文摘

Hancornia叶戈梅斯是果树,俗称mangaba树,这是巴西普遍存在的问题。这种植物的叶子被用于传统医学药用用途。因此,本研究的目的是执行一个物理化学特征,识别出亲脂性的抗氧化剂和脂肪酸,并确定的微生物质量和安全h .叶叶子。此外,抗氧化、抗诱变剂的和ethanolic提取物的抑制活动h .叶树叶(EEHS)对酶与神经退行性疾病、炎症、肥胖和糖尿病。此外,本研究旨在评估在活的有机体内影响EEHS normoglycemic和糖尿病的血糖Wistar鼠。物理化学特性是由比色法和火焰离子化检测气液色谱法(GC-FID)。有氧嗜温菌的菌落总数、霉菌和酵母。总大肠菌群与大肠杆菌计算使用SimPlates工具包,sulphite-reducing梭状芽胞杆菌孢子是量化使用sulphite-polymyxin-sulfadiazine琼脂法。沙门氏菌使用1 - 2种虫害检测测试。EEHS衡量其抗氧化活性的抑制2,2 -azobis (2-amidinopropane)盐酸盐(AAPH)诱导人类红细胞氧化溶血。抗诱变剂的活动决心使用艾姆斯测试。butyrylcholinesterase乙酰胆碱酯酶,酪氨酸酶、透明质酸酶,脂肪酶,α淀粉酶,α糖苷酶enzyme-inhibiting活动进行评估并与商业控件。的在活的有机体内影响EEHS评估使用口服葡萄糖耐量试验normoglycemic Wistar鼠和测量糖尿病大鼠的血糖水平。结果表明理化参数的叶子的微生物质量和安全h .叶以及抗氧化和抗诱变剂的活动和抑制酶相关的神经退行性疾病,炎症、肥胖和糖尿病。在在活的有机体内化验,结果表明:normoglycemic老鼠挑战与葡萄糖过载显示显著降低血糖水平当EEHS治疗。综上所述,结果确保微生物质量和安全以及显示内容的类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸h .叶叶子。此外,抗氧化、抗诱变剂的抗炎,anti-Alzheimer病,anti-Parkinson的疾病,各类典型,降糖药EEHS的展示活动。

1。介绍

在不同的文化在世界范围内,药用植物用于治疗的目的。虽然这些材料的微生物质量仍很少讨论,有必要实现预期的药理效果。植物材料为药用目的需要接受的微生物污染水平和没有恶化或病原微生物(1]。这些基本标准必须评估和跟踪获取植物样品质量,安全,和治疗效果2,3]。

在巴西,一些植物用于传统医学,包括Hancornia叶戈麦斯(h .叶)。这种水果树,俗称mangaba树,属于夹竹桃科的家庭,和它的叶子是卖茶4]。发现这个物种原产于巴西和亚马逊,Caatinga,和大西洋森林以及塞拉多(巴西草原)的生物群落。

抗氧化,抗菌,细胞毒性4,抗炎5,6),愈合(6),血管舒张(7,8,抗高血压9,10,抗糖尿病的11],acetylcholinesterase-inhibiting [12)的活动h .叶树叶已被描述。之前报道的植物化学的研究h .叶叶提取物显示一个复杂的化学成分。的鉴定化学成分与生物活性包括L - (+) -bornesitol,奎尼酸、绿原酸、山柰酚、槲皮素,isoquercetin,芸香苷、儿茶素类黄酮(4,5,11,13,14]。最近,巴斯托斯et al。15)确定其他酚类化合物,包括咖啡酸、原儿茶酸异构体、表儿茶素、槲皮素异构体,b型和c型原花青素,coumaroylquinic酸异构体,根皮甙,根皮素,圣草酚,木樨草素和芹菜甙元。天然提取物和酚类衍生物药物潜在的可以作为一个安全的和具有成本效益的治疗策略替代合成药物(16- - - - - -19]。

植物来源的生物活性化合物,使用大约80%的世界人口,为茶或者药品(20.]。此外,天然产品或衍生品的过程中扮演着重要角色的发展和新发现的化合物或药物(21]。在过去的三十年里,药物开发从天然产物是著名的因为药物可用于治疗,50%的阿尔茨海默氏症、帕金森病为8%,27%,炎症,16%肥胖,糖尿病和57%是直接或间接来自天然产物(21]。

因此,本研究的目的是执行一个物理化学特征,识别出亲脂性的抗氧化剂和脂肪酸,并确定的微生物质量和安全h .叶叶子。此外,抗氧化、抗诱变剂的对酶和抑制活动与神经退行性疾病、炎症、肥胖和糖尿病的ethanolic提取h .叶叶子(EEHS)进行调查。此外,本研究旨在评估在活的有机体内影响EEHS normoglycemic和糖尿病的血糖Wistar鼠。

2。材料和方法

2.1。植物材料和乙醇提取制备

h .叶树叶收集后确定植物和生物多样性收到巴西的许可授权和信息系统(Sistema de Autorizacao e independent em Biodiversidade SISBIO;号54470 - 1)。Dourados植物材料收集,南马托格罗索州的状态(21°59 41 南部和55°19 24 西),巴西,干对流烤箱的温度45±5°C,在威利切碎机和地面。凭证标本的标本存放在Grande Dourados的联邦大学,南马托格罗索州的州,巴西,在记录编号4774。浸渍提取制备的植物材料在96%乙醇(1:10, / )。混合物在室温下保持了14天。随后,提取过滤,集中在真空下的旋转蒸发器(Gehaka、圣保罗、SP、巴西),和冻干。EEHS最终收益率为28%,是储存在−20°C在黑暗中。类黄酮芦丁,儿茶素,isoquercetin之前确定与二极管矩阵的高效液相色谱EEHS detection-tandem质谱(HPLC-DAD-MS / MS) (4),在这项研究中,使用从Sigma-Aldrich购买。

2.2。理化分析
2.2.1。灰分含量

方法用于确定的灰分含量h .叶叶子的浆果,250毫克的叶样品。测试进行了一式三份,结果表示为g / 100克的样品(22]。

2.2.2。总蛋白质含量

蛋白质含量是决定采用凯氏法(230 - kjeltec分析仪,自由/开源软件Tecator Hoganas,瑞典),所述的Nogueira et al。23]。蛋白质的浓度是由总氮的价值乘以系数5.75 ( )。测试进行了一式三份,结果表示为g / 100克样品。

2.2.3。总脂质

粗脂肪是由重力测量与石油醚萃取后使用一个自动Soxtec装置(自由/开源软件,Soxtec™2050年Hoganas,瑞典)(22]。测试进行了一式三份,结果表示为g / 100克样品。

2.2.4。碳水化合物和能量

样品的碳水化合物含量计算由以下区别:100−+ g (g蛋白脂质灰+ g)。总能量计算使用以下方程:能源(千卡)= 4×(g蛋白质+ g碳水化合物)+ 9×(g油脂)。测试进行了一式三份,结果表示为克/ 100克样品的碳水化合物和能量100千卡/克样品。

2.2.5。亲脂性的抗氧化剂

亲脂性的抗氧化剂β胡萝卜素、番茄红素和叶绿素a和b确定使用干和粉(150毫克)大力搅拌叶样品在10毫升acetone-hexane混合物(4:6, / )1分钟,透过绘画纸®4级定性滤纸。滤液的吸光度为453,505,645,663海里。的β胡萝卜素、番茄红素和叶绿素a和b内容使用以下公式计算:β胡萝卜素(毫克/ 100毫升)= 0.216×a663 - 1.220×A645−0.304×A505 + 0.452×A453;番茄红素(毫克/ 100毫升)=−0.0458×A663 + 0.204×A645 + 0.304×A505−0.0452×A453;叶绿素(毫克/ 100毫升)= 0.99×A663−0.0989×A645;和叶绿素b(毫克/ 100毫升)=−0.328×A663 + 1.77×A645。结果表示为毫克/ 100克的样品(23]。

2.2.6款。脂肪酸组成

总脂质提取干和粉叶的样本h .叶受到与2.5毫升的甲醇酯交换,1.25毫升的硫酸和1.25毫升的甲苯(2:1:1的比例( / )至少12 h在水浴50°C和160 rpm。这一时期之后,3毫升的去离子水和3毫升的乙醚补充道。混合搅拌,站到相分离。上阶段的脂肪酸甲酯(饥饿)恢复使用无水硫酸钠微柱凝集和转移到使用0.2的玻璃小瓶μ米微孔尼龙过滤器之前注入装置(24]。示例饥饿与火焰离子化检测气相色谱法测定(GC-FID) 1000年达尼的毛细管柱GC色谱(Izasa,巴塞罗那,西班牙),配备了分流/不分流进样注射器,火焰离子化检测器,Macherey-Nagel列(30 m×0.25×0.32毫米IDμm df)。列的初始温度是50°C 2分钟,其次是30°C /分钟增加到125°C,一个5°C /分钟增加到160°C,一个20°C /分钟增加到180°C,和一个3°C /分钟增加到200°C。最后,温度增加20°C /分钟到220°C的极限,在那里举行了15分钟。总分析时间为35.16分钟。气体(氢气)维持在4.0毫升/分钟的流量(0.61条)在50°C。注射执行(1:40)在220°C。为每个分析,1μL(样本注入GC。脂肪酸被确定通过比较峰的保留时间标准的饥饿(Supelco 37组件名声混合)与样本饥饿。结果使用日间1.7处理软件(DataApex 1.7,布拉格,捷克共和国)和数据表示为每个脂肪酸的相对比例。

2.3。微生物测试

以下参数评估:嗜中温微生物、霉菌、酵母、大肠杆菌群,大肠杆菌,sulphite-reducing梭状芽胞杆菌孢子,沙门氏菌spp。所有微生物测试进行了一式三份。

2.3.1。样品制备

样本的准备如前所述,戈麦斯et al。25]。为此,25克的干粉状的叶子h .叶无菌称重和均质使用三角胸衣Lab-Blender(西沃德400型、伦敦、英国)3分钟与225毫升无菌蛋白胨生理盐溶液(0.1%蛋白胨+ 0.85%氯化钠在无菌的去离子水,pH = 7.0±0.05)。24小时后,连续稀释准备从这个匀浆(初始稀释)相同的无菌稀释剂,用于量化不同的微生物。

2.3.2。嗜中温总数

嗜中温需氧微生物被数增加1毫升每稀释的叶子h .叶板计数琼脂(PCA)媒体(Himedia,孟买,印度),根据葡萄牙法律378826]。微生物计数表示为每克菌落(cfu / g)的样本。

2.3.3。霉菌和酵母菌计数

霉菌和酵母计数增加1毫升的叶子的稀释h .叶在酵母蛋白胨葡萄糖琼脂(PDA)媒体(Himedia,孟买,印度)孵化25°C 5天(27]。微生物计数表示为每克菌落(cfu / g)的样本。

2.3.4。金黄色葡萄球菌数

金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌根据协议NP)量化4400 - 1 (28]。连续稀释的叶子h .叶被接种Baird-Parker肉汤和蛋黄亚碲酸盐乳剂(Himedia) 24小时(37°C)。随后,三到五个典型的殖民地被选为凝固酶和过氧化氢酶的存在控制。微生物计数表示为cfu / g的样本。

2.3.5。总大肠菌和大肠杆菌计数

总大肠菌和大肠杆菌(大肠杆菌使用SimPlate方法)计算(29日),根据制造商的说明和程序。

为此,1毫升整除的连续稀释的叶子h .叶涨跌互现9毫升的蓝色的解决方案提供的制造商和分发到SimPlate中心的设备。SimPlate经历了轻微的旋转驱散样本和消除气泡。样本在37±1°C孵化24至48 h。积极的数总大肠杆菌群是基于改变颜色从蓝色,粉色,和积极的计数大肠杆菌基于颜色和紫外荧光的变化。大肠杆菌群,大肠杆菌被计数量化积极井的数量,其次是相关换算表,和结果表示为cfu / g的样本。

2.3.6。枚举的Sulphite-Reducing梭状芽胞杆菌孢子

的枚举亚硫酸盐-减少梭状芽胞杆菌孢子、0.1、1、5、10毫升整除的初始稀释被添加到空管,加热到80°C的5分钟和孵化与铁亚硫酸盐琼脂(ISA)媒体30.在37°C)在厌氧条件下5天。结果确定基于sulphite-reducing的枚举梭状芽胞杆菌孢子在0.01 g的示例,并表示作为样本的cfu / g。

2.3.7。沙门氏菌spp。检测

沙门氏菌仕达屋优先计划。被发现使用免疫扩散1 - 2测试(29日]。测试是由增加100μL的样本(初始稀释)preenriched缓冲蛋白胨水和50μL的特定抗体检测组件中。确认immunoband形成,测试样本读16 - 20 h的孵化后37°C。

2.4。抗氧化活性评价
2.4.1。人类红细胞悬浮液的制备

人类外周血的协议收集研究伦理委员会批准(拉西德Etica em尽管(CEP)的大学中心Grande Dourados (Centro da Grande Dourados大学),巴西(CEP数量123/12)过程。外周血收集后,从人类健康的捐赠者他们签署了知情同意书。样本转入管与柠檬酸钠作为抗凝剂和离心机在1500 rpm 10分钟在4°C hemocomponents分离。血浆、白细胞被移除的薄层。的红细胞被洗了三次磷酸盐(PBS, pH = 7.4)和离心机在1500 rpm 10分钟每个洗4°C。最后,2%的比容悬挂在PBS准备。

2.4.2。Antihemolytic活动

进行了化验的红细胞悬液(2%)preincubated在37°C和20 30分钟μg / mL EEHS或黄酮芦丁,儿茶素,或单独isoquercetin,随着在二甲亚砜(DMSO溶液;最终浓度高达0.08%)。这一时期之后,50 mM 2 2 -azobis (2-amidinopropane)盐酸盐(AAPH)的解决方案是添加到组进行溶血感应。这个混合是在37°C的环境4 h和频繁的搅拌。红细胞孵化与PBS、提取和类黄酮仅被用作消极的控制。每60分钟的孵化后,样本在4000转离心10分钟,和一个整除收集浮在表面的,其次是在PBS稀释。然后,样本在545海里。溶血的百分比计算使用公式 ,在那里 代表了样品吸光度和 代表总溶血(红细胞在蒸馏水)。一式三份的进行了分析。百分比值是第三小时的潜伏期。抑制溶血的百分比作为样本浓度的函数也从量效曲线确定。

2.5。抗诱变剂的活动

抗诱变剂的活动是评估使用艾姆斯测试,与一些修改(31日]。两个菌株用于试验,鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100,转基因与组氨酸运营商基因的突变,导致菌株生长histidine-dependent的方式。的活动直接诱变剂叠氮化钠(SAZ)和4-nitroquinoline 1-oxide (4 nqo)和间接诱变剂黄曲霉毒素(AFB1)进行评估。诱变活性的抑制率引发的EEHS (5 - 15μg / mL)和类黄酮(0.1 - -0.5μg / mL)计算使用以下方程: ,在那里 是回复突变的诱变剂的存在和数量吗 是回复突变体的数量减去后的诱变剂和样本自发回复突变体的数量。值> 80%可行的细胞被认为是无毒而消极的控制能力。抗诱变剂的效果被认为是温和的抑制作用范围从25 - 40%,大于40%时高。影响低于25%被认为是无关紧要的,无视。

2.6。Enzyme-Inhibiting活动评估
2.6.1。Cholinesterase-Inhibiting活动

acetylthiocholinesterase -(疼痛)和butyrylthiocholinesterase (BChE)抑制活动评估基于Senol描述的分光光度法测定et al。32使用acetylthiocholine和butyrylthiocholine作为基质。能整除的50μL EEHS或类黄酮(200 - 700μg / mL)稀释EtOH /磷酸缓冲(0.1毫米,pH = 8)和25孵化μL乙酰胆碱酯酶(疼痛)电鳗美国(vi、EC 3.1.1.7 Sigma-Aldrich)和125年μ5、5的L -dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(0.01米)(美国Sigma-Aldrich DTNB) 15分钟25°C。同样的程序进行评价的活动butyrylcholinesterase (BChE)马血清(美国Sigma-Aldrich EC 3.1.1.8)。随后,反应是发起的25μL的基质acetylthiocholine氯化碘和butyrylthiocholine(美国Sigma-Aldrich 0.075米),分别稀释EtOH /磷酸盐缓冲剂(0.1毫米,pH = 8)。底物的水解是监控的形成黄色5-thio-2-nitrobenzoate阴离子的反应5,5 -dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(0.01)(DTNB Sigma-Aldrich,欧洲大学协会)在412海里。所有的测试进行了一式三份。毒扁豆碱(0.001 - -0.01μg / mL)(美国Sigma-Aldrich)作为参考。疼痛的百分比/ BChE酶抑制测定比较样品的反应速率与空白相比(乙醇在磷酸盐缓冲剂(0.1毫米,pH = 8))使用以下公式: ,在那里 是没有测试样品和酶活性 是酶活性与测试样本。的集成电路50值计算。

2.6.2。Tyrosinase-Inhibiting活动

tyrosinase-inhibiting活动被Orhan评估使用描述的方法和汗33),做了一些调整。能整除的25μL EEHS或类黄酮(50 - 1000μ40 g / mL)涨跌互现μL酪氨酸酶的解决方案(EC 1.14.1.8.1 30 U蘑菇酪氨酸酶,Sigma-Aldrich, 200 U /毫升)和100年μL磷酸缓冲溶液的pH值(6.8)96孔酶标,孵化为15分钟37°C。随后,40μL(左旋多巴(3 4-dihydroxy-L-phenylalanine)被添加到混合是孵化10分钟37°C。吸光度的阅读了492海里。曲酸(2.5 -20μg / mL)被用来作为参考。

所有的测试进行了一式三份。酪氨酸酶抑制的百分比计算使用以下公式:%抑制=[(空白吸光度−样品吸光度)/空白吸光度)×100。的集成电路50值计算。

2.6.3。Hyaluronidase-Inhibiting活动

描述的试验进行了凌et al。34),做了一些调整。为此,80 U的酶的混合物在100年透明质酸酶μL(20毫米钠磷酸盐缓冲剂和25μL EEHS或类黄酮(35μg / mL)溶解在25% ( / )DMSO孵化10分钟37°C。100年之后,μL的透明质酸(0.03%在300毫米磷酸钠缓冲区,pH值5.35)添加和孵化为45分钟37°C。未消化的透明质酸沉淀了1毫升的酸性白蛋白溶液(0.1%牛血清蛋白在24毫米醋酸钠和79毫米醋酸在pH值3.75)。后方,样品在室温下孵化了10分钟。吸光度的阅读了600海里。吸光度在缺乏酶为最大抑制被用作参考。儿茶素(35μg / mL)被用来作为参考。测试进行了一式三份。抑制活性的测试样本使用以下公式计算: 。

2.6.4。α-Amylase-Inhibiting活动

的α-amylase-inhibiting活动评估是被高et al。35]。蓝色的淀粉(Sigma-Aldrich;2.0毫克)作为底物在50 mM Tri-HCl缓冲区包含10毫米CaCl pH值为6.92在100°C,煮5分钟。然后,淀粉azure的解决方案是preincubated 10分钟37 c EEHS样本或类黄酮(20 - 100μg / mL)溶解在25% DMSO,和200年μL(猪胰腺a-amylase解决方案(Sigma-Aldrich, a - 6255;2.0 U /毫升;包含10毫米CaCl 50 mM Tri-HCl缓冲区2,pH值6.9)添加到每个试验。在37°C的反应进行了10分钟,停止了通过添加0.5毫升的50%醋酸。当时反应混合物在2000转离心5分钟在4°C。上层清液的吸光度在595纳米测量。阿卡波糖(20 - 100μg / mL)被用来作为参考。测试进行了一式三份。的α-amylase-inhibiting活动是使用以下公式计算: ,在那里 是活动的100%酶与酶(溶剂), 是活动的0%酶(溶剂没有酶), 的enzyme-inhibiting活动测试样本(样本与酶),然后呢 是空白(测试样本没有酶)。的集成电路50值计算。

2.6.5。α-Glucosidase-Inhibiting活动

的α-glucosidase-inhibiting活动评估根据Mayur et al。36),小的修改。反应混合物中含有50μL 0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.0),25岁μL(0.5毫米4-nitrophenylα-D-glucopyranoside 10μL EEHS或类黄酮(25 - 85μ25 g / mL),μL (α葡糖苷酶解决方案(0.2单位/毫升)。的混合然后在37°C的环境中30分钟,和反应是通过添加100年终止μL 0.2碳酸钠溶液。底物的酶水解是监控通过反应混合物中的p-nitrophenol释放的数量在410海里。单个空格准备校正背景吸收,被酶所取代0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)。在控制,植物提取物或类黄酮取而代之的是甲醇。阿卡波糖(25 - 85μg / mL)被用来作为一个积极的控制。的抑制百分比α葡糖苷酶是通过公式计算:%抑制=[1−(样品吸光度/控制吸光度)×100。IC50值比较;分析进行了一式三份。

2.6.6。Lipase-Inhibiting活动

猪胰脂肪酶(PPL)(类型II-inhibiting Sigma-Aldrich)活动评估使用分光光度法所描述的卢武铉和荣格37]。EEHS或类黄酮(最终浓度为2.5 -35μg / mL)是preincubated PPL(1毫克/毫升)1 h在磷酸钾缓冲(0.1毫米,pH值7.2,80年0.1%渐变)在30°C分析PPL活动。0.1μL p-nitrofenil Butirato (Sigma-Aldrich)然后添加作为衬底。孵化后5分钟30°C, p-nitrophenol释放的数量在反应中使用紫外可见分光光度计测量在405海里。消极的活动控制(DMSO)也被评估,没有一种抑制剂。所有的测试进行了一式三份。奥利司他(0.003 - -0.01μg / mL)被用来作为参考。PPL-inhibiting活动是使用以下公式计算: ,在那里 活动没有抑制剂, 消极的控制没有抑制剂, 是活动的抑制剂, 消极的控制是一个抑制剂。的集成电路50值计算。

2.7。体内研究
2.7.1。动物

所有与动物实验程序提交和批准的动物使用巴西利亚大学的伦理委员会(permission-UnBDOC号47926/2010),按照规范进行动物实验的国家委员会控制(慰问Nacional de Experimentacao动物(CONCEA))。120天的成年雄性Wistar鼠获得动物屋的生物和环境科学学院Grande Dourados联邦大学、南马托格罗索州州,巴西。动物被保存在聚乙烯盒子在22±2°C和控制光暗周期(12/12小时)。所有的动物都随意。

2.7.2。口服葡萄糖耐量试验Normoglycemic Wistar鼠

口服葡萄糖耐量试验(OGTT)进行禁食12小时以后在成年男性normoglycemic Wistar鼠120天。动物被口头挑战与葡萄糖过载填喂法(2克/公斤体重)。30分钟后,车辆控制二甲亚砜(6% DMSO)和EEHS(200和400毫克/公斤体重)进行治疗。鼠血糖测量(0)后30、60、120和180分钟交付葡萄糖过载根据阿拉冈et al。38)使用Accu-Chek活跃(罗氏)血糖仪和一次性带。

2.7.3。糖尿病感应

糖尿病是导致成人120天的雄性Wistar鼠一腹腔内注射四氧嘧啶一水(120毫克/公斤体重)无菌生理盐水溶解在0.9%,阿拉冈所描述的et al。38),做了一些调整。血糖测定96 h后诱导糖尿病使用便携式Accu-Chek (Abbott)血糖仪和一次性带。动物高血糖(血糖水平高于200 mg / dL)分离深造。

第2.7.4。在糖尿病Wistar鼠血糖评估

糖尿病的治疗和血糖评估雄性Wistar鼠进行根据阿拉冈et al。38),做了一些调整。糖尿病大鼠的血糖水平提交急性和慢性治疗(28天)测定在禁食时间为零,他们随后管理与车辆控制的剂量6% DMSO, EEHS(200毫克/公斤体重)和二甲双胍(120毫克/公斤体重)。测量大鼠的血糖水平在0,30、60、120和180分钟使用Accu-Chek活跃(罗氏)血糖仪和一次性带。

2.8。统计分析

数据表示为平均值±标准平均误差(SEM)分析评估团体之间的显著差异。单向方差分析被用于饥饿的总成分以及antihemolytic enzyme-inhibiting,抗诱变因素的活动。差异决定使用多重比较图基测试结果总成分的饥饿和antihemolytic活动。Dunnett多重比较测试是用来评估不同的酶抑制和antimutagenicity化验。的t以及使用的在活的有机体内实验评估群体之间的差异。所有的数据是使用软件获得GraphPad棱镜5。结果被认为是重要的时候 或 , , 或 。

3所示。结果

3.1。物理化学参数

物理化学参数,包括矿物(灰),蛋白质、总脂质、碳水化合物以及能源的价值内容h .叶叶子,概述在表1。

表1
的物理化学特性Hancornia叶叶样品。
3.2。亲脂性的抗氧化剂

叶绿素a和β胡萝卜素是主要的抗氧化剂,为1.33±0.03,0.55±0.01毫克/ 100克的样品,分别。相反,叶绿素b的浓度为0.42±0.02毫克/ 100克,和番茄红素的浓度为0.070±0.01毫克/ 100克。

3.3。饱和脂肪酸甲酯

总脂质提取后h .叶叶子,饥饿的资料分析了气相色谱法(图1(一))。的α亚麻酸(C18:3n3)是主要的脂肪酸中标识样本,其次是棕榈(0)和亚麻油酸(C18:2n6)酸。除了这三种脂肪酸,其他19个化合物被确定和量化(图1 (b))。样品有较高比例的多不饱和脂肪酸(欧米伽)(48.82%),其次是饱和脂肪酸(美国)(39.19%)和单不饱和脂肪酸(MUFAs)(11.86%)(图1 (c))。/美国和欧米伽n6 /n分别评估3比率分别为1.25和3.37。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
(一)色谱测定脂肪酸的Hancornia叶叶样品。(b)的化学成分,脂肪酸甲基酯(饥饿):辛酸(C8:0),癸酸(C10:0),月桂酸(C12:0) tridecanooic酸(C13:0),肉豆蔻酸(C14:0) myristoleic酸(C14:1)、十五烷(C15:0)、棕榈酸(0),9 -十六碳烯酸(C16:1),十七酸(C17:0) cis-10-heptadecanoic酸(C17:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1n9c + t),亚油酸(C18:2n6c),α亚麻酸(C18:3n3)、花生酸(C20:0) cis-11-eicosenoic酸(C20:1) cis-11, 14-eicosadienoic酸(C20:2),二十一烷酸(C21:0)、二十二烷酸(C22:0)二十三酸(C23:0)和神经酸(C24:1)。(c)总饱和脂肪酸组成(美国),单不饱和脂肪酸(MUFAs)和多不饱和脂肪酸(欧米伽)Hancornia叶叶样品。值表示为三个独立实验的均值±SEM进行复制。 与国家林业局组和PUFA组; 相比MUFA集团和PUFA和国家林业局组织;和 相比之下,PUFA组与MUFA组。
3.4。微生物质量和安全

的微生物质量和安全分析的结果h .叶表中列出的叶子2。

表2
微生物分析Hancornia叶叶样品。
3.5。Antihemolytic活动

图2显示的结果EEHS保护活动(59.59±1.42%),芦丁(29.67±2.11%),儿茶素(23.67±1.97%),和isoquercetin(20.97±1.38%)反对AAPH-induced溶血。


图2
Antihemolytic ethanolic提取物的活动Hancornia叶叶子(EEHS) (20μg / mL)和类黄酮芦丁(常规),儿茶素(Cat), isoquercetin (Isoq) (20μg / mL)对50 mM AAPH-induced溶血。值表示为均值±SEM实验一式三份。 当EEHS集团与芦丁相比,儿茶素,isoquercetin组。
3.6。抗诱变剂的活动

从研究结果的抗诱变剂的潜力EEHS,芦丁,儿茶素,isoquercetin概述在表3。在所有的EEHS浓度测试(5 - 15μg / mL),较高的抗诱变剂的活动中观察到鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100菌株接触不同的诱变剂(S9 +)没有(S9−)代谢活化。中类黄酮芦丁(0.1 - -0.25μg / mL)显示中度抗诱变因素的活动鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株无代谢活化。

表3
ethanolic提取物的抗诱变因素的活动Hancornia叶叶子(EEHS)芦丁(常规),儿茶素(Cat), isoquercetin (Isoq)鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100菌株。
3.7。Enzyme-Inhibiting活动
3.7.1。Cholinesterase-Inhibiting活动

表4表明EEHS AChE-inhibiting活动已经高于isoquercetin(2.0倍),芦丁(1.7倍),和儿茶素(1.5倍)和较低的活动比毒扁豆碱(参考疼痛抑制剂)。EEHS显示BChE-inhibiting活动高于isoquercetin(1.8倍),儿茶素(1.6倍),和芦丁(1.4倍)和较低的活动比毒扁豆碱(参考BChE抑制剂)(表4)。

表4
乙酰胆碱酯酶(疼痛),butyrylcholinesterase - (BChE -),酪氨酸酶、透明质酸酶、胰脂肪酶,α淀粉酶和α-glucosidase-inhibiting ethanolic提取物的活动Hancornia叶叶子(EEHS)芦丁(常规),儿茶素(Cat), isoquercetin (Isoq)。
3.7.2章。Tyrosinase-Inhibiting活动

EEHS显示4.3,3.8和3.7倍tyrosinase-inhibiting活动比儿茶素高,isoquercetin,分别和芦丁(表4)。所有化合物的tyrosinase-inhibiting活动低于参考抑制剂的曲酸(表4)。

3.7.3。Hyaluronidase-Inhibiting活动

hyaluronidase-inhibiting活动EEHS显示1.8倍高于芦丁和儿茶素活性高于isoquercetin(表2.6倍4)。然而,EEHS hyaluronidase-inhibiting活动和类黄酮是低于参考化合物,儿茶素(EGC)(表4)。

3.7.4。胰腺Lipase-Inhibiting活动

表4显示胰腺lipase-inhibiting活动EEHS已经高于isoquercetin(8.1倍),儿茶素(7.4倍),和芦丁(5.2倍)和较低的活动比奥利司他(引用胰脂肪酶抑制剂)。

3.7.5。α淀粉酶,α-Glucosidase-Inhibiting活动

表4表明EEHS更高α-amylase-inhibiting活动比芦丁(2.2倍),isoquercetin(2.0倍),儿茶素(1.4倍)和参考抑制剂阿卡波糖(1.9倍)。的评估α-amylase-inhibiting黄酮类化合物的活性与参考化合物阿卡波糖相比表明,儿茶素活性高于阿卡波糖(表4)。EEHS显示高α-glucosidase-inhibiting活动比芦丁(2.4倍),儿茶素(2.2倍),isoquercetin(1.7倍),和阿卡波糖(表(1.6倍)4)。

3.8。在活的有机体内研究
3.8.1。口服葡萄糖耐量试验Normoglycemic Wistar鼠

图3表明normoglycemic老鼠挑战与葡萄糖过载显示显著降低血糖水平当处理EEHS(200毫克/公斤)。


图3
口服葡萄糖耐量试验在normoglycemic Wistar鼠接受治疗的控制和ethanolic提取Hancornia叶叶子(EEHS) 200和400毫克/公斤。*评估:0,30、60、120和180分钟。值表示为均值±SEM, 。 和 当比较治疗组和对照组。
3.8.2。在糖尿病Wistar鼠血糖评估

在分析糖尿病大鼠血糖高于400 mg / dL,没有葡萄糖超载,没有降低血糖水平观察后急性(图4(一))和慢性(图4 (b))治疗EEHS(200毫克/公斤)。只有实验组二甲双胍(满足,120毫克/公斤)显示降低血糖水平(数字4(一)和4 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
在糖尿病血糖曲线没有葡萄糖过载Wistar鼠受到急性(a)和慢性(b)治疗与控制,EEHS(200毫克/公斤)和二甲双胍(满足,120毫克/公斤)。*测试:0,30、60、120和180分钟。值表示为均值±SEM, 。 和 当比较治疗组和对照组。

4所示。讨论

巴西有不同的生物群落生物多样性和高本地物种,通常用作药用植物。研究这些植物用于传统药物的药理特性,确保其科学记录和加强传统知识积累了几个世纪。在这些植物中,h .叶被描述为一个高度通用的物种。这种植物是传统上用于治疗各种疾病,具有很高的经济和生物技术药物开发的潜力,因为它的叶子和其他地方卖的茶(4,39]。

尽管证明治疗效果,增加天然产品的消费已经成为一个公共卫生问题,因为原材料的低质量的产品没有验证安全性和效率可能购买(3]。天然产品可能含有大量的真菌和细菌;这些微生物通常从土壤中,这是介绍的自然微生物群,甚至在收获的不恰当处理,干燥和存储这些产品(,2007)。从这个意义上说,一些研究已经进行的目的保证药用植物的质量和微生物安全40- - - - - -42]。尽管欧洲共同体立法没有芳香植物干燥微生物标准定义,世界卫生组织(世卫组织),欧洲香料协会(ESA)和芳香的法典卫生规范指定干植物需要接受的微生物污染水平和病原微生物,如沙门氏菌sp.和梭状芽胞杆菌sp。2,43,44]。因此,本研究旨在确保所使用的原料是高质量和安全消费的微生物质量和安全测试h .叶叶子,按照目前的标准产品由世界卫生组织设立的用于人类消费(2]。

在最初的质量和安全评估以及理化分析,包括量化的总脂质提取h .叶树叶,不同脂肪酸被确定。在脂肪酸,α亚麻酸(多不饱和omega - 3),被认为是一个重要的脂肪酸只能从饮食获得(45),是主要的脂肪酸中发现h .叶叶子,紧随其后的是棕榈(饱和)和亚麻酸(多不饱和ω- 6)。此外,/美国和欧米伽n6 /n3脂肪酸比例计算表明良好的营养品质,包括健康的好处(46]。α亚麻酸不能被合成了人类;然而,饮食α亚麻的前身是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,这是抗炎类花生酸(47,48]。

此外,天然抗氧化剂的量化,包括亲脂性的抗氧化剂以及总酚类和黄酮类化合物在自然产品,提供关键参数评估的质量和生物潜在草药产品(49]。在这项研究中,叶绿素a和b,亲脂性的抗氧化剂β胡萝卜素,番茄红素被识别和量化h .叶叶子。主要类胡萝卜素包括碳氢化合物β-胡萝卜素和番茄红素50]。这些营养物质的极大的兴趣源于他们的生物和生理功能51]。一些类胡萝卜素,除了维生素A(视黄醇)前体,具有抗氧化,提高免疫反应(52]。此外,桑托斯此前进行的研究等。4与EEHS]报道总酚类化合物的浓度高于那些描述h .叶水果提取物(53]。

酚类化合物是氢体直接清除自由基的能力,减少氧化损伤(4,54,55]。从药用植物中提取酚类和黄酮类化合物,包括h .叶,激活内源性抗氧化剂的能力描述系统和抑制脂质过氧化作用在人类红细胞(4,56,57]。因此,类黄酮芦丁、儿茶素和isoquercetin,先前被桑托斯et al。4EEHS],显示抗氧化活性在这项研究中,这证实了保护人类红细胞溶血产生的脂质过氧化作用。然而,结果显示可能的组件之间的协同效应的提取,因为EEHS antihemolytic活动表现出高于单独的类黄酮。过氧化氢自由基氧化脂质和蛋白质促进溶血的细胞膜(58]。在体外和在活的有机体内研究表明,天然提取物和类黄酮抗氧化活性,抑制脂质过氧化反应在大鼠的红细胞和心肌细胞受到氧化应激(4,59,60]。防止脂质过氧化作用推动的测试样品可能与直接有关过氧化氢自由基清除活性和酶的激活抗氧化机制,如谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(56,58]。

因此,内源性细胞内抗氧化途径自然保护人体免受频繁接触诱变剂。这些结构稳定高活性物种破坏脱氧核糖核酸(DNA) [61年]。然而,自然防御机制可能是不够的,因此突出的重要性,研究外源性抗氧化化合物与抗诱变剂的活动(62年]。

艾姆斯测试已经建议评估多种天然分子的抗诱变因素的影响,包括植物化合物。这种分析可以检测转移或错义突变(63年]。当EEHS显示抗诱变因素的活动鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100菌株受到直接诱变剂没有,一种替代剂,主要作用于鸟嘌呤(G)残留,诱导转换从guanine-cytosine (GC) adenine-thymine(在)64年),和SAZ诱发突变的生产DNA-interacting代谢物L-azidoalanine,诱导转换从GC在[65年]。此外,EEHS显示抗诱变剂的活动时美国沙门氏菌感染TA98和TA100菌株受到间接诱变剂AFB1,刺激自由基的释放的毒素,从而引起染色体畸变(66年]。类黄酮,芦丁显示适度的抗诱变剂的活动时美国沙门氏菌感染TA98菌株都没有。使用艾姆斯测试研究表明,类黄酮可能显示抗诱变剂的影响通过不同的机制,包括清除细菌突变剂,与诱变活性中间体和交互影响微粒体酶(67年]。然而,类黄酮可能也显示双重浓度影响,诱变或抗诱变剂的(68年]。因此,抗诱变剂的提取和芦丁的活动可能与抗氧化活性,因为其他研究报道,抗氧化化合物抗诱变剂的相关活动(69年,70年]。

类黄酮减少氧化应激的能力也降低相关风险与神经退行性疾病相关71年]。在这种背景下,药用植物和酚类衍生品已经承认他们对酶的抑制活动参与神经退行性疾病(70年- - - - - -72年]。老年痴呆症是一种退行性疾病和进步,是老年人痴呆中最常见的形式(73年]。这种疾病的特征是存在的β淀粉样斑块和神经纤维并发症和胆碱能神经元的变性或萎缩(74年,75年]。胆碱能神经元的损失导致胆碱能神经递质乙酰胆碱的减少可用性,导致认知障碍在阿尔茨海默病(76年]。然而,这种神经递质水平可以增加大脑中通过抑制胆碱酯酶的活性,酶分解乙酰胆碱(77年]。在这种背景下,疼痛和BChE抑制剂用于增加乙酰胆碱的突触水平,被认为是主要的疾病治疗方法(78年]。乙酰胆碱水平的增加提高了神经细胞之间的沟通,把它作为唯一的神经递质(79年]。其他在体外使用类黄酮芦丁和槲皮素的研究报道发现在疼痛和BChE-inhibiting的活动(72年,80年]。在活的有机体内酚和类黄酮衍生品,如芦丁和槲皮素,也显示疼痛,BChE-inhibiting活动和改善动物的认知能力,包括那些受神经毒性(81年,82年]。此外,分子耦合研究显示槲皮素之间的疏水相互作用和强烈的氢键和酶疼痛和BChE,从而提出该机制作为enzyme-inhibiting活动的基础(83年]。

酪氨酸酶的活性,另一个酶与神经退行性疾病相关,抑制了h .叶提取和类黄酮。酪氨酸酶是一种多酚氧化酶酶参与黑色素的合成(皮肤和头发)和neuromelanin [84年),它被认为是一个关键的目标寻找新的抗帕金森病药物(72年]。这种神经退行性疾病的结果缺乏多巴胺神经元的84年]。研究表明,酪氨酸酶在活性物种的形成过程中发挥作用,氧化多巴胺,触发生产更多的活性氧导致神经元死亡(85年,86年]。此外,脂质过氧化作用的增加帕金森症患者的大脑中已经报道(87年,88年]。

除了这些活动之外,酪氨酸酶也起着酶的作用在果蔬褐变和皮肤色素沉着过度89年]。因此,酪氨酸酶抑制剂主要用作化学药剂来减少食品褐变和人类皮肤色素沉着过度(90年,91年]。尽管杀菌作用主要是负责对一系列病变皮肤着色和保护皮肤,皮肤异常色素沉着过度会导致严重的审美问题[92年]。曲酸,化学产品通常用于皮肤美白,健康的不利影响,包括细胞毒性和诱变效应(93年]。因此,来自天然产物化合物已成为这些产品的替代品,包括类黄酮,突出这种酶的抑制剂。类黄酮是用来抑制黑素原生成皮肤疾病与皮肤色素沉着过度(94年]。评估的酪氨酸酶抑制EEHS和类黄酮在这项研究中观察到可能与直接与酪氨酸酶由于黄酮类化合物,包括导数槲皮素,与酶形成一个flavonoid-copper-enzyme复杂的交互,根据金等。90年]。

除了神经退行性疾病和皮肤色素沉着过度,炎症过程也参与其他疾病的起源(75年]。

在这种背景下,h .叶被用于传统医学治疗炎症性疾病(95年]。在体外和在活的有机体内研究植物和类黄酮的提取分离提取显示抗炎活动通过各种机制,包括酶的抑制一氧化氮合酶(间接宾语)和cyclooxygenase-2 (cox - 2)、促炎转录因子NF -κB,炎性细胞因子白介素6 (il - 6)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)[5,6,96年- - - - - -98年]。

许多商用消炎药都有害的副作用。因此,寻找新的治疗方法是非常重要的98年]。Hyaluronidase-inhibiting化合物可用作抗炎药(99年]。透明质酸酶的酶活性不仅促进趋化因子和细胞因子诱导,但也可能降低透明质酸(99年,One hundred.]。研究表明,高分子量的透明质酸具有抗炎活性,而它的低分子量降解产物是有效的促炎的分子(101年]。透明质酸是细胞外基质的主要组成部分,被认为是一个主要参与组织再生的分子过程。透明质酸的活性及其降解产物与炎症有关,细胞迁移,通过特定的受体调节血管生成(102年]。透明质酸降解造成的后果的一些酶的活性透明质酸酶是骨质流失,炎症和疼痛103年]。

另一个患病的相关炎症是肥胖104年]。肥胖的定义是体重超标(105年]。一些药物替代治疗肥胖相关抑制酶参与脂肪的消化和吸收106年]。膳食脂肪消化吸收是必要的,这样的过程通过脂质水解产生的脂肪酶活性,从而释放脂肪酸和甘油(107年]。胰脂肪酶的抑制,甘油三酸酯的主要酶消化,是一种策略来减少脂肪的吸收和控制体重,减少肥胖19]。在这种背景下,许多药用植物和酚类衍生品lipase-inhibiting活动(16- - - - - -19]。h .叶常用于治疗肥胖(108年),在这项研究中,EEHS显示胰腺lipase-inhibiting活动高于类黄酮和低活动奥利司他,一个强有力的商业这种酶的抑制剂。这些结果表明,EEHS和类黄酮进行本研究促进与脂肪酶酶的交互,因为据一项研究表明,黄酮类化合物,包括芦丁和槲皮素衍生物,与脂肪酶形成flavonoid-enzyme复杂,主要通过疏水性和亲水性债券,从而减少或抑制酶的活性109年]。

此外,肥胖病人有较高的患疾病的风险,包括2型糖尿病,疾病的最普遍形式(105年,110年]。2型糖尿病是一种复杂的代谢性疾病,其特征是造成高血糖增加胰岛素抵抗[111年,112年]。

降低2型糖尿病患者的餐后高血糖一直被认为是最常见的疾病控制治疗方法。此外,这种治疗可以减少患并发症的风险和并发症,包括氧化应激、肥胖和心血管疾病(113年]。这减少可能是通过抑制酶参与饮食葡萄糖释放,包括酶α淀粉酶和α葡糖苷酶(107年]。胰腺α淀粉酶分解淀粉分子(114年),和肠道α葡糖苷酶催化的最后一步消化淀粉和二糖为葡萄糖的吸收(115年]。因此,α淀粉酶和α葡糖苷酶抑制剂降低糖尿病患者的餐后血糖水平(116年]。

因此,EEHS,芸香苷、儿茶素和isoquercetin抑制酶α淀粉酶,EEHS enzyme-inhibiting活动和儿茶素是高于商业药物阿卡波糖。EEHS,芸香苷、儿茶素和isoquercetin还显示α-glucosidase-inhibiting活动,尽管只有EEHS-inducedα-glucosidase-inhibiting活动高于阿卡波糖。因此,这些结果表明提取和类黄酮的抗糖尿病的高潜力测试,因为他们有抑制活性高于商业药物卖给治疗糖尿病。此外,以往的研究与ethanolic叶提取物h .叶和类黄酮芦丁,主要的化合物存在于EEHS在这项研究中,测试报告α-glucosidase-inhibiting活动以及在体外和在活的有机体内控制血糖水平(11]。因此,EEHS-inducedα淀粉酶和α葡糖苷酶抑制是一个可能的机制来降低血糖水平的EEHS动物受葡萄糖过载因为糖尿病动物没有改善胰岛素敏感性的这些动物相比,与胰岛素敏化剂二甲双胍治疗。因此,在体外和在活的有机体内这项研究的结果证实EEHS控制餐后高血糖的作用。

综上所述,结果确保微生物的质量和安全h .叶叶子,类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸在树叶也确定了。此外,抗氧化、抗诱变剂的抗炎,anti-Alzheimer病,anti-Parkinson的疾病,各类典型,降糖药EEHS被确认的活动。

缩写

EEHS: Ethanolic提取的h .叶叶子
GC-FID: 气液色谱法和火焰离子化检测
AAPH: 2、2 -Azobis (2-amidinopropane)盐酸盐
HPLC-DAD-MS /女士: 高效液相色谱法与二极管矩阵detection-tandem质谱分析
饥饿: 脂肪酸甲基酯
PDA: 酵母蛋白胨葡萄糖琼脂
主成分分析: 平皿计数琼脂
ISA: 铁亚硫酸盐琼脂
SAZ: 叠氮化钠
4 nqo: 4-Nitroquinoline 1-oxide
AFB1: 黄曲霉毒素
疼痛: Acetylthiocholinesterase
BChE: Butyrylthiocholinesterase
PPL: 猪胰脂肪酶
OGTT: 口服葡萄糖耐量试验
DMSO溶液: 二甲亚砜
欧米: 多不饱和脂肪酸
美国: 饱和脂肪酸
MUFAs: 单不饱和脂肪酸
常规: 芦丁
猫: 儿茶素
Isoq: Isoquercetin
背景: 脱氧核糖核酸
GC: Guanine-cytosine
: Adenine-thymine
伊诺: 一氧化氮合酶
cox - 2: Cyclooxygenase-2
il - 6: 白介素- 6
肿瘤坏死因子-α: 肿瘤坏死因子α。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持由Fundacao de Apoio ao Desenvolvimento做教学,Ciencia e Tecnologia做Estado de南马托格罗索州(FUNDECT) Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq),大学联邦da Grande Dourados (UFGD)和刺激(24.073、葡萄牙)。