文摘
氧化应激和炎症过程是相通的。这项研究的目的是进行植物化学的分析和评估ethanolic的抗氧化和抗炎活动十大功劳aquifolium花(MF),绿色水果(MGF)和成熟的水果(MRF)提取。植物提取物化学成分被单位评估。用于DPPH测试在体外抗氧化活性。的在活的有机体内抗氧化和抗炎的潜在影响测试老鼠松节油原油带来炎症,通过测量血清一氧化氮(NOx)和tnf,总氧化状态(TOS)、总抗氧化反应(TAR),氧化应激指数(OSI) 3-nitrothyrosine(3元)、丙二醛(MDA)和总硫醇(SH)。提取是口头管理在三个稀释(100%,50%,和25%)七天前炎症。双氯芬酸的效果比较。高效液相色谱茶多酚和生物碱分析显示绿原酸是最丰富的化合物。所有的提取物有很好的在体外抗氧化活性,降低氮氧化物、服务条款和3元,增加SH, tnf是减少,沥青只有MF和MGF增加。MDA没有影响。我们的研究表明,m . aquifolium抗炎和抗氧化作用,支持使用的初级预防炎症过程。
1。介绍
抗氧化剂和退化性疾病之间的关系是一个话题,是现在许多研究人员的关注(1]。活性氧(ROS)造成的氧化过程在每一个生物体,作为有氧新陈代谢的一部分。他们是由超氧化物阴离子、过氧化氢和羟基自由基2]。在小剂量,他们是有用的和发挥生理作用,也参与信号流程(3]。抗氧化系统超载时,ROS将破坏蛋白质、DNA和脂质(4]。因此,至关重要的是识别外源性抗氧化剂的来源,可以减少ROS作用[5]。
植物代表保护剂的重要来源,因其多酚含量、维生素、纤维、植物甾醇、类胡萝卜素(6]。多酚抗氧化剂和prooxidant属性。抗氧化活性是由于自由基的清除作用[7),确保细胞内结构对氧化应激的保护,有利于细胞生存能力(8]。
作为prooxidants,茶多酚可能刺激细胞凋亡和抑制肿瘤生长8]。多酚有良好影响退化性疾病,如癌症、心血管疾病、糖尿病和骨质疏松症(9]。至于它们对心血管系统的影响,多酚降低血压,炎症,氧化标记,他们防止内皮功能障碍(10),他们是抗血栓形成的,他们作为血管舒张药11]。他们也抑制环氧合酶(COX)的促炎活动lipooxygenase (LOX)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)12]。内皮功能的保护者,多酚类物质在动脉粥样硬化的早期阶段过程中通过减少氧化低密度脂蛋白(12]。
属十大功劳第二大的吗小檗科家庭。这个属的植物被用于传统医学用于治疗牛皮癣、皮炎,真菌感染,肺结核,dizentheria,伤口13]。从所有十大功劳物种,十大功劳aquifolium在土耳其是最培养(14]。由于其在生物碱含量高,m . aquifolium具有抗氧化,抗炎,15,16),低血糖,王亚南,低血压的属性(17]。在心血管系统中,m . aquifolium生物碱诱导血管舒张通过阻断Ca2 +入口的细胞(18和作为alpha -肾上腺素能受体拮抗剂19]。
各种水果而闻名于抗炎和血管舒张性能(5]。水果从m . aquifolium4月份是淡黄色,开花,但更少的信息是已知的对他们的影响14]。然而,从一个果实十大功劳被用于治疗失眠、耳鸣,头晕20.]。
考虑所有这些以前的结果,目前的工作旨在执行植物化学的分析和调查ethanolic的抗氧化和抗炎活性m . aquifolium花和水果提取物。
2。材料和方法
2.1。植物材料
新鲜的十大功劳aquifolium纳特(Pursh)。鲜花和水果从a购买Borza植物园“Babes-Bolyai”任大学罗马尼亚在2015年4月到6月之间和提取的真菌学实验室“Babes-Bolyai”大学,任,罗马尼亚,用70%的乙醇改性施贵宝制药repercolation方法(默克,布加勒斯特,罗马尼亚),生产以下的提取m . aquifolium:绿色水果提取1:1 (g:毫升)(MGF),成熟的水果提取1:1 (g:毫升)(MRF),和花中提取1:1 (g:毫升)(MF) [21]。植物分类学的识别和验证,凭证标本(665978号)存入”的标本。Borza Babes-Bolyai“植物园,任大学罗马尼亚。
2.2。植物化学的分析
HPLC-DAD方法被用来分离和定量测定茶多酚和生物碱。在第一色谱方法,分析进行一个安捷伦1200液相色谱系统(德国Waldbronn)配备在线真空脱气装置,四元泵、温控样品盘,自动注射器,列恒温器室,和爸爸探测器。色谱分离是运行在一个Nucleosil 100 C18列(240毫米×4.6毫米,5μ米颗粒大小)从Macherey-Nagel (Duren,德国)。注射量是5μL (0.2μ过滤提取),列温度设定在25°C,和流量为1.2毫升/分钟。一些初步测试是用于优化方法通过改变实验条件。梯度洗脱的最佳方法是使用溶剂,醋酸铵pH值5 10毫米,乙腈溶剂B。梯度是如下:0-15分钟从8到30% B, B 15 - 25分钟权力平等主义的30%,从30%到85% B 25 - 35分钟,35-38最小值从85%到95% B, 38-39分钟权力平等主义的95%和39 - 39.1分钟回到8% B,它一直到40分钟。作为标准,有绿原酸,p香豆酸、阿魏酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素、小檗胺,jatrorrhizine,非洲防己碱和小檗碱,分析级纯度不同商用来源(Sigma-Aldrich,德国)。每个化合物的校准曲线构造在11日,22日,44岁,88年,175年和340年μg / mL使用峰的面积由安捷伦集成使用软件。量化的极限(定量限)和检测极限(LOD)由公式确定定量限=(10×标准差的拦截)/校准曲线斜率和LOD =(3.3×标准差的拦截)/校准曲线斜率,分别。化合物的紫外可见检测已经完成使用DAD检测器测量整个频谱在210 - 700海里地区每1 s轨道,和色谱监测在220,280,340,425海里。化合物的鉴定是受雇于色谱保留时间(0.3年代公差)和光谱相似性(高于99.9%被认为是积极的),是通过内置的软件。色谱出口和图是在Excel中。
2.3。在体外抗氧化效果
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)自由基清除实验用于研究提取物的抗氧化能力的评价。简而言之,每个稀释抽取3毫升,1毫升DPPH和0.1毫米甲醇的解决方案是补充道。空格包含取代提取量为丙酮/水。30分钟后在黑暗中,在室温下,吸光度测量混合物在517海里一片空白。每个提取物的自由基清除活性的百分比计算使用以下公式:
自由基清除活性的百分比(AA %) = ((OD控制−OD样本)/ OD控制)×100。AA %使用校准曲线转化为Trolox等价物Trolox标准的解决方案(0.5 - 5μg / mL)。清除DPPH自由基的50%所需的浓度(IC50)计算22]。
2.4。实验设计
在目前的研究中,12组( )的男性白化Wistar鼠身体重量200至250克。他们从动物设施的购买”Iuliu Hațieganu”大学医学和药店。常见的聚丙烯老鼠被关在笼子里受控条件下(12 h光/暗周期,平均温度为21 - 22°C),提供免费访问标准颗粒饮食(Cantacuzino研究所,布加勒斯特,罗马尼亚)和水随意。三ethanolic提取物m . aquifolium进行了测试:成熟水果(MRF),绿色(MGF),水果和鲜花(MF)。七天,提到提取被填喂法的口服药物(1毫升/动物)在三种不同的稀释,分别为:100%,50%,25%。自来水(1毫升/动物)被填喂法管理七天的动物从负对照组(控制)和积极的炎症组(INFLAM)。抗炎对照组被七天填喂法与双氯芬酸治疗(10毫克/公斤合著)(DICLO) [23]。炎症诱导了松节油(6毫升/公斤合著)肌内管理,动物处理提取,以及INFLAM和DICLO团体(24]。控制动物,0.9%生理盐水注射肌肉(i.m.)。炎症诱导后的一天,60毫克/公斤b.w.氯胺酮和15毫克/公斤b.w.甲苯噻嗪用于麻醉大鼠(25),血液通过retroorbital穿刺被撤回,血清储存在−80°C到使用。实验进行了一式三份。所有的动物都只使用了一次,他们被颈椎脱位后立即测定。
2.5。抗炎效果评价
评估ethanolic植物提取物的抗炎作用,一氧化氮(NO)和tnf测量。
没有合成,格里斯反应是用作间接法衡量总亚硝酸盐和硝酸盐(NOx)如前所述26]。血清氮氧化物被表示为亚硝酸盐的浓度μmol / L (27]。
使用大鼠血清tnf测定酶联免疫试剂盒(MBS175904),应用定量夹心酶免疫测定技术。
2.6。抗氧化的效果评价
总氧化状态(TOS)的使用比色测定血清测定26,28]。表达的化验结果μ摩尔过氧化氢equiv. / L。
总抗氧化反应(TAR)测定血清中使用比色测定(26,29日]。结果表示为μ摩尔Trolox equiv. / L。
氧化应激指标(OSI)的比值TOS的焦油和氧化应激水平的指标(26,30.]:OSI(任意单位)= TOS (μ摩尔过氧化氢equiv. / L) /焦油(μ摩尔Trolox equiv. / L)。
过氧亚硝基形成评估间接通过测量血清3-nitrotyrosine使用老鼠(3元)酶联免疫试剂盒(MBS732683),应用定量夹心酶免疫测定技术。
使用硫代巴比土酸丙二醛(MDA)进行评估,如前所述[26,31日]。血清MDA浓度表示为nmol /毫升的血清。
总硫醇(SH)测量使用Ellman试剂(26,32]。血清SH浓度被表示为更易与谷胱甘肽/毫升。
所有的光谱进行了测量使用Jasco v - 530紫外可见分光光度计(Jasco国际有限公司、东京、日本)。
2.7。统计分析
数据表示为平均数±标准差、平均至少三个独立正态分布数据的实验。否则,中位数,第一象限(Q1)和第三四分位数(第三季度)报告。组间的比较,研究参数,分析了采用单向方差分析(方差分析)测试和Bonferroni-Holm事后测试。 被认为是具有统计学意义。数据之间的相关性计算使用皮尔逊相关系数()。所有分析都使用这个程序执行“社会科学统计软件包(SPSS)版本16”(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果
3.1。植物化学的分析
在目前的研究中,我们测量了六个多酚(绿原酸,p香豆酸、阿魏酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素)和四种生物碱(小檗胺,jatrorrhizine、非洲防己碱和小檗碱)(表1,图1)。我们识别和量化的绿原酸、阿魏酸和p香豆酸hydroxycinnamic酸衍生物(表1)。绿原酸被发现在MF(2013±2中浓度最高μg / mL),其次是MGF (1763±7μg / mL)和磁流变液(944±22μg / mL)。我们可以量化p香豆酸MF (7.2±0.1μg / mL)和磁流变液(4.5±2.0μg / mL)。MF是富裕的p香豆酸(10.0±0.3μ磁流变液(7.8±0.0 g / mL)比μg / mL)和MGF (5.6±0.2μg / mL)。在所有ethanolic提取物,我们确定了两类黄酮苷,即芦丁和异槲皮苷。芦丁在MF(73±1.6更丰富μg / mL)相比,磁流变液(26.1±0.0μg / mL)和MGF (12.9±0.0μg / mL)。异槲皮苷在MGF较高(37.3±0.2μg / mL) MF (29.7±0.7μg / mL)和磁流变液(32.4±0.3μg / mL)。MGF MF,磁流变液,检测生物碱浓度下LOD。
(一)
(b)
(c)
3.2。在体外抗氧化活性
ethanolic提取的m . aquifolium有一个很好的DPPH自由基清除活性(表吗2)。Trolox IC50是11.2μ克/毫升。考虑到一个抗氧化活性的IC50 50到100之间μg / mL是好的,一个在100年和200年之间μg / mL弱,MF IC50 (60.82μ50 g / mL)和MGF IC (81.6μg / mL)有良好的抗氧化活性和MRF IC50 (135.74μg / mL)有一个弱的抗氧化活性。
3.3。在活的有机体内抗炎和抗氧化效果
tnf增加炎症组( )。tnf是只减少了MGF50和MF25 ( ),没有发现显著的影响在剩下的测试提取( )(表3)。
氮氧化物是炎症组显著增加( )和一个重要的减少被发现在双氯芬酸的集团管理( )。炎症组相比,磁流变液提取物显著降低氮氧化物( ),MRF100是最有效的。磁流变液效果与双氯芬酸( )。没有明显抑制活动在所有MF稀释(氮氧化物 )。从MGF样本,只有MGF50抑制氮氧化物(一个小 )(表3)。
服务条款分析表明,炎症引起的一个重要的增加( )和双氯芬酸造成显著减少( )。所有MGF提取物降低TOS ( ),但是不如双氯芬酸( )。磁流变液提取没有显著影响TOS ( )。减少了曼氏金融服务条款,但只有MF100有显著的抑制作用( )。
焦油是减少炎症组( ),它略增加管理(双氯芬酸时 )。MGF增加焦油,MGF25更好的刺激器( )。MGF效果一样好,双氯芬酸( )。MF100 MF50增加焦油( ),但是这种效应小于双氯芬酸( )。磁流变液提取物对焦油(没有显著影响 )(表4)。
OSI是增加炎症组( )和管理(双氯芬酸时下降 )。只有MF100提取物降低OSI ( ),但是效果是小于双氯芬酸( )。MGF提取OSI的良好抑制剂( ),但是效果是小于双氯芬酸( )。磁流变液提取对OSI(没有显著的影响 )(表4)。
3元增加炎症组( )和双氯芬酸后显著降低( )。MGF也好的抑制剂3元,MGF100更有效( 比MGF50) ( )和MGF25 ( )。从磁流变液,只有MRF25减少3元( )。MF提取物显著降低3元( )(表4)。MDA产量显著增加炎症组( ),双氯芬酸治疗引起的一个重要减少MDA ( )。只有MRF100 ( )和MRF50 ( )降低MDA。MF和MGF没有显著影响生产的MDA ( )(表4)。
炎症引起的减少SH ( )和双氯芬酸引起的一个重要的增加( )。SH增加了m . aquifolium提取( ),效果优于双氯芬酸(表的影响4)。
4所示。讨论
在目前的研究中,ethanolic的植物化学的分析m . aquifolium花,绿色水果,成熟的水果提取物,是第一次执行。抗氧化活性和抗炎作用。
从三个hydroxycinnamic酸衍生物在ethanolic测量m . aquifolium提取,主要成分绿原酸。曼氏金融有绿原酸含量高于MGF和磁流变液。这是一个重要的结果,因为绿原酸能改善心血管和相关疾病的风险,减少游离脂肪酸和甘油三酯的水平(33]。由于其抗氧化性能,绿原酸在心血管疾病也有保护作用,增加生产(34]。在高血压、血管舒张效应,减少活性氧的生产(35]。绿原酸还能抑制血小板聚集,降低血液粘度(36]。
阿魏酸被发现在许多较小的浓度。在磁流变液在MF高于MGF。阿魏酸具有抗氧化作用[37,38)通过清除ROS和激活DNA修复(39]。它干扰胰岛素,生长激素释放多肽和瘦素,防止体重增加和腹腔脂肪的积累40]。阿魏酸还具有抗炎、抗癌和心血管效应(41]。由于其抗氧化性能,这有利于在癫痫(42)和其他慢性神经系统疾病(43]。它也是抗抑郁药(44),和改善记忆45]。
的p香豆酸被发现只有在磁流变液和MF。它是一种酚酸具有抗氧化(46),抗炎,护心47),王亚南,nefroprotective属性(48]。它减少了脂蛋白过氧化过程,减少自由基(46,49]。的p香豆酸具有抗癌活性,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞48]。
从三个测量类黄酮苷、芦丁和异槲皮苷被发现在MF, MGF, MRF。槲皮素是LOD。
芦丁是类黄酮具有抗氧化,抗炎,抗糖尿病的,各类典型属性(50,51]。由于其抗氧化能力,芦丁有心血管效应,减少LDH水平,ROS和细胞凋亡52,53]。芦丁可防止内皮损伤和减少2型糖尿病慢性并发症的发生(42,54]。MF的更高层次的芦丁浓度与一个好的DPPH清除活动。异槲皮苷是糖化类黄酮(55)有很强的抗氧化活性由于其清除自由基的能力(56)和抑制精氨酸酶,有利于生产57]。这些酚类化合物抗癌(58和凋亡的影响59]。
异喹啉生物碱是属的主要生物碱类的子类十大功劳(26]。之前确定生物碱属于三个主要类:protoberberines aporphines, bisbenzylisoquinolines。小檗碱是分布最广泛的生物碱十大功劳物种(60),但其他protoberberines,包括非洲防己碱,jatrorrhizine,小檗胺,columbamine,黄连碱也发现在这些物种20.]。的分析m . aquifolium提取了小檗碱的存在,非洲防己碱,jatrorrhizine和小檗胺,但由于这些生物碱的微量LOD下他们。
植物化学的分析建议的抗炎和抗氧化作用m . aquifolium水果和花提取物。
的在体外抗氧化活性与DPPH评估测试。MF和MGF被证明有很好的抗氧化效果,但MRF刚刚疲软的抗氧化活性。MF、DPPH与绿原酸高,对MGF feluric酸、芦丁含量和绿原酸和异槲皮苷含量高。
此外,目前的研究评估了在活的有机体内抗炎和抗氧化作用在实验老鼠松节油所致急性炎症,炎症刺激nonantigenic [61年激活炎性细胞因子和释放。高血清肿瘤坏死因子α和氮氧化物阳性标记的炎症反应。只有MF和MGF被证明具有重要的抗炎作用,减少肿瘤坏死因子α。
没有是最小的分子质量的产品在哺乳动物细胞分泌。它具有很高的化学活性和寿命很短和特异性62年]。没有号的是由3个亚型,分别诱导NOS(间接宾语),神经元NOS (nNOS)和内皮NOS(以挪士)63年]。nNOS和以挪士表示结构上和生产少量的没有。伊诺表达在免疫和炎症刺激,就像一个保护器代理(64年]。低水平的没有诱导正常的生理信号,导致抗氧化反应。在中间浓度,没有刺激抗炎和免疫抑制反应,凋亡,progrowth和血管生成的影响。没有高水平抗增殖效果和诱导细胞周期延迟。此外,如果长时间没有增加,可能会诱发细胞凋亡(65年]。当伊诺是大量合成,还与超氧化物阴离子反应快,不会形成过氧亚硝基(ONOO−), nonradical活性物种负责大部分没有病态的效果(66年- - - - - -68年]。先前的研究表明,植物发挥重要的抗炎作用,因为他们没有抑制合成24]。在目前的研究中,只有MRF100证明没有重要的抗炎作用,减少合成比得上,双氯芬酸引起的。治疗MGF弱的抑制作用,对NOx和MF没有重要的影响。因为对NOx并不与磁流变液的影响在体外DPPH测试,它可能是推测抗氧化活性不显著相关。在一些人类疾病,抗氧化治疗失败被称为抗氧化剂悖论(69年]。由于生产过剩的活性氧可以诱发炎症反应,炎症介质可以诱导氧化应激,这是普遍接受的氧化和炎症是相互联系的过程(70年]。抗氧化治疗失败的最新解释来自于发现抗氧化剂抑制氧化应激和炎症相关的不同时(71年]。
氧化应激是破坏性的,它代表了dysbalance抗氧化剂和氧化剂之间的最后一个(72年,73年]。最重要的氧化剂活性氧(ROS),包括超氧化物阴离子、过氧化氢和羟基自由基2]。在小到中等浓度,ROS生理角色(3),作为信号分子,参与细胞生长,细胞间粘附,细胞分化,细胞凋亡73年,74年]。在高浓度,ROS高活性分子,破坏蛋白质,脂类和DNA (2,3,75年),有利于动脉粥样硬化、癌症和老化(76年]。稳定的测量标记在循环氧化应激(77年- - - - - -79年]是一种有用的方式欣赏植物提取的影响。氧化应激生物标志物可能列为与活性氧分子所修改的交互(如DNA、脂质、蛋白质和碳水化合物)和分子的抗氧化系统的变化增加了氧化还原反应压力(77年]。总氧化状态(TOS)评估,开发多样化的方法(28]。在我们的研究中,血清TOS炎症组高。MF和MGF降低血清TOS超过MRF。这些结果与DPPH呈正相关测试。
抗氧化机制有清除自由基的能力,螯合金属,与其他抗氧化剂以协同的方式采取行动。有两组的总抗氧化能力的测定方法:基于单电子转移监测spectrophotometrically颜色变化由于减少自由基,这些基于氢原子转移以过氧化氢自由基的消除80年]。等离子体的抗氧化能力是由蛋白质的巯基共同和尿酸81年]。血清焦油(82年炎症组)是较低的,只有与MF和MGF提取物治疗增加了焦油。在这些提取物,我们发现高水平的绿原酸、芸香苷、异槲皮苷,已知化合物的抗氧化活性。
OSI评估全球氧化剂和抗氧化的平衡在生物体83年]。减少了MGF和MF治疗,这是积极相关服务条款和消极焦油。
3元是蛋白质酪氨酸硝化的产品由过氧亚硝基阴离子和二氧化氮。因此,它是一个很好的氧化细胞损伤和炎症的标志,以及没有生产(84年]。增加氧化应激增加活性氧和3元了。水平的提高3元与动脉粥样硬化相关(85年),观察患者的冠状动脉功能障碍,以及去除后的心血管风险因素和C反应蛋白(正常化77年]。所有的测试m . aquifolium提取了3元,但MF和MGF比MRF更有效。3元的抑制作用减少与服务条款相关的积极和消极的焦油高程。这些结果可以解释为更好的MF和MGF在体外DPPH测试。
从花生四烯酸丙二醛(MDA)的结果,多不饱和脂肪酸,它是一个次要的脂质过氧化作用[86年]。醛有毒,因为它们与DNA和蛋白质相互作用有利于突变,癌症的风险因素,动脉粥样硬化等心血管疾病(87年]。MDA和动脉粥样硬化之间的联系是其反应与脂蛋白和动脉泡沫细胞的形成88年,89年]。MDA的胶原蛋白有很高的反应活性,这将增加心脏和血管硬度(87年]。高水平的MDA与心肌梗死(相关也90年)、心血管血液透析并发症,糖尿病,子痫前期(87年)、充血性心力衰竭和与疾病的严重程度91年]。只有用磁流变液治疗降低MDA,焦油呈负相关。
蛋白质硫醇组织总抗氧化能力的重要因素。它们含有巯基可以变换成二硫键氧化时的氧气分子。这个反应是可逆的,所以二硫键可以把回硫醇(92年]。化学多功能性使他们参加不同的过程像信号一样,抗氧化防御,和结构稳定93年]。研究表明,白蛋白,最thiol-abundant蛋白质,是隐含在降低血压和心血管疾病的风险94年]。所有的测试m . aquifoliumethanolic提取增加血清SH,证明这些提取物可能提高抗氧化防御。
5。结论
考虑到研究结果,我们得出的结论是,m . aquifolium花,绿色水果,成熟的水果乙醇提取物有很好的在体外和在活的有机体内抗氧化活动,和良好的抗炎作用。效率随植物器官植物化学的成分。m . aquifolium花,绿色水果,成熟的水果提取物可能为治疗干预措施需要同时考虑抗氧化和抗炎作用。
数据可用性
这个手稿的数据集将不会被公开,直到一个相关的博士论文出版。请求访问这些数据集应该指向Andra-Diana Andreicut(电子邮件保护)。
伦理批准
这项协议是动物伦理委员会批准的机构(IAEC)“Iuliu Hațieganu”大学医学和制药、任、罗马尼亚(18/13.12.2016数量)。
的利益冲突
作者都没有任何的利益冲突,可能会影响性能的工作或数据的解释。
作者的贡献
Andra-Diana Andreicut Alexandru Irimie,艾琳娜Elena Parvu Marcel Parvu导致了研究概念和设计,和解释数据。奥古斯汀Cătălin年检负责植物化学的分析。Andra-Diana Andreicut国王Cecan负责试验研究。阿德里亚娜Florinela Cătoi负责数据采集和统计分析。伊娃费舍尔Fodor和瓦西Feldrihan生物化学和ELISA测试执行。所有作者都进行审核和批准最终提交的版本。
确认
研究经费支持的研究在一定程度上从“Iuliu Hațieganu”大学医学和制药、任、罗马尼亚(PCD 7690/19/15.04.2016;PCD 2017 1300/12/13.01.2017)。