文摘

核pulposus-derived间充质干细胞(NPMSCs)显示一个好的前景椎间盘再生的组织)。然而,新鲜NPMSCs并不总是容易获得基础研究和临床应用。因此,需要一个有效的长期NPMSCs低温贮藏方法。本研究的目的是确定是否含淫羊藿(ICA)传统的冷冻保护剂浓度添加二甲亚砜(DMSO) NPMSCs更好的防冷冻的效果。结果表明,冻结方案包含ICA随着DMSO显著增加postthawed细胞生存能力,降低细胞凋亡率,改善细胞粘附,并维持线粒体功能,包含DMSO的冻结方案相比。和氧化应激的抑制作用和热休克蛋白(休克)upregulation ICA的存在也证实了ICA的有益作用。此外,ICA没有细胞毒性,并没有改变的特点postthawed NPMSCs。总之,这些结果表明ICA传统的冷冻剂的加入能提高生存能力和功能的冷冻保存人类NPMSCs和为人类提供了一个最佳的冻结方案制定NPMSC低温贮藏。

1。介绍

下腰痛(LBP)是一个在世界范围内最常见的健康问题,这造成了沉重的经济负担在全球范围内(1]。椎间盘变性)被认为是腰痛的主要原因(2]。然而,外科手术和保守治疗试管变性不持久和有效的限制,他们不能恢复试管组织(3]。在过去的十年中,补充外源性间充质干细胞(msc),如msc来源于骨髓和脂肪组织,表现出了积极成果的修复试管变性(4]。近年来,证据已经发现,内源性核pulposus-derived间充质干细胞(NPMSCs)自然存在于试管(5- - - - - -7]。作为一个新颖的方法来修复椎间盘变性、应用内源性NPMSCs已经显示出令人兴奋的前景,吸引了越来越多的关注8,9]。然而,刚收获和可行的再生医学NPMSCs并不总是可用的。因此,有效和长期保存的NPMSCs NPMSCs的应用是至关重要的。

低温贮藏是最重要和广泛使用的技术msc的长期保存。目前,现有的低温贮藏msc的方法可以分为两大类,缓慢冷冻和玻璃化(快速冻结)10]。但这两种方法都有一些显著的限制(11),有越来越多的证据显示传统低温贮藏方法的副作用msc、细胞毒性等标准的冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO),细胞凋亡,细胞结构破坏,氧化应激(12- - - - - -14]。最近,许多方法已经提出了一个更高效的低温贮藏中的应用msc、其中添加选定的代理在低温贮藏的解决方案已经显示出良好的应用前景[15,16]。

Icariin (ICA)是一种从茎叶中提取的主要活性成分淫羊藿brevicornum格言(17),其化学结构如图1(18,19]。大量的体外和体内研究表明ICA可以清除活性氧(ROS) (20.),发挥抗氧化作用在保护大脑和心脏21- - - - - -23]。此外,ICA antiapoptosis效应等广泛的药理作用,生殖效应、抗炎效果,immunoprotective效应(24,25]。由于其广泛的细胞保护作用,我们假设NPMSCs ICA可用于低温贮藏。因此,本研究旨在评估人类NPMSCs ICA对低温贮藏的影响。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

ICA(纯度> 98%)购买从南京Zelang制药技术(中国南京)。从σDMSO购买。标准的MSC扩张中,骨生成装备,脂肪生成工具,chondrogenic工具包从Cyagen购买生物科学有限公司(广州)。细胞计数kit-8 (CCK-8)从Dojindo购买(日本)。TUNEL染色购买从罗氏诊断GmbH(罗氏公司、德国)。Phalloidin共轭与Alexa萤石488和DAPI购买从σ。膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测装备,乳酸脱氢酶(LDH),细胞毒性试验装备,JC-1染色,ROS检测装备,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)试验设备,超氧化物歧化酶(SOD)试验装备,脂质过氧化反应丙二醛(MDA)试验设备,和西方和IP细胞裂解设备买来Beyotime生物技术研究所(Beyotime,中国)。主要抗体热休克蛋白(HSP) 90年,HSP70和HSP27从圣克鲁斯生物技术有限公司购买主要抗体β肌动蛋白和所有二级抗体用于免疫印迹买来Proteintech(武汉,中国)。荧光标记的人类单克隆抗体购自BD Pharmingen(正迪金森,圣何塞,CA)。

2.2。隔离和NPMSCs文化

人工髓核(NP)样本来自五个病人经历了椎间盘退行性椎间盘疾病,和所有病人的细节补充表所示S1。临床研究伦理委员会批准的所有程序都是同济医科大学、华中科技大学。分离、培养的NPMSCs与少量修改(如前所述26,27]。用磷酸盐(PBS),洗净后NP组织解剖和消化0.2% II型胶原酶在一夜之间37°C。然后,部分消化离心收集的组织和细胞中解放出来,享年300岁5分钟和培养标准MSC扩张中,组成的杜尔贝科修改鹰的中低葡萄糖(DMEM-LG), 10%胎牛血清的边后卫,2更易/ Ll谷氨酰胺,1%青霉素和链霉素在37°C公司为5%₂。24小时后,碎片和悬浮细胞被移除,贴壁细胞被完全替代喂养中每隔一天。文化是1:2亚文化当细胞达到80 - 90%的融合。在第三代细胞用于这项研究。和使用样品的细节补充表所示S2。

2.3。低温贮藏和解冻

如前所述(执行的低温贮藏过程28,29日]。NPMSCs使胰蛋白酶化,洗,resuspended 10⁶细胞在不同的冷冻剂/毫升配方含有10% DMSO溶液或10% DMSO和25μM ICA的冷冻保护剂DMEM-LG补充20%的边后卫。细胞悬液(1毫升)被转移到每个cryovial然后放置在一个可控速度冷冻容器。当实现−80°C, cryovials从容器中删除并保存在液氮。一周后,NPMSCs取出液氮和解冻迅速在37°C水浴,然后转移到离心的标准MSC扩张中,享年300岁为5分钟。颗粒状NPMSCs resuspended,培养标准MSC扩张中,解冻后,得到了大约80%的细胞。实验中使用的组织如下:(I) noncryopreserved NPMSCs被用作控制,(2)DMSO, (3) DMSO + ICA。

2.4。CCK-8化验

NPMSCs被播种在96孔板(0.5×10⁴每口井),然后用不同浓度(0、6.25、12.5,25岁,50岁,和100年μ米)的ICA表示时间(1、3、5、7天)。细胞增殖是由CCK-8试验来评估ICA的细胞毒性。确定ICA的细胞生存的影响noncryopreserved NPMSCs和postthawed NPMSCs,细胞与不同的治疗被播种在96孔板和培养24小时。然后,细胞生存能力由CCK-8分析决定。所使用的吸光度检测在450海里。

2.5。观察细胞形态

24小时后解冻,倒置显微镜下观察细胞(奥林巴斯、日本)。为了进一步确定细胞凋亡,TUNEL染色使用更加敏感。NPMSCs固定在4%多聚甲醛1 h,然后用0.1% permeabilized tritonx - 100 10分钟。接下来,这些细胞被洗两次与PBS和孵化与TUNEL染色1 h 37°C在黑暗中,遵循制造商的协议。倒置荧光显微镜下观察凋亡细胞(奥林巴斯、日本)。

2.6。细胞凋亡率

细胞凋亡率是衡量膜联蛋白V-FITC /π协议后细胞凋亡检测设备如前所述[30.]。在500年短暂,NPMSCs resuspendedμL绑定缓冲解冻的24 h后,和5μL膜联蛋白V-FITC和π补充道。然后,样本孵化在黑暗中在室温下15分钟。流式细胞术分析的细胞凋亡率(BD LSR II,正欲)。

2.7。细胞粘附和丝状肌动蛋白分布

NPMSC坚持盖玻片表面是由测量细胞骨架的分布丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白)沾phalloidin共轭Alexa萤石488。的postthawed NPMSCs被越来越多的盖玻片24 h和固定在4%多聚甲醛。然后,这些细胞被permeabilized tritonx - 100的0.5%。与PBS洗两次后,这些细胞被沾phalloidin共轭Alexa萤石488和DAPI,分别。染色细胞成像的共焦激光扫描显微镜(LSM、蔡司、德国)。

2.8。LDH-Cytotoxicity化验

noncryopreserved msc和postthawed msc被播种在96孔板培养24小时。文化上层的收集,分析了LDH的释放LDH-cytotoxicity化验设备,根据制造商的指示。

2.9。线粒体膜电位(MMP)测定

JC-1阳离子染料,展品potential-dependent积累在线粒体,表示从绿色到红色荧光发射转变。MMP减少时,红/绿色荧光的比例将下降。JC-1染色设备是用来测量MMP在这项研究中。MMP测定染色溶液是由混合标准MSC扩张中、JC-1工作解决方案1:1 (v/v)。noncryopreserved msc和postthawed msc在染色的解决方案在黑暗中孵化37°C半个小时。然后,染色的细胞被resuspended缓冲区(1 x)和测量MMP的流式细胞术。MMP的值被表示为红色比绿色荧光强度。

2.10。ROS化验

细胞内ROS水平测量使用ROS检测设备。noncryopreserved msc和postthawed msc与2,孵化7-dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA)在黑暗中37°C为30分钟。然后,细胞被洗两次与PBS和测量ROS生产通过流式细胞术(BD LSR II,正欲)后,制造商的指示。

2.11。细胞内氧化产品和还原物质化验

细胞是细胞溶解在冰上西方和IP细胞裂解设备使用。蛋白质浓度测定用BCA蛋白质化验设备。GPx的活动和SOD和MDA的细胞内容分析了根据制造商的指示。

2.12。免疫印迹分析

细胞细胞溶解在冰与西方和IP细胞溶菌作用工具包。然后,蛋白质提取离心收集的12000 g×10分钟在4°C。蛋白质转移后,膜被封锁的脱脂牛奶,然后孵化一夜之间在4°C与人类一半寿命多克隆抗体(1:1000),HSP70 (1: 1000), HSP27 (1: 1000)β肌动蛋白(1:5000)。洗了三遍后,与二次孵化抗体膜在室温下1 h在黑暗中。最后,使用增强化学发光的蛋白质检测方法后,制造商的指示。

2.13。表面标记识别

msc被确定的表面标记流式细胞术协议后如前所述[26]。收集到的细胞用PBS和彩色荧光标记的人类单克隆抗体CD105, CD73, CD90、CD34和HLA-DR。然后,通过检查标记细胞流式细胞术(BD LSR II,正欲)。

2.14。Multilineage分化

评估NPMSCs multilineage分化的潜力,成骨、脂肪形成的,和chondrogenic分化诱导。对于成骨分化,NPMSCs与茜素红染色后21天文化协议后骨生成工具。脂肪形成的差异化,NPMSCs沾了油红O后14天文化协议后脂肪生成工具。chondrogenic分化,NPMSCs与甲苯胺蓝染色后21天的文化协议后chondrogenic工具包。

2.15。统计分析

使用GraphPad棱镜6进行了统计分析软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。所有数据都从至少三个独立的实验,提出了获得平均值±标准偏差(SD)。多组数据分析单向方差分析(方差分析)测试,其次是图基的事后考验。学生的测试被用于双官能团的分析参数。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。ICA增加了细胞的可行性Postthawed NPMSCs

如图2(一个),ICA对NPMSCs没有细胞毒性。评估的影响ICA在细胞的可行性postthawed NPMSCs, CCK-8试验进行。结果表明,NPMSCs冻存的可行性和DMSO对照组(图56.46±0.66%2 (b), )。为NPMSCs低温贮藏DMSO和ICA, ICA (12.5 -100μ米)显著增加的可行性postthawed NPMSCs ( 以最大的可行性),观察到的浓度为25μ浓度(25μ米)的ICA用于以下实验。

3.2。保护作用的ICA在凋亡细胞死亡Postthawed NPMSCs

经过24小时的文化,postthawed NPMSCs低温贮藏和DMSO传播不甚至一些细胞表现出收缩形态。此外,TUNEL染色显示TUNEL-positive细胞冻存时DMSO增加。正如所料,ICA减毒细胞凋亡的形态学变化指示性(数据3(一个)和3 (b))。测量的细胞凋亡率postthawed NPMSCs,膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备使用。结果表明,细胞凋亡率postthawed NPMSCs低温贮藏和DMSO显著高于控制(数字3 (c)和3 (d), ),ICA可以部分降低细胞凋亡率。有趣的是,ICA主要减少凋亡细胞的比例在早期阶段(数字3 (c)和3 (d), )。

3.3。ICA对分配的影响f -肌动蛋白和细胞粘附Postthawed NPMSCs

荧光图像表明,noncryopreserved NPMSCs展出正常成纤维细胞样的形状和完整的f -肌动蛋白经过24小时的组织文化。然而,f -肌动蛋白的损失分布和受损细胞粘附在postthawed观察和DMSO NPMSCs冻存。和ICA恢复f -肌动蛋白分布的部分损失,提高了细胞(图的坚持4(一))。LDH的释放被LDH-cytotoxicity化验设备,测量和分析了HSP27的表达蛋白免疫印迹。结果表明,LDH水平明显高于和HSP27表达显著低于postthawed NPMSCs低温贮藏和DMSO,支持细胞膜损害的存在。然而,ICA部分逆转变化和维持细胞膜完整性(数字4 (b)- - - - - -4 (d), )。

3.4。ICA抑制MMP的减少(ΔΨm)

线粒体的功能NPMSCs被MMP的分析评估。相比noncryopreserved NPMSCs, postthawed NPMSCs低温贮藏和DMSO溶液表现出红/绿荧光比率的显著降低,这表明减少ΔΨm和受损的线粒体功能的存在。毫不奇怪,ICA显著抑制ΔΨm的减少和改善线粒体功能postthawed NPMSCs(图5, )。

3.5。ICA减少氧化应激的Postthawed NPMSCs

调查是否涉及的抗氧化功能的细胞保护作用在低温贮藏NPMSCs ICA,细胞ROS、MDA氧化产品,还原物质(SOD、GPx)被检测到。如图6显著增加ROS、MDA含量和SOD、GPx活动显著下降被观察到在postthawed NPMSCs和DMSO低温贮藏。然而,ICA的内容减少ROS、MDA和SOD、GPx postthawed的活动改善NPMSCs ( )。

3.6。ICA对热休克蛋白的表达Postthawed NPMSCs

以及HSP70的表达是通过免疫印迹分析。数据表明ICA显著的调节以及HSP70的表达postthawed NPMSCs(图7, )。并没有明显区别noncryopreserved NPMSCs与对照组postthawed NPMSCs和DMSO低温贮藏。结果表明,更高的表达以及HSP70在ICA的存在可能会提高生存能力和功能postthawed NPMSCs。

3.7。ICA不会改变的特点Postthawed NPMSCs

虽然细胞保护作用的ICA在低温贮藏NPMSCs证实,ICA是否改变的特点postthawed NPMSCs还不清楚。调查ICA是否影响的特点postthawed NPMSCs,我们评价MSC-associated表面标记物的表达水平和NPMSCs冻存的multilineage分化潜力DMSO和ICA。如图8,NPMSCs低温贮藏DMSO和ICA表现出类似的干细胞特征的noncryopreserved NPMSCs和低温贮藏NPMSCs DMSO溶液。更具体地说,NPMSCs低温贮藏和DMSO和ICA高表达水平的标记(CD105, CD73, CD90)积极在msc和低表达的标记(CD34和HLA-DR)在msc(图通常是负面的8(a))。与此同时,NPMSCs可以诱导分化为骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞(数字8(b) -8(d))。

4所示。讨论

最近,越来越多的证据证明存在的内源性msc在试管内,包括NPMSCs fibrosus-derived msc、环和软骨endplate-derived msc (31日,32]。其中,NPMSCs发挥重要作用在维持体内平衡和再生的退行性试管(33]。更重要的是,据报道,内生NPMSCs表现出极大的优势适应IVD-like不利微环境在某些体外研究[34,35]。因此,内生NPMSCs的应用提供了一种新颖的和有前途的战略试管变性的修复。然而,刚收获和可行的NPMSCs并不总是可用的基础研究和临床应用,和持续供应和运输NPMSCs必须依靠有效的细胞冷冻保存技术。

在传统的MSC低温贮藏过程中,细胞被冻结在低温贮藏代理包含DMSO (36]。msc被冷却的−−1°C /分钟降到了80°C,然后转入液氮罐。解冻后,可以使用msc在完全培养基37°C (37]。尽管这种传统低温贮藏方法增加了msc的访问和可用性,仍有需要克服的巨大挑战。据报道,标准化冷冻保存剂DMSO可能抑制体外细胞生存能力38),产生许多不良反应在低温贮藏干细胞移植的患者39,40]。和低温贮藏期间,温度和渗透性的变化将导致活性氧的增加,线粒体损伤,细胞结构破坏,细胞凋亡11]。由于这些细胞损害有经验在低温贮藏和解冻,msc将负面影响的功能(41]。因此,最佳的低温贮藏方法和更好的防冷冻的代理需要开发维护的可行性和功能postthawed msc。

在目前的研究中,一种新型配方含有ICA在DMSO溶液的低温贮藏媒体开发探索人类NPMSCs ICA在冻存的细胞保护作用。结果表明,ICA没有细胞毒性,可以显著提高的可行性postthawed NPMSCs。和低温贮藏相比媒体仅包含DMSO, ICA的显著减少凋亡细胞死亡在postthawed NPMSCs。此外,据报道,依从性下降可能与细胞骨架的完整性的破坏细胞膜的完整性,这可能表明f -肌动蛋白的分布和LDH的释放,分别为(16,42]。研究结果表明ICA部分逆转受损细胞粘附postthawed NPMSCs通过提高f -肌动蛋白的损失分布和减少LDH的释放。此外,数据表明,ICA的加入显著增加的ΔΨm和改善线粒体功能postthawed NPMSCs。综上所述,上述结果表明,除了传统的ICA低温贮藏中改善人类NPMSCs postthawed复苏。

氧化应激被证实存在于冻融细胞(41,43]。在冻融过程中,过量的活性氧积累。过多的活性氧产量可能导致氧化还原系统的失衡,导致氧化应激(43]。ICA可以作为活性氧清除剂和发挥抗氧化作用的保护细胞不受氧化应激(44]。因此,我们假设ICA可能提高低温贮藏的可行性和功能人类NPMSCs通过抑制氧化应激。来验证我们的假设,我们发现细胞内ROS和氧化还原物质的内容。数据显示的ICA显著降低ROS生产postthawed NPMSCs。同时,MDA,脂质过氧化的产物,减少NPMSCs低温贮藏ICA和DMSO溶液。数据还显示,ICA的加入显著提高SOD、GPx活性的,证明了抗氧化(45]。我们的研究结果表明ICA可以改善人类NPMSCs postthawed复苏,至少在某种程度上,通过减少氧化应激。

热休克蛋白的一个家庭功能,促进蛋白质折叠和维护其他蛋白质的结构和功能在细胞暴露于不同的压力条件下(46]。热休克进行分类根据分子量和包括大型热休克,一半,HSP70、HSP60, HSP40和小热休克(47]。HSP27、HSP70和一半类低温贮藏的休克蛋白被广泛研究。据报道,HSP27表达与细胞膜完整性的维护42]。我们的研究结果表明ICA调节HSP27的表达和维护的细胞膜完整性postthawed NPMSCs。本研究中的数据还建议增加ICA可以增加以及HSP70的表达,已建议将积极与postthawed MSC可行性和功能联系起来,并能提高postthawed冻存的细胞复苏MSC (16,48]。这些结果表明ICA在冻存的细胞保护作用NPMSCs热休克的upregulation有关。

成功的低温贮藏媒体不仅能保证postthawed细胞的细胞生存能力和功能,也保护他们的特点14]。因此,我们评估的特点postthawed NPMSCs低温贮藏与ICA和DMSO调查ICA是否改变的特点postthawed NPMSCs。结果表明,表面标记和multilineage分化潜力postthawed NPMSCs低温贮藏与ICA和DMSO类似noncryopreserved NPMSCs和完成标准的MSC表示国际社会的细胞治疗(ISCT) [49]。它证明了ICA的加入没有影响的特点postthawed NPMSCs。

当然,这项研究有一些局限性。首先,本研究中使用的NPMSCs获得退化NP组织。据报道,细胞变性和nondegenerative盘表现出不同的生物学行为50]。因此,进一步的研究与细胞从nondegenerative NP获得组织需要开展。第二,NPMSCs只有一个星期在这个研究低温贮藏,低温贮藏时间是临床实践的缩写。因此,进一步的研究需要和不同的低温贮藏时间较长的。最后,我们与ICA低温贮藏NPMSCs 25的浓度μm .但当我们ICA的浓度升高至50μ米,ICA的细胞保护作用下降。一些先前的研究表明,适当的ROS水平发挥着重要作用在正常生物过程(21,51]。减少保护作用可能与过度ROS-scavenging ICA在高浓度的函数。所以,具体的分子机制还有待探索。

总之,在我们的研究结果表明,ICA多个影响postthawed NPMSCs,包括增加细胞活力,减少凋亡细胞死亡,改善细胞粘附,并维持线粒体功能。和ICA可能发挥这些保护作用通过抑制氧化应激,提高休克蛋白的表达。此外,ICA没有细胞毒性,可以保存的特点postthawed NPMSCs。因此,将ICA添加到传统的低温贮藏媒体可以帮助人类NPMSCs提高低温贮藏的可行性和功能。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

马Zengwu邵、陈盛和打算的构思和设计实验。盛陈和象屿邓小平进行实验。Lei赵和东华黄分析数据,数据准备,写的原稿。李倪志亮修订后的手稿。所有作者回顾了手稿。

确认

本研究支持中国国家重点研发项目批准号2016 yfc1100100和中国国家自然科学基金重大研究计划资助。91649204。

补充材料

表S1:特征纳入本研究的患者的细节。表S2:细节纳入本研究的样本的使用。(补充材料)