文摘

背景。几个饮食植物化学物质可能调节氧化剂和抗氧化剂之间的平衡的物种。本研究的目的是评估的影响Lippia citriodora,萝卜,茄属植物lycopersicum血液参数、氧化/抗氧化状态,在兔子的心脏和肝脏SIRT1的活动。方法。二十只兔子被分成4组,每组5个动物。对照组(CN)收到一个提要,没有任何添加剂。一个干预组收到补充包含verbascoside (VB),另一个地方萝卜提取(RAP),最后番茄红素(LYC)。Oxidant-antioxidant参数和SIRT1活动测定血浆和心脏和肝脏,分别。结果。VB的治疗,说唱,LYC导致显著改善血脂和血糖对CN。VB是最有效的,但这三种植物提取物诱导显著减少氧化剂参数以及提高组织抗氧化活性和维生素a和E水平。SIRT1活动显著增加在VB和LYC CN相比,但增加的水平在VB组最高。多变量分析表明,VB的好处,特别是antiglycaemic和抗氧化作用,可能是由增加SIRT1的活动。

1。介绍

老龄化是一个涉及所有生物现象普遍,它的特点是逐步下降的生理功能,主要是心血管和代谢,从而导致死亡。在过去的几十年,老龄化的患病率逐渐上升,这“老化潮”导致增强调查所涉及的机制老化的起源和发展1]。一个全球共识认为衰老是一个多因子的过程由基因决定的,epigenetically受环境的影响。然而,许多理论提出了衰老的,其中大部分是考虑到活性氧(ROS)和氧化剂/抗氧化平衡至关重要的主角在老化的起源和发展2]。几项研究已经表明,增加活性氧诱导细胞损伤和线粒体功能障碍影响衰老过程。基于这些结果,有趣的模型集中在抗氧化补充剂作为抗衰老的战略开发(3- - - - - -5]。

克利斯托烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖蛋白去乙酰酶抑制剂,显示许多途径调解新陈代谢,心血管疾病,和长寿的哺乳动物生物(6]。在一个广泛的实验模型,克利斯托证明对氧化损伤(扮演非常重要的角色7]。例如,一些研究表明,sirtuins蛋白脱去乙酰基的抗氧化酶锰超氧化物歧化酶(SOD2)在线粒体基质中,导致增加活性氧的清除(8]。其他有趣的研究描述了几种抗氧化基因的表达如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗氧化蛋白3和5,硫氧还蛋白2,硫氧还蛋白还原酶2是由sirtuin同种型1 (SIRT1)通过脱乙酰作用的转录因子FoxO3a和转录辅激活过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂1α(PGC-1α)途径9,10]。新兴数据sirtuin活化剂的有利影响衰老和衰老相关疾病都集中在sirtuins蛋白作为一种新的潜在目标(11,12]。事实上,SIRT1活化剂是深入调查的能力治疗代谢紊乱、炎症和内皮功能障碍,可能暗示在临床治疗管理13,14]。最近,膳食植物酚类提取物的使用成为一个有吸引力的替代疗法。事实上,这些化合物的使用主要是公认的一部分dyslipidaemia治疗和血管壁的健康(15),以及神经保护的16]。最有趣的植物提取番茄红素可以治疗的应用程序组件(茄属植物lycopersicuml .)、辣根(萝卜l .)和verbascoside (Lippia citriodora)[17]。之前它已经被证明与番茄红素膳食补充,辣根,verbascoside有积极影响等离子体氧化状态动物模型的成年兔子。此外,坎波和他的同事们(18,19)报道,verbascoside管理学科与心血管危险因素降低血小板聚集值。虽然生化概要的调制和氧化状态似乎与sirtuin蛋白活性和酚类提取物有一些有利影响,令人惊讶的是,没有数据报告对酚醛sirtuin活动组件的作用。在目前的研究中,我们旨在评估的饮食影响植物提取物,Lippia citriodora(verbascoside),辣根(萝卜L),和番茄红素(茄属植物lycopersicum L),血液参数、等离子体氧化/抗氧化状态,SIRT1在兔子的心脏和肝脏组织活动。

2。方法

2.1。动物和实验设计

所有动物育种程序和管理进行了符合欧盟指令2010/63 /欧盟有关动物保护用于科学目的。莫利塞大学的伦理和科学委员会批准了完整的实验设计。实验进行20日断奶男兔子(新西兰白和加州)和持续了80天。动物被饲养在笼子里每笼(2)配备喂食器和自动浇水。温度和相对湿度的养兔场记录不断使用数字温度仪位于笼子的高度。养兔场是配备了一个环境小气候控制系统为了保持18±4°C的温度和相对湿度在整个实验周期70±5%。

5动物的兔子被随机分为四组,年龄相匹配(38±2天)和体重(1.49±0.07公斤)。对照组(CN)收到了育肥饲料没有任何天然补充剂,相反其他实验群体。一个干预组收到的补充Lippia citriodora提取物,含有verbascoside 5毫克/公斤饲料(VB组),另一组接受350毫克的根中提取的萝卜/公斤饲料(说唱组),最后一个收到5毫克番茄红素,从番茄中提取水果/公斤饲料(LYC组)。饲料管理随意,是由Agrizoo s.n.c。(米兰达,Isernia,意大利)。饲料添加剂的基础上Lippia citriodora(0.5%的verbascoside为主要组件),辣根(萝卜干燥的根中提取酶复杂Inuzyme®),和番茄红素(2%的茄属植物lycopersicum提取水果)是由Sintal Zootecnica(伊索拉Vicentina,维琴察,意大利),意大利Erba维塔公司(Montegrimano Terme,佩鲁贾,意大利),和Erbamea srl(圣Giustino,佩鲁贾,意大利),分别。

2.2。采样和实验室分析的血液

个别样本取自耳marginalis静脉使用真空采血管方法(Venoject,作秀的成分欧洲喷嘴速度、比利时鲁汶)使用管与肝素锂等离子体生产。血液采样进行初(断奶年龄0 d)和半(40 d)和实验的最后(80 d)。血液离心20分钟在3000 rpm,和下面的参数测定等离子体:葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、血清谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(血清),血清谷氨酸丙酮转氨酶(血糖),胆红素,creatinin,使用半自动临床化学分析仪Arco模型(Biotechnical仪器,公司。、意大利)。活性氧代谢产物(rom) spectrophotometrically Diacron提出的与比色法确定波长505 nm使用特定的商业工具(20.]。卡尔单位表达的结果(1卡尔对应0.024更易与H / l₂O₂)。

硫代巴比土酸的测定活性物质(TBARS) spectrophotometrically执行根据Esterbauer和Zollern [21)使用标准曲线与1,1,3,3-tetramethoxypropane(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。结果表示为μ摩尔的丙二醛(MDA) / l的等离子体。维生素A和E与氯仿从血浆中提取样本,根据赵et al。22]。维生素含量检测通过高效液相色谱法(Kontron仪器、意大利),包括一个自动autosampler (HPLC autosampler 360)的循环20μl,泵系统(高效液相色谱泵422),使用C18一列(5μ米、250×4.60毫米)(美国Phenomenex托兰斯,CA)。的混合物的流动相由乙腈和甲醇(85:15v/v)的流值1毫升/分钟。维生素A和E被确定通过比较样品的保留时间和保留时间(> 97%)购买纯标准Sigma-Aldrich(圣路易斯,美国)。量化使用Gyminix执行系统(版本1.8.1)通过比较面积的峰值与参考标准曲线。

2.3。组织处理和制备匀浆

在研究结束的时期,所有的兔子都牺牲了,他们的心和肝组织被立即删除,免费清洗血液。左心室分离,在液态氮冷冻,储存在−80°C到处理。组织中均质裂解缓冲包含10毫米Tris-HCl (pH值7.4);NP-40 0.5%;250毫米蔗糖;0.1毫米EGTA;10毫米氯化钠;15毫米MgCl2;PMSF约1毫米;1μ克/毫升每个抑肽酶、亮抑酶肽和抑肽素;1毫米Na3VO4;氟化钠和1毫米。

1 h,匀浆后获得了在14000转离心10分钟在4°C。蛋白质浓度测定使用Bio-Rad化验(意大利米兰)23]。

2.4。总抗氧化活性(TAC)

心脏和肝脏的TAC浮在表面的测量使用内源性抗氧化剂清除的能力2、2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)(abt)激进的阳离子脱色试验,根据再保险等的方法。24]。abt激进与过硫酸钾所产生的化学反应。为此,25毫升的abt(7毫米)与440年飙升μl的过硫酸钾(140毫米)和允许站在黑暗中在室温下12 - 16 h(激进的形成所需的时间)。Trolox作为标准,样品的总抗氧化能力被定义为的浓度Trolox等效活动表示为μ摩尔/ g组织重量。每个实验进行了一式三份。

2.5。分离和提取的核SIRT1脱乙酰酶试验

整除的心脏和肝脏组织匀浆(蛋白酶抑制剂)旋转通过4毫升的30%蔗糖,10毫米Tris-HCl (pH值7.5),10毫米氯化钠,和1300×3毫米MgCl2 g在4°C为10分钟;冷10毫米的颗粒被Tris-HCl氯化钠(pH值7.5)和10毫米。核悬浮在50 - 100μl含有50 mM的提取缓冲消息灵通的KOH (pH值7.5),420毫米氯化钠,0.5毫米EDTA Na₂、0.1毫米EGTA和10%的甘油,用近30年代,站在冰30分钟。

在13000转离心后10分钟,上层清液的整除(原油核提取)是用来确定使用Bio-Rad测定蛋白质浓度(23]。

2.6。SIRT1脱乙酰酶表达和活动

SIRT1蛋白表达测量使用人类SIRT1 (sirtuin蛋白1)酶联免疫试剂盒(Elabscience®生物技术公司,美国)。简单、连续稀释标准或样本添加到微ELISA板井,预镀与特定于人类SIRT1的抗体。这时,一个生物素化的检测抗体特定人类SIRT1和avidin-horseradish过氧化物酶(合)共轭添加到每个微型板块和孵化。经过几次清洗步骤,底物的解决方案是添加到每个。最后,es反应被终止的停止解决方案产生颜色反应,测量的波长spectrophotometrically 450±2海里。光密度值(OD)是人类SIRT1的浓度成正比,和人类SIRT1的浓度样本计算通过比较样品的OD标准曲线。

原油的SIRT1脱乙酰酶活动评估核从心脏和肝脏组织中提取所有的兔子。我们测量了SIRT1使用脱乙酰酶荧光测定工具包(Sir2化验设备,CycLex,艾娜,长野,日本)。最终的反应混合物(100μl)包含50 mM Tris-HCl (pH值8.8),MgCl2约4毫米,0.5毫米德勤,0.25 mA /毫升lysyl肽链内切酶,1μM Trichostatin, 200年μM河畔,5μl核样本。

的荧光强度在440 nm (exc。340海里)测量每30年代60分钟后立即添加fluorosubstrate肽(20μ米决赛浓度)和归一化的蛋白质浓度。所有的决定都是在10个不同的样品一式三份,执行和结果报告为相对荧光/μ克蛋白质(AU) (23]。每个实验进行了一式三份。

2.7。统计分析

血液参数评估使用δ(区别和预处理后的水平)。评估后正常的频率分布,所有变量受到方差分析使用一个单向方差分析的统计软件包SPSS 23版本。在适当的时候进行多元线性回归分析。之间的差异意味着至少被认为是重要的 。结果平均值±标准偏差。

3所示。结果

所有兔子存活80天的治疗;没有副作用发生。表1血液中显示了基线特征剖面除以组。没有发现组间差异的研究在血糖、血脂、肝和肾的概要文件(表1由rom oxidant-antioxidant水平),如图所示,TBARs和维生素A和E水平(表2)。通过使用δ(所有参数,测量不同后处理和基线水平,组间发现了显著差异。所有植物提取物能改善血脂,血糖和肝参数,不同的功效。

特别是,VB为特征的最大改善血脂。事实上,显著减少甘油三酸酯水平被发现在VB与CN ( 和VB和说唱 ),但不是关于LYC ( )(表3)。同样,在VB中总胆固醇的三角洲是最低的显著差异在CN和LYC(两者都是 )(表3)。同时,说唱能够显著降低总胆固醇的三角洲对CN ( )和LYC ( )(表3)。所有治疗方法也降低低密度脂蛋白胆固醇值对CN ( )。相反,VB补充是最健壮的工具增加高密度脂蛋白胆固醇,在尊重所有其他组显著差异(所有 )(表3)。此外,VB诱导降低血糖水平最高的CN,说唱,LYC(所有 )。此外,LYC显示,血糖水平显著降低对CN ( )而不是说唱( )(表3)。说唱组只显示部分减少CN,没有实现任何有意义的价值(表3)。

所有的植物提取物诱导减少肝参数,血清和血糖,对CN。VB再次诱导减少血清最高( ),而在降低血糖水平没有显著差异治疗组间(表中被发现4)。没有发现显著差异治疗组间在相互尊重CN和诱导总胆红素和肌酐水平变化(表4)。在氧化剂和抗氧化剂的变化,所有的植物提取物能够诱导显著减少氧化剂水平测量rom和TBARS和增加抗氧化维生素a和E CN(所有的尊重 )。罗水平被发现没有明显的统计学差异治疗组中,而VB显示最高的减少和说唱的最低。VB也负责在TBARS最重要的变化,在统计上有显著差异的尊重说唱( )和LYC ( )。说唱和LYC之间没有差异被发现。

VB是最有效的抗氧化剂,在增加维生素A和E对LYC ( 和 与说唱,职责),没有差异。然而,讨论小组显示,维生素A的变化对高值LYC ( )。

显著差异也发现组间SIRT1活动以兔子的心脏和肝脏,VB显示更高水平CN,说唱,LYC(所有 ,数据1(一)和1 (b))。没有发现显著差异之间的说唱和SIRT1 CN团体活动在心脏和肝脏,而更高的价值特征的说唱CN组。最后,在心脏,LYC显示明显高于SIRT1活动对CN ( )而不是说唱(图1(一)),而在肝脏,没有差异(图中被发现1 (b))。通过SIRT1蛋白表达评估、组之间没有差异被发现在心脏(图1 (c))和肝脏(图1 (d))的兔子。

总抗氧化能力(TAC)的植物提取物也由abt化验检查。在心脏,VB是唯一提取物能够显著增加( )在对TAC CN集团没有任何差异的说唱,LYC、CN(图组2(一个))。在肝脏中,显著差异( )所有组中发现的TAC CN, VB的最高水平( ),其次是说唱( )和LYC ( )(图2 (b))。

通过多元线性回归分析,介绍了SIRT1的心里活动作为因变量,最好的预测是由VB集团( , ;95% CI 55.990−−23.001),δglycaemia ( , ;95% CI 23.276−−13.418;图3(一个)),δrom ( , ;95% CI 2.677−−0.646;图3 (b)),δTBARs ( , ;95% CI 164.686−−3.505)。进行多元线性回归分析,引入SIRT1活动在肝脏作为因变量,最好的预测是由VB集团( , ;95% CI 40.941−−18.557),δglycaemia ( , ;95% CI 5.714−−1.769;图3 (c)),δrom ( , ;95% CI 3.148−−1.257;图3 (d))。

4所示。讨论

我们的数据表明不同植物提取物对血脂和血糖的功效概要文件和氧化剂/抗氧化状态(如TBARS、rom、TAC和维生素A和E)。特别是,VB的有益的影响似乎由SIRT1活动在兔子的心脏和肝脏,首次揭示的存在直接联系SIRT1的VB有利影响,增加活动。

细胞的多个方面和氧化还原信号以响应细胞压力是精细管理和守恒的动物和植物25- - - - - -27]。

在这项研究中,我们建议的不同影响植物提取物可能与各自不同的化学成分。最重要的好处是得到治疗Lippia citriodora包含verbascoside 5毫克/公斤饲料。

Verbascoside是一种多酚的酚酸子类作为药用植物,由于广泛的生物活性,包括心血管效应(28,29日]。

在我们的研究中,证据表明verbascoside不仅可以减少所有参数参与心血管风险组成,如glycaemia、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇,还诱导增加高密度脂蛋白胆固醇,精心确定保护心血管因素,证实了这些影响。

此外,VB影响维生素A和E水平加强这种植物提取物的抗氧化能力。此前,罗西等人表明,马鞭草科植物提取物可能通过保护提高体内维生素E的地位α生育酚氧化衰变(30.]。同样,伊格莱西亚斯et al。31日)报道,原花青素可以修复氧化α生育酚在中长期鱼肌肉。宫等。32)表明,增加维生素A和E水平可以归因于VB的能力加强,拯救内源性抗氧化系统,控制氧化代谢,减少活性自由基的生产和增加酶的抗氧化活性33- - - - - -35]。双重的作用机制,提出了宫殿et al。32),包括直接行动期间捕获自由基连锁反应的传播和prooxidant酶的抑制的起始氧化阶段(36]。维生素E,在其功能作为一种连锁中断抗氧化剂,迅速转移其酚醛氢原子,脂质过氧化氢自由基,将它转化为氢过氧化脂质和维生素E激进(37- - - - - -39]。

的确,SIRT1活动和维生素E水平之间的关系是在海马体和大脑皮层的啮齿动物,在维生素E阻止SIRT1表达减少高脂肪饮食引起的(40]。此外,Zillikens et al。41]发现维生素E和SIRT1之间的相互作用,表明该接口可能是由于维生素E的抗氧化作用及其作为管理者作用的酶和基因活性42]。在我们所知,这是第一个研究证明增加水平的维生素A和E与SIRT1活动增加有关。

根据富内斯等。43),VB相关生物活性也可以调节能力membrane-dependent细胞过程,如细胞信号(44)和线粒体功能(45,46),虽然这些影响的分子基础仍然不清楚(43]。

此外,Zhang et al。46)表明,在细胞治疗H₂O₂著名细胞氧化剂,VB管理诱导DNA氧化损伤的减少46]。

有趣的是,VB及其衍生物是唯一的例子成功的行动,由于同时抑制两个主要的表达和DNA结合促炎的转录因子激活蛋白1和核因子κB (47]。事实上,活动的主要抗氧化剂酶过氧化氢酶,谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶可以显著增强VB (48]。Quirantes-Pine et al。49]表明,VB管理后,抗氧化剂酶活性显著增强,而髓过氧物酶活动减少,暗示VB保护性抗氧化剂对血细胞的影响及其潜在的抗炎和antiatherogenic活动的老鼠。然后,作者建议这些VB行动影响氧化还原酶在转录后的级别(49]。此外,一些数据已经证实,NF -κB激活代表了VB机制负责保护作用[48,50]。

NF -κB系统调节细胞凋亡、增殖和能量代谢,然后生存在细胞应激(51- - - - - -53]。SIRT1能够调节NF -κB信号,从而维持细胞内稳态(54,55]。

在这项研究中,治疗与VB诱导显著增加SIRT1兔的心的活动,暗示可能这个关键氧化还原状态调节器的作用在刺激变化的氧化剂和抗氧化剂的水平。这一发现证实了SIRT1的崛起活动也在兔子的肝脏。我们提出,VB负责SIRT1激活通过激效机制。随之而来的SIRT1激活反过来能够诱导总抗氧化能力,包括过氧化氢酶等酶和SOD,知名SIRT1的目标。

以前,几项研究已经证明了VB能力诱导增加过氧化氢酶和SOD活性。最近,戴尔拉et al。56在VB-exposed]表明,过氧化氢酶活性显著提高卵母细胞。相同的作者建议增加可能是由于潜在的形成H₂O₂在酚醛树脂的氧化,猫活动结束,VB的刺激效应也可能与观察到的细胞内ROS水平增加(56]。同时,盛et al。57)透露,VB显著减少在PC12细胞中凋亡的死亡,而增加细胞外过氧化氢水平。

这些发现支持了假设激效效应可能负责SIRT1激活,没有表情的变化,随之增加抗氧化剂的反应。

最后,可能的解释的不同行为的其他提取物、获得和番茄红素,血液概要文件可能与不同的化学成分。事实上,辣根含有多酚类黄酮和木酚素,其滴定,然而,并没有被很好的定义。另一方面,番茄红素是类胡萝卜素。根据我们的研究也显示增加兔子SIRT1活动与番茄红素治疗对血糖和血脂水平的影响,Luvizotto et al。58]显示,番茄红素补充调节mRNA表达SIRT1的老鼠。

5。结论

这是第一次研究证明VB之间的关系管理和SIrt1兔子的心脏和肝脏组织的活动,这表明SIrt1可能调解这种提取物的抗氧化作用。此外,这些数据表明,所有的植物提取物VB,说唱,和LYC浓度不是有毒,使用能改善血糖和血脂水平,通过诱导的抗氧化效果,特别是对于VB, SIRT1可能介导的活动。当然,还需要进一步的研究来确认可能突显出机制,探讨参与其他sirtuins蛋白(如Sirt3)和解决毒物兴奋效应的作用在这些提取物的抗氧化反应引起的。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Corbi g和孔蒂诉了同样的工作。

确认

这项工作是支持由美国大学的健康科学莫利塞(R-DIPA_20112013300118)。