文摘

系统性fibrosing或僵化的疾病是致命的,但是只有非常有限的治疗方法是可用的。近年来,periostin (POSTN)是细胞外基质的主要成分,建立了一些研究小说关键球员在系统性纤维化疾病的进展。在这个研究中,我们揭示了氧化应激参与POSTN TGF -诱导的表达β1和IL-13真皮成纤维细胞。我们发现抗氧化肉桂醛NRF2 / HMOX1途径激活。肉桂醛也缓解了TGF -β1 - IL-13-mediated活性氧的生产和后续POSTN upregulation真皮成纤维细胞。相比之下,NRF2沉默的差别废除了cinnamaldehyde-mediated对这些POSTN。这些结果表明,肉桂醛是一个宽泛的抑制剂POSTN表达TGF -覆盖β1和IL-13信号。因此,肉桂醛可能是有益的治疗系统性纤维化疾病。

1。介绍

Periostin (POSTN)是深刻matricellular蛋白参与纤维化疾病的发展和进展以及过敏和肿瘤形成1- - - - - -5]。在Postn有缺陷的老鼠,bleomycin-induced纤维化是取消了控制野生型小鼠相比4]。此外,POSTN的表达是调节在硬皮病患者的皮肤lesional [4,6,7]。血清POSTN水平也升高硬皮病以及肺纤维化(7,8]。的差别也表明对这些POSTN变弱的profibrotic响应肝星状细胞(9]。

纤维化发病机理的一个特征是一个广泛的疾病,包括系统性硬化病、肺纤维化疾病,肾脏纤维化疾病,肝硬化。尽管antifibrotic治疗目前有限的(10- - - - - -18),最近的研究表明,核转录因子的激活erythroid-derived 2 2 (NRF2)改善profibrotic流程肺部,肾脏,肝脏,心脏,肠,和皮肤(19- - - - - -27]。NRF2是主抗氧化剂转录因子的转录上调等抗氧化酶基因编码HMOX1和NQO1(28,29日]。与之平行的抗氧化植物化学的肉桂醛(CIN)激活NRF2,诱发其cytoplasmic-to-nuclear易位和移植HMOX1表达在人类角质细胞和人牙髓细胞29日,30.]。此外,CIN-containing传统草药邮政寿险局医学Keishi-bukuryo-gan抑制培养的成纤维细胞胶原蛋白生产获得硬皮病患者(31日]。此外,这种类型的邮政寿险局药物是有效地减少总得分在一些硬皮病患者皮肤厚度32]。然而,我们所知,没有报道解决NRF2是否会影响POSTN表达式。

POSTN的表达是由两个截然不同的cytokine-mediated调节途径,即转化生长因子-β1 (TGF -β1)和interleukin-13 (IL-13) / il - 4 (9,33,34]。在这项研究中,我们首次证明CIN-mediated NRF2激活抑制诱导TGF - POSTN表达式β1以及IL-13信号。的双重抑制行动CIN-NRF2激活表明CIN-containing药物可以治疗纤维化疾病治疗中获益。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

肉桂醛是来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)和溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;和光,Sigma-Aldrich)或100%乙醇(kouichi大阪,日本)在5毫米的浓度。Anti-NRF2兔多克隆抗体(h - 300)是来自圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX)和辣根过氧化物酶(合)与anti-rabbit IgG抗体(# 7074)从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国)。免疫印迹分析,anti-NRF2兔多克隆抗体(pa5 - 27882;热费希尔科学)、anti-HMOX1兔多克隆抗体(ab137749;Abcam), anti-NQO1鼠单克隆抗体(ab28947;Abcam)和anti-GAPDH (14 c10)兔单克隆抗体(# 2118;细胞信号技术)。

2.2。细胞培养

正常的人类皮肤成纤维细胞(NHDFs)从Lonza购买(瑞士巴塞尔),依法维护供应商的建议。他们使用的表示浓度CIN 30分钟,然后处理5 ng / mL TGF -β1或IL-13 (PeproTech落基山,新泽西,美国)48 h。对于一些实验,NHDFs治疗CIN (25μ米)6 h。然后,RNA提取受到定量逆转录聚合酶链反应(存在)。为可拆卸的实验中,NHDFs被培养的小干扰RNA (siRNA) NRF2 24 h,紧随其后的是刺激与5 ng / mL TGF -β1或IL-13 48 h。然后,RNA提取受到中存在。调整实验,NHDFs用siRNA NRF2的培养24小时,其次是预处理与25μM CIN 30分钟然后刺激5 ng / mL TGF -β1 - 50 ng / mL IL-13 48 h。RNA提取和上层清液受到存在或ELISA,分别。

2.3。免疫荧光

eight-well NHDFs被放置μ幻灯片(Ibidi,慕尼黑,德国)和在subconfluence处理25μM CIN 3 h。然后,PBS的细胞被洗了,10分钟与丙酮固定,封锁与5% (w/v在PBS)牛血清白蛋白30分钟。样本孵化与主兔子anti-NRF2抗体或控制免疫球蛋白(Abcam,剑桥,英国)。发现特定的绑定使用HRP-conjugated山羊anti-rabbit抗体,随后tyramide与绿色荧光标记Alexa萤石488(分子探针,尤金,或者美国),按照制造商的协议。样本覆盖UltraCruz™安装介质包含4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(圣克鲁斯生物技术)来保护荧光。荧光图像是用一个evo FL细胞成像系统(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。

2.4。检测活性氧(ROS)的生产

NHDFs 48-well板中培养24小时。然后,PBS和刺激的细胞被洗20 ng / mL TGF -β1 - 50 ng / mL IL-13 (PeproTech) 20分钟。在显微镜下检测活性氧的生产进行了使用一个图像™住绿色活性氧检测设备(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)。短暂,oxidation-sensitive染料5 - (6)-carboxy-20 70 -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (carboxy-H2DCFDA)(分子探针)被用来量化ROS水平活细胞。细胞培养与杜尔贝科的磷酸盐(DPBS;热费希尔科学)与包含carboxy-H氯化钙和氯化镁2DCFDA(25毫米)25分钟37°C。然后,介质改为DPBS包含赫斯特33342(热费希尔科学)作为blue-fluorescent cell-permeant核酸染色。荧光图像是用一个evo FL细胞成像系统(技术)。

2.5。可拆卸的核的信使rna

siRNA寡核苷酸从Dharmacon购买/通用电气医疗集团(美国拉斐特有限公司)。细胞转染与5 nM目标+ siRNA NRF2或控制24小时的RNAiMAX试剂(热费希尔科学),按照制造商的说明。证实了沉默靶基因的存在。

2.6。定量实时聚合酶链反应(存在)

总RNA分离使用RNAiso +(豆类生物,大津,日本)和reverse-transcribed RNA-direct™实时PCR反应混合液(Toyobo,大阪,日本)。PCR反应进行StepOnePlus实时PCR系统(技术)使用雷鸟SYBR qPCR混合(Toyobo)。阈值周期引物探针是规范化的看家基因(glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH))和相对价值计算。表中描述的引物的存在1。

表1
用于实时定量rt - pcr引物序列。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA) Periostin生产

POSTN ELISA是使用两个不同的执行anti-POSTN Abs、SS18A(捕获抗体)和SS17B(检测抗体)(Shino-Test、东京、日本),如前所述[35]。

2.8。免疫印迹分析

西方墨点法进行如前所述[36]。在这项研究中使用的抗体(Abs)反对NRF2(1: 1000稀释),HMOX1(1: 1000稀释),NQO1(1: 1000稀释),和GAPDH(1: 1000稀释)。的HRP-conjugated anti-mouse或anti-rabbit IgG抗体(细胞信号技术)作为二级抗体。

2.9。统计分析

数据是平均数±标准差。使用Prism 5.0统计分析软件(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。差异的重要性是使用一个未配对单侧或双尾学生的评估 以及。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。CIN激活NRF2信号和诱发HMOX1生产真皮成纤维细胞

CIN诱发NRF2 cytoplasmic-to-nuclear易位的人类角质细胞和针对氧化应激(29日]。在这里,我们首先检查CIN培养的成纤维细胞的生存能力的影响。CIN 50浓度μ米并不影响成纤维细胞的可行性,由台盼蓝染料排除测试(图1(一))。正如前面在角化细胞(29日),CIN也诱导NRF2 cytoplasmic-to-nuclear易位的真皮成纤维细胞(图1 (b))。此外,CIN mRNA表达的诱导upregulation NRF2(图1 (c))。按照NRF2激活,CIN调节HMOX1和NQO1表达在mRNA水平,但只有HMOX1表达蛋白质水平(数字1 (d)- - - - - -1 (f))。这些结果说明CIN激活成纤维细胞的主要NRF2 / HMOX1抗氧化途径。

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图1
激活NRF2 / HMOX1,肉桂醛NQO-1通路。(a)的影响肉桂醛(CIN) NHDFs的可行性。(b) NHDF细胞治疗DMSO(控制)或CIN (25μ米)3 h和固定。细胞被沾anti-NRF2抗体或控制免疫球蛋白(绿色)和DAPI荧光显微镜(蓝色)和可视化。(汉英)NHDF细胞治疗DMSO(控制)或CIN (25μ米)6 h,之后总RNA提取。(c)NRF2信使rna表达,(d)HMOX1信使rna表达,(e)NQO1信使rna表达进行描述。(f) NHDF细胞用100%乙醇(控制)或CIN (25μ米)24 h后,完整的细胞溶解产物提取。的表达HMOX1、NQO1、GAPDH是描述。的值进行调整GAPDH表达式。相同的实验进行了三次。 , 。NS:不重要。
3.2。CIN抑制诱导TGF - POSTN表达式β1和IL-13真皮成纤维细胞

在先前的研究,表明氧化应激诱导的表达POSTN在心肌成纤维细胞和人类脐静脉内皮细胞(37,38]。因此,为了进一步评估CIN的抗氧化活动,我们调查是否CIN的感应与POSTN真皮成纤维细胞中表达。首先,我们调查是否TGF -β1和IL-13诱导细胞内活性氧的生成。如果细胞相比,TGF -β1和IL-13明显诱导细胞内活性氧形成NHDF细胞(图2(一个))。如数据所示2 (b)- - - - - -2 (e),TGF -β1和IL-13调节的基因和蛋白质表达POSTN真皮成纤维细胞。noncytotoxic浓度,CIN抑制了TGF -β1-induced upregulation的基因(图2 (b)(图)和蛋白质2 (c))POSTN的表情。它也抑制了IL-13-induced upregulation POSTN表达式的信使rna和蛋白质水平(数字2 (d)和2 (e))。

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图2
肉桂醛TGF -的影响β1 -和IL-13-induced periostin mRNA的表达在皮肤成纤维细胞和蛋白质。(一)NHDFs刺激与20 ng / mL TGF -β1、50 ng / mL IL-13或如果(控制)20分钟。细胞与carboxy-H孵化2DCFDA 25分钟,之后用荧光显微镜观察ROS生产。酒吧,200μm。(b, c)的影响肉桂醛(CIN) TGF -βperiostin 1-induced表达水平(POSTN) mRNA和蛋白。(d, e) CIN在IL-13-induced表达的影响POSTN信使rna和蛋白质。NHDF表示浓度的细胞被precultured CIN 30分钟,然后处理5 ng / mL TGF -β不及时治疗或1或IL-13 48 h。表达水平的POSTN信使rna和蛋白质在细胞上清液进行描述。的值进行调整GAPDH表达式。相同的实验进行了三次。 , 。NS:不重要。
3.3。NRF2的参与监管的mRNA的表达引起Periostin TGF -β1和IL-13

阐明的角色NRF2 POSTN基线和细胞因子诱导的表达,我们下一个可拆卸的NRF2使用NRF2核。可拆卸的效率为86.1±1.2%,证实了评估中存在和免疫印迹分析(图3(一个))。有趣的是,基线POSTN的表达显著增强在成纤维细胞NRF2击倒与转染与控制核(数字3 (b)和3 (c))。此外,TGF -β1 -和IL-13-mediated POSTN进一步增强在成纤维细胞NRF2击倒水平相比控制成纤维细胞(数字3 (b)和3 (c))。总的来说,这些结果说明NRF2会使本构和诱导POSTN表达式。

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图3
击倒的NRF2移植periostin在真皮成纤维细胞的表达。(一)与控制可以阻止或暂时NHDF细胞转染NRF2siRNA 24 h后,整个细胞溶解产物或总RNA提取。的表达水平NRF2归一化的吗GAPDH。NRF2蛋白质和mRNA表达式进行描述。暂时(b, c) NHDF细胞转染控制核或5海里NRF2核为24小时,然后用5 ng / mL刺激TGF -β1 (b)或IL-13 (c)。POSTN信使rna表达被描述。的值进行调整GAPDH表达式。相同的实验进行了三次。 , 。
3.4。NRF2击倒的差别废除CIN-Mediated对这些POSTN

接下来我们检查是否依赖NRF2 POSTN的差别CIN-mediated对这些。如数据所示4(一)和4 (b)TGF -β1调节POSTN mRNA和蛋白表达水平,CIN反过来抑制。CIN抑制TGF -的能力β1在成纤维细胞信号是废除NRF2击倒。此外,NRF2击倒废除IL-13-mediated CIN的抑制作用POSTNupregulation(图4 (c)和4 (d))。我们下一个试图确认CIN实际上抑制了TGF -β1 -和IL-13-mediated氧化应激。正如所料,CIN TGF -抑制βROS(图1 -和IL-13-induced生产5)。此外,我们研究了CIN TGF -的影响β1 -和其他IL-13-induced基因表达profibrotic介质,即tenascin-C (过渡委员会)、血管内皮生长因子(VEGF)和结缔组织生长因子(CTGF)。如图6,所有的表达过渡委员会,VEGF,CTGF调节了TGF -β分别为1和IL-13,显著抑制CIN在所有情况下。值得注意的是,CIN-mediated抑制能力再次废除了在成纤维细胞NRF2击倒,这表明NRF2信号有多个antifibrotic效果。

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图4
的参与NRF2 IL-13和差别的信号对这些TGF -β通过肉桂醛1-induced periostin表达式。(a, b)击倒NRF2逆转的影响肉桂醛(CIN) TGF -β1-induced表达periostin (POSTN) mRNA和蛋白。(c, d)击倒NRF2逆转CIN在IL-13-induced表达的影响POSTN信使rna和蛋白质。NHDF细胞与控制核或暂时性的转染NRF2核为24小时;接下来,细胞precultured 25μM CIN 30分钟,然后处理5 ng / mL TGF -β不及时治疗或1或50 ng / mL IL-13 48 h。表达水平的POSTN信使rna和蛋白质在细胞上清液进行描述。的值进行调整GAPDH表达式。相同的实验进行了三次。 , 。NS:不重要。

图5
肉桂醛TGF -的影响β1 -和IL-13-induced真皮成纤维细胞的活性氧产量。NHDF细胞precultured 25μM肉桂醛(CIN) 16 h,然后处理20 ng / mL TGF -β1 - 50 ng / mL IL-13 20分钟。细胞与carboxy-H孵化2DCFDA 25分钟,用荧光显微镜观察ROS生产。酒吧,100μm。
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图6
的参与NRF2 IL-13和差别的信号对这些TGF -β1-induced tenascin-C、VEGF和CTGF mRNA表达了肉桂醛。(a - c)击倒NRF2逆转的影响肉桂醛(CIN) TGF -β1-induced mRNA的表达过渡委员会,VEGF,CTGF。(d-f)击倒NRF2逆转的影响CIN IL-13-induced mRNA的表达过渡委员会,VEGF,CTGF。暂时NHDF细胞转染控制核或5海里NRF2核为24小时;接下来,细胞precultured 25μM CIN 30分钟,然后处理5 ng / mL TGF -β不及时治疗或1或50 ng / mL IL-13 48 h。信使rna表达水平的过渡委员会,VEGF,CTGF进行描述。的值进行调整GAPDH表达式。相同的实验进行了三次。 , 。NS:不重要。

4所示。讨论

纤维化是一个复杂的条件由profibrotic因素,胶原合成与降解的失衡,细胞外基质的upregulation包括POSTN和过渡委员会,并增加氧化应激。然而,POSTN表达式是监管的机制在纤维化疾病及其与氧化应激的关系仍然难以捉摸。在这项研究中,我们做了以下主要研究结果,揭示了机制:(i) CIN激活NRF2信号和移植HMOX1生产真皮成纤维细胞。(2)CIN抑制诱导TGF - POSTN表达式β1和IL-13真皮成纤维细胞。(3)击倒的NRF2上调mRNA的表达本构和TGF -β1 -和IL-13-induced POSTN。(iv) CIN-mediated抑制POSTN表达式由TGF -β1,IL-13是依赖NRF2信号。(v)同样的监管通过NRF2信号控制其它profibrotic分子,也就是说,过渡委员会,VEGF,CTGF。这些发现表明,CIN有潜在的治疗纤维化(图7)。


图7
肉桂醛的图解模型的分子机制抑制IL-13和TGF -β1-mediated periostin成纤维细胞中表达。肉桂醛诱发NRF2核易位和HMOX1生产,会使IL-13 TGF -β1-mediatedPOSTN,过渡委员会,VEGF,CTGF表达式通过减少活性氧产量,其次是纤维化的衰减。

系统性fibrosing或僵化的障碍如硬皮病、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心肌纤维化是致命的,但是只有非常有限的治疗方法可供他们(39- - - - - -42]。尽管新疗法,如nintedanib pirfenidone,叫,和雷帕霉素是新兴13,18,40,43,44),要求更多的安全的药物。

profibrotic过程在每个器官包括无对手的胶原蛋白积累(11,45]。除了这个胶原蛋白积累,大多数纤维化病变系统性纤维化疾病相关的调节POSTN的表达,主要产自激活成纤维细胞(4,6,7,21,35,46- - - - - -49]。值得注意的是,积累的证据表明,基质POSTN起着关键的作用在增强胶原蛋白的生产48,50),表明POSTN系统性纤维化的治疗是一个潜在的目标(4,6,7,46]。

两个不同的细胞因子,TGF -β1、IL-13上调POSTN表达式通过不同的信号通路(1,2,9,33,34]。的邮政寿险局草药Keishi-bukuryo-gan抑制胶原蛋白生产培养成纤维细胞来源于硬皮病患者(31日]。此外,日本案例系列21系统性硬化症患者显示邮政寿险局草药包括Keishi-bukuryo-gan改善临床僵化19硬皮病患者的症状(90.4%)(32]。基于这一背景,我们推测,CIN的主要活性成分Keishi-bukuryo-gan,可能下调POSTN成纤维细胞中表达。

在这项研究中,我们确实证明CIN抑制成纤维细胞刺激通过TGF - POSTN表达式β1或IL-13信号。CIN是一种安全天然产品来源于肉桂,这是一种常用的调味品。CIN也被认为是一种强有力的抗氧化剂的植物化学成分,激活抗氧化剂NRF2 / HMOX1和NQO1轴(29日,51]。TGF -β1和IL-13信号诱导氧化应激通过产生活性氧(27,52),我们假设CIN / NRF2-mediated抗氧化活性有助于抑制作用在两个TGF -β1-induced和IL-13-inducedPOSTNupregulation。正如预期的那样,在我们的实验条件下,CIN诱导NRF2 cytoplasmic-to-nuclear易位,NRF2激活调节的表达HMOX1和NQO1在mRNA水平,但只有HMOX1在蛋白质水平的表达(图1)。各种化合物包括CIN被证明促进NRF2-mediated HMOX1和NQO1基因在几个细胞如成纤维细胞、角质细胞,内皮细胞,结肠上皮细胞,心肌细胞(29日,51,53- - - - - -55]。我们目前的研究结果和先前的研究表明,激活细胞抗氧化反应主要策划NRF2被发现通过增加HMOX1在人类皮肤成纤维细胞(54]。基线以及TGF -β1-induced和IL-13-inducedPOSTNupregulation在成纤维细胞增强NRF2击倒。此外,CIN-induced抑制POSTNupregulation废除了TGF - NRF2击倒β1和IL-13刺激。IL-13 profibrotic细胞因子,参与皮肤的纤维化和内部器官如肝脏和被认为发挥重要作用在炎症和纤维化的过程56,57]。此外,纤维化的关键在哮喘气道重塑的病理特征,以及当前的研究表明,激活NRF2信号通路改善ovalbumin-induced过敏性气道炎症,这也是我们目前支持的结果(58]。这个研究表明,TGF -β1和IL-13刺激诱导细胞内活性氧产生和激活NRF2信号通路抑制真皮成纤维细胞细胞因子信号。尽管底层机制尚未阐明,ROS生产由TGF -β1和IL-13刺激加剧纤维化通过upregulation profibrotic分子合作。这些结果表明,TGF -的影响β1和IL-13刺激可能与ROS的要求生产,并且每个信号通路是由NRF2 / HMOX1通路。此外,氧化应激似乎协调移植等profibrotic分子的表达VEGF,CTGF,过渡委员会。我们所知,这是第一个报告证明CIN / NRF2通路调节POSTN表达诱导TGF -β1和IL-13。

总之,这里的结果表明CIN抑制剂广泛的覆盖TGF - POSTN表达式β1和IL-13信号。包含高水平的CIN药草和药物,如Keishi-bukuryo-gan,因此可以适用于系统性纤维化疾病的治疗和预防。

数据可用性

没有数据被用来支持本研究。

的利益冲突

作者没有实际或潜在的利益冲突与此相关的工作。

确认

这项工作在一定程度上支持的资助日本卫生部、劳动和福利(食品安全研究;H27-Designated研究- 017)。