减少,而细胞生存能力会增加时间。有趣的是,我们发现了一个时间upregulation在14-3-3η表达式(数据1 (e)和1 (f))。14-3-3的表达η也是调节APC组( 和对照组)。这些结果表明,预处理的保护作用与8μM听/ 48小时相似的APC。这些数据证实了周围的保护作用,表明其效果涉及14-3-3的表达η。

3.2。14-3-3η低表达废除听预处理的保护作用在H9c2细胞LDH活性和细胞生存能力/ R损伤

为了进一步调查周围的保护作用,ad14-3-3ηRNAi被用来表达下调14-3-3η在H9c2细胞表达。免疫印迹分析数据所示2(一个)和2 (b),ad14-3-3ηRNAi防止upregulation 14-3-3η表达式由听( 与周围的);然而,没有观察AD-scrRNAi对14-3-3的影响η表达式。接下来,我们决定LDH活动和细胞生存能力(数据2 (c)和2 (d))。与周围的组织相比,LDH听+ ad14-3-3活动ηRNAi组显著增加,细胞周围加上ad14-3-3的可行性ηRNAi组减少( )。此外,AD-scrRNAi相比没有显著影响A / R组( )。这些数据表明,有一个cytoprotective之间的正相关效应和14-3-3的表达η。

3.3。线粒体的影响易位的bcl - 2和14-3-3η可能发挥重要作用在听预处理的保护作用H9c2细胞受A / R损伤

14-3-3η是一种分子伴侣。我们的未发表的研究结果显示,14-3-3η协助蛋白质易位。探讨之间的关系bcl - 2, 14-3-3η,VDAC-1 coimmunoprecipitation进行实验评估的潜在交互听预处理前2天/ R治疗。总之,蛋白质与anti-14-3-3免疫沉淀反应η分别,anti-Bcl-2 anti-VDAC-1和免疫印迹anti-Bcl-2第一,然后用anti-VDAC-1免疫印迹。结果表明,bcl - 2, 14-3-3η(图,VDAC-1有明显的交互3(一个))。为了进一步证实这种现象,免疫荧光试验和共焦显微镜分析了。如图3 (b),bcl - 2, 14-3-3η听后,VDAC-1 colocalize预处理/ R治疗前2天。此外,如图4(一)和4 (b)bcl - 2 A / R损伤诱导的易位从细胞质中线粒体与对照组相比。此外,14-3-3η可拆卸的减少bcl - 2易位从细胞质中线粒体与A / R组相比。通过免疫荧光分析结果进一步证实了使用共焦显微镜(数字4 (c)和4 (d))。数据显示重叠的bcl - 2和VDAC-1信号与A / R损伤显著增加和减少14-3-3η表达下调。

3.4。抑制线粒体易位沉默的bcl - 2 14-3-3η表达废除听预处理的保护作用在H9c2 ROS生成和氧化应激细胞/ R损伤

识别这种机制的氧化应激的生物功能,我们检查了ROS生成,抗氧化酶的活性和脂质过氧化作用。ROS爆发在mitochondria-mediated凋亡检测。因此,ROS水平作为细胞凋亡的标志。如数据所示5(一个)和5 (b),/ R损伤导致ROS破裂( 与控制)。此外,周围的预处理和APC组显示减少ROS生产( 与A / R组),而ad14-3-3治疗η听的RNAi预防与保护( 对周围组织)。显著增加ad14-3-3 ROS水平被发现ηRNAi-only集团( 与A / R组)。听和APC组,观察没有明显的统计学差异。以往的经验显示,氧化应激/ R损伤起着重要的作用。MDA含量和SOD和氧化酶活动往往是决定评估氧化应激水平。如表所示1/ R组,MDA含量明显增加( 与控制)和SOD和氧化酶活动明显减少( 与控制)。在周围的预处理和APC组织,降低MDA含量,提高SOD和氧化酶活动观察( 与A / R组)。然而,ad14-3-3ηRNAi部分倒听的心脏保护( 对周围组织)。观察周围的之间没有明显的统计学差异和APC组。

3.5。抑制线粒体易位沉默的bcl - 2 14-3-3η注射表达式废除听预处理的保护作用mPTP药物打开和Cyt c H9c2细胞释放/ R损伤

注射在mitochondria-mediated凋亡,mPTP药物打开是一个重要因素。因此,我们由Ca注射测量mPTP药物打开^{2 +}全身的线粒体肿胀。显著降低A520吸光度/ R治疗后观察,和周围的预处理消退这一现象(数字6(一)和6 (b))。此外,在ad14-3-3ηRNAi +听集团在A520吸光度下降相比,与周围的组织。此外,ad14-3-3η在A520 RNAi-only集团最大的减少。注射在一起,这些发现表明,mPTP药物打开可以缓解治疗周围,14-3-3η可拆卸的废除这一现象。因此,14-3-3η可能是周围的重要效应。观察周围的之间没有明显的统计学差异和APC组。

在注射的mPTP药物,proapoptotic因素将从线粒体释放到细胞质和诱导细胞凋亡。我们发现胞质cyt c的表达,注射指数mPTP药物,免疫印迹。数据6 (c)和6 (d)显示/ R损伤诱导cyt c的释放,周围的胞质cyt c的表达下降。此外,14-3-3η可拆卸的逆转听——的影响。观察周围的之间没有明显的统计学差异和APC组。

3.6。抑制线粒体易位沉默的bcl - 2 14-3-3η表达废除听预处理的保护作用Caspase-3 H9c2细胞活动受A / R损伤

caspase-dependent通路mitochondria-mediated细胞凋亡中起着重要的作用,和激活caspase-3-induced凋亡是不可逆转的18]。因此,caspase-3的活动是由一个比色测量方法如前所述[12]。如图7/ R组,caspase-3显著增加的活动( 和对照组)。此外,与A / R组相比,TSN-only caspase-3预处理组显示活动的减少( ),ad14-3-3ηRNAi部分废除保护听( )。此外,ad14-3-3ηcaspase-3 RNAi-only组显示显著增加活动( 与A / R组)。观察周围的之间没有明显的统计学差异和APC组。

3.7。抑制线粒体易位沉默的bcl - 2 14-3-3η表达废除听预处理的保护作用在H9c2细胞受到凋亡/ R损伤

/ R治疗后,收集细胞和膜联蛋白V-FITC / PI双染色和流式细胞仪分析了(数字8(一个)和8 (b))。数据表明,凋亡细胞的比例增加/ R损伤后 和对照组)。此外,治疗周围的有效地抑制细胞凋亡( 与A / R组)。然而,周围的保护作用是感染ad14-3-3后逆转ηRNAi ( 对周围组织)。此外,更高层次的ad14-3-3观察细胞凋亡ηRNAi-only集团( 与A / R组)。观察周围的之间没有明显的统计学差异和APC组。

4所示。讨论

在先前的研究中,Abdukeyum et al。10)提出了“营养预处理(NPC)”的假说,,自推出以来,一直是许多研究的焦点。根据全国人大的概念,必须使用的营养自然存在,可以通过饮食、无毒,在小剂量使用时表现出心血管效应(11]。在目前的研究中,我们表明,人大有效地预防心肌再灌注损伤(11,12]。听,丹参的主要生物活性天然萃取,被认为是饮食营养,是用来做汤,泡酒,泡茶,直到最近它被用作药。在亚洲国家,丹参一直用于治疗疾病和数百年一直在商用自然健康商店在美国和欧洲1,19]。Dashtdar等人报道,萃取从丹参证明低毒性与自然相比,合成化工产品(20.]。此外,胡锦涛等。3)报道,预处理与周围15天有显著改善梗死大小和肌酸激酶的活性在老鼠模型中。四周的临床试验表明,sulfotanshinone钠,听的磺酸盐,降低纤维蛋白原和改善心绞痛的严重程度在100年不稳定心绞痛患者(21]。在我们的研究中,我们用8显示预处理的细胞μM A / R前听感应导致时间减少LDH活性和时间增加细胞的可行性。确定周围的保护作用,我们建立了一个APC-delayed模型,作为一个积极的控制。APC-delayed模型代表了在体外相当于IPC-delayed模型。类似的保护IPC-delayed模型在活的有机体内,APC-delayed模型是一种生产性保护的方法对a / R损伤在体外(22,23]。在这项研究中,我们证明了周围的保护作用是不少于APC-delayed模型的保护作用。在一起,我们的研究结果表明心血管效应的听和听的潜力自然营养营养预处理。

虽然我们证实,周围有保护作用,其潜在的作用机制仍然是未知的。在之前的研究中,我们表明,听可以上调14-3-3的表达η(数据没有显示)。因此,我们评估了14-3-3潜在的关系η和周围的保护作用的机制。我们的研究主要是确认周围的保护作用是依赖于14-3-3的表达η和时间(数字1和2)。14-3-3的表达η是通过听预处理诱导期间/ R损伤。沉默的14-3-3η表达式由Ad14-3-3ηRNAi / R损伤加重。当细胞是用听预处理和ad14-3-3η14-3-3的RNAi,调节表达η部分废除和周围的保护作用也引起了。此外,ad14-3-3ηRNAi沉默14-3-3的表达η有辱人格的信使rna。这些数据表明,14-3-3η是听的主要目标和监管上可能在转录水平。

众所周知,14-3-3家庭通过蛋白质相互作用的蛋白质功能(24]。在先前的研究中,结果表明,14-3-3家庭与bcl - 2家族蛋白质蛋白质出现(25,26]。bcl - 2家族mitochondria-mediated凋亡通路中的蛋白质扮演关键角色(27]。Zhang et al。28]表明,预处理的心脏保护机制与周围注射有关mPTP药物。注射在目前的研究中,我们证明了mPTP药物打开是一个关键控制点线粒体外在和内在机制的破坏和bcl - 2家族蛋白能调节VDAC-1函数,它控制了大部分的代谢物注射调整mPTP药物打开(29日]。mPTP开放与线粒体基质肿胀(30.,这个过程是通过bcl - 2 (31日]。研究Mikhailov et al。32)和Garcia-Saez et al。33)报道,bcl - 2可以绑定和伯灵顿,导致线粒体外膜孔隙的形成。然而,当绑定到VDAC-1,它会导致注射抑制mPTP药物。然而,bcl - 2易位机制从细胞质中线粒体绑定VDAC-1仍不清楚。在我们的研究中,我们发现了一个显著的交互和colocalization 14-3-3η、bcl - 2和VDAC-1通过预处理/ R损伤(图之前听3)。这些初步的研究结果证实了我们的假设注射抑制mPTP药物打开认为bcl - 2胞质阻断VDAC-1直接通过绑定14-3-3η。进一步测试我们的假设,我们分离提取线粒体和线粒体蛋白质决定bcl - 2的表达(数字4(一)和4 (b))。我们的数据表明,线粒体bcl - 2的表达在提高A / R损伤后与对照组相比,这种现象是逆转减少14-3-3的表达η。也观察到类似的结果的比率colocalization bcl - 2和VDAC-1(数字之间4 (c)和4 (d))。综上所述,我们首先找到一个小说细胞内的分子机制。细胞暴露于A / R损伤时,细胞质bcl - 2转移到线粒体和阻塞VDAC-1通过绑定14-3-3η。

在几项研究,证明还有注射D是一个重大mPTP药物监管机构和注射诱导mPTP药物开30.]。各种蛋白质,如一半(34),PPARα(35,36],p53 [37,38),和bcl - 2 (39),还有已经被证明与D注射,从而调节mPTP药物。在这项研究中,虽然我们的研究结果证实,bcl - 2与14-3-3通过交互η,改变从细胞质到线粒体膜外,bcl - 2结合VDAC-1和注射关闭mPTP药物。然而,它还有可能,bcl - 2可能与注射D和调整mPTP药物,由14-3-3η。当然,这可能需要得到一系列额外的实验。

在我们之前的研究中,我们表明,抑制mitochondria-mediated凋亡途径可以有效地减少/ R损伤(40)和注射抑制mPTP药物开放改善心脏功能41,42]。此外,该机制TSN-induced心脏保护与抗氧化性能(3)和bcl - 2阻止活性氧损伤,cyt c释放和激活caspase-3 [31日,43注射),从而减轻mPTP药物,抑制cyt c版本,防止细胞凋亡。这部小说机制,抑制mitochondria-mediated细胞凋亡通路,需要进一步研究。在这项研究中,我们证实了A / R损伤诱导活性氧爆发(图5),MDA含量增加,SOD的含量减少,减少氧化酶活力(表1注射),增加了mPTP药物(数据6(一)和6 (b)),发布cyt c(数字6 (c)和6 (d)),激活caspase-3(图7),并诱导细胞凋亡(图8)。此外,听抑制ROS爆发(图5),降低MDA含量,提高SOD的活性和氧化酶(表1)、注射抑制mPTP药物打开(数字6(一)和6 (b)),减少cyt c版本(数字6 (c)和6 (d)),防止caspase-3激活(图7细胞凋亡(图)和预防8)。

5。研究的局限性

在这项研究中,我们使用H9c2细胞成肌细胞为研究对象。使用这些细胞获得的结果可能并不代表主要的潜在影响心肌细胞或一个完整的心肌。此外,我们使用了一个/ R模型来模拟再灌注损伤体内/体外模型,这可能限制结果的普遍性。

6。结论

虽然听的心血管效应一直在研究细胞,动物,和人类临床试验,使用营养预处理尚未探索的方法及其作用机理尚不清楚。在目前的研究中,我们发现小说的证据表明,听对A / R损伤潜在的有利影响。我们证明的作用机制可能与upregulation有关的14-3-3η注射,允许bcl - 2可能促使线粒体从而防止mPTP药物,抑制ROS破裂,减少cyt c版本,避免caspase-3激活,防止细胞凋亡。虽然我们的研究表明潜在的听习惯性的摄入量和一个新颖的机制在体外模型中,长期的分子和生理相关性这些发现在动物和人类在未来的研究显然是必要的。

缩写

APC:	缺氧的先决条件
A / R:	缺氧/复氧
BCA:	Bicinchoninic酸
BSA:	牛血清白蛋白
Cyt c:	细胞色素c
DAPI:	4 ,6-Diamidino-2-phenylindole
DCFH-DA:	Dichlorodihydrofluorescein二乙酸
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
DMSO溶液:	二甲亚砜
发射极耦合逻辑:	增强化学发光
FITC:	异硫氰酸荧光素
氧化酶:	谷胱甘肽过氧化物酶
IPC:	缺血预处理
LDH:	乳酸脱氢酶
MDA:	丙二醛
mPTP:	线粒体通透性转换孔
麻省理工:	甲基噻唑基四唑
全国人大:	营养预处理
PBS:	磷酸盐
机构:	p-Nitroanilide
PPC:	药物预处理
PVDF:	聚偏二氟乙烯
里帕:	Radioimmunoprecipitation化验
ROS:	活性氧
SDS /页面:	钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳
SOD:	超氧化物歧化酶
听:	Tanshinone花絮
VDAC-1:	压敏电阻器阴离子通道1。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

张的产品和欢他捐了同样的工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81160402,81160402,81660538)。