文摘

的经皮应用控制温度对受损的肌肉被认为是一种普遍的补救措施。然而,具体机制并不完全理解。因此,细胞成肌细胞的行为下了生理温度超热状况。成肌细胞培养是在任何治疗(NT, 37°C, 24小时/天),间歇式热处理(《国际先驱论坛报》,39°C, 2 h /天),和连续热处理(CHT, 39°C, 24小时/天)在扩散,迁移,或肌原性的分化。虽然温和的热量对迁移的影响没有观察到,扩散是由《国际先驱论坛报》和本。肌原性的分化也增强处理时间的方式,就是明证肌管的大小和融合指数的增加。线粒体生物起源的基因表达式(Pgc-1α、Nrf1 Tfam),线粒体动力学的一个子集(Mfn1和Drp1),和一个肌原性的调节因子(myogenin)增加热处理时间的方式。有趣的是,轻微的燥热引起肌原性的分化和myogenin表达在PGC-1明显迟钝α针对siRNA-transfected细胞,这表明轻度高热促进肌原性的分化通过PGC-1的调制α。这项研究提供了细胞的证据支持,地方超热状况治疗39°C被认为是一种有效的治疗策略,促进卫星在再生肌纤维细胞活动。

1。介绍

康复骨骼肌损伤是由一系列事件组成的退化,炎症,和再生1]。在肌肉恢复的早期阶段,发生重大破坏的肌纤维坏死,立即移除受损的细胞碎片(紧随其后2]。据报道,根据程度的损伤状态,变性和炎症阶段持续1到7天(3,4]。在炎症阶段,从单核细胞巨噬细胞成熟不仅清除受损细胞的吞噬作用,产生趋化信号分子导致卫星细胞的激活适当的受伤的肌纤维再生(3]。

康复和运动医学领域,已经有大量的工作在促进骨骼肌恢复。本地应用程序的最普遍的策略是控制温度对骨骼肌受损。在过去,当地hypothemic治疗被认为是一个很有效的策略管理的创伤性疼痛,肿胀和炎症反应。(5- - - - - -8]。然而,一项研究表明,骨骼肌再生由hypothemic减毒疗法由于过度抑制炎症反应,这表明一个适当的炎症过程的初始阶段促进再生肌纤维的复苏至关重要9]。符合这一点,热处理已被证实能提高巨噬细胞的激活,导致再生肌纤维的数量的增加在受损的实验大鼠趾长伸肌肌腱牵向前4]。此外,几行研究证明,温和的热处理在39°C的应用有利于肌细胞生成,而温度41°C是有害的(卫星细胞活动10,11),提供的证据表明,卫星细胞的内在生物能力严格调制热敏的方式。

卫星细胞是多功能肌原性的干细胞和肌纤维膜和基底膜之间存在的肌纤维12]。卫星细胞介导肌肉再生包括编制一系列的细胞过程。具体地说,一旦激活,静止卫星细胞进入增殖阶段和迁移到损伤的网站,其次是肌原性的分化形成新的纤维或合并到现有的纤维13,14),所有的步骤是骨骼肌的适当改造的关键。然而,具体机制heat-mediated肌原性的分化并不完全理解。

阐明细胞行为的成肌细胞,细胞在三种不同条件下培养的研究。慢性热处理(十)的值被设定为39°C,因为这个温度很容易达到在深骨骼肌生理系统(15]。相比之下,成肌细胞(《国际先驱论坛报》)受到周期2小时39°C和22小时37°C,直到被化验。热处理细胞与细胞培养在37°C。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

C2C12成肌细胞被播种到collagen-coated 6-well盘子和维护在杜尔贝科修改鹰的介质(Welgen、Kyungsan、韩国)含10%胎牛血清的边后卫,100单位/毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(Welgene、Kyungsan、韩国)在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C或39°C。当成肌细胞融合性的(95%),生长培养基(10%的边后卫)改为分化培养基(DM)补充2%马血清,100单位/毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(Welgene、Kyungsan、韩国)。细胞分化为3 - 5天37°C或39°C。慢性热处理、增殖或分化成肌细胞培养在39°C连续显示时间。间歇式热处理(《国际先驱论坛报》)、增殖或分化成肌细胞培养2小时39°C,紧随其后的是一天22小时37°C。这个循环重复,直到每个实验的最终协议。具体培养时间为每个实验中所描述的每个图的传说。细胞培养在至少四个独立的时期了。如前所述(执行核转染16]。简单地说,Pgc-1α核或炒核(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)在OPTI-MEM prediluted介质(Gibco,医学博士,美国)包含Lipofectamine 2000 (Gibco,医学博士,美国)。Lipofectamine-siRNA复合物添加到每个镀好后立即细胞在DMEM + 100单位/毫升5%的边后卫没有青霉素、链霉素和100毫克/毫升(每个核的最终浓度是10海里)。6 h(孵化后,媒体交换与DMEM补充10%的边后卫18 h。

2.2。细胞计数分析

细胞计数分析是用台盼蓝排斥试验进行小修改(17]。C2C12成肌细胞被镀到60毫米培养皿中30%的融合和生长在生长介质表示温度。每24小时48小时中被改变。这些细胞被使胰蛋白酶化和台盼蓝染色。使用血细胞计数器nonstained可行的细胞数。细胞的数量被表示为成肌细胞数量/毫升。

2.3。成肌细胞迁移试验

一个非细胞面积在95%汇合的单层膜的成肌细胞生成刮200μL吸管小费。成肌细胞迁移试验进行培养基(DMEM)补充100单位/毫升0.1%的边后卫和青霉素和链霉素100毫克/毫升24小时在湿润的气氛中5%的有限公司2在指定的温度条件。的成肌细胞迁移到非细胞面积测量。图片是使用相差显微镜(卡尔蔡司,耶拿,德国)后24小时内细胞的生成。

2.4。免疫细胞化学肌凝蛋白重链和Myonuclei

差异化的肌管被孵化固定和permeabilized冰冷的甲醇(美国圣路易斯Sigma-Aldrich) 10分钟。补液后杜尔贝科的磷酸盐(DPBS)三次,肌管孵化在屏蔽解决方案,包括2%牛血清白蛋白(BSA)在室温下30分钟,其次是孵化2% BSA溶液中含有anti-sarcomeric肌球蛋白抗体MF-20共轭Alexa萤石488(美国圣地亚哥eBioscience)。myonuclei后沾4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(分子探针,尤金,或者美国),荧光显微镜下的显微图被收购(卡尔蔡司,耶拿,德国)。

2.5。融合指数

融合指数myological指标显示肌管的肌原性的分化程度。指数的计算方法是肌管的细胞核数量除以总数量的核观察,表示为%。细胞的最小数量的三个myonuclei算作分化肌管。

2.6。中存在

差异化的肌管和冷洗DPBS与试剂盒试剂和细胞溶解。氯仿添加RNA与DNA和蛋白质分离的分数。RNA分数被加入异丙醇沉淀,离心12000紧随其后 8分钟4°C。RNA丸是用75%乙醇和离心机在12000年 5分钟在4°C。取消乙醇后,RNA丸之前风干resuspending与核糖核酸酶游离水。RNA浓度是量化使用NanoDrop分光光度计(美国德NanoDrop技术)。逆转录cDNA合成设备执行根据制造商的指令(Bioneer、大田、韩国)。互补的DNA合成后,在执行中存在实时PCR系统(应用生物系统公司、钙、美国)使用SYBR绿色主人(Bioline、Hanam、韩国),混合和引物对集表中描述1。循环阈值(Ct)值归一化到管家基因(HPRT1-F: 5 - GACTTGCTCGAGATGTCATG 3 ,HPRT1-R: 5 - TACAGTCATAGGAATGGACC 3 )。

表1
引物组中存在。
2.7。统计分析

结果提出了均值±SEM至少四个独立的实验。单向方差分析之后,图基的事后测试统计组之间的差异。统计学意义是设定在 。

3所示。结果

3.1。《国际先驱论坛报》和本在成肌细胞的迁移和增殖

迁移成肌细胞(%)在统计学上没有改变相比,《国际先驱论坛报》和本组织NT(数字1(一)和1 (b))。成肌细胞增殖增加了《国际先驱论坛报》,CHT治疗时间的方式( ,图1 (c))

(一)
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(b)
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(c)
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图1
轻度热处理而不是促进成肌细胞增殖迁移。(a和b)迁移成肌细胞相衬显微镜下观察(放大x = 20)。比例尺代表50μm。后刮到60毫米200年文化板块μm吸管提示confluency 95%,迁移成肌细胞测量24小时后,被表示为% NT。(c) trypsin-treated肌母细胞悬浮在培养基与血细胞计数器计算孵化后48小时在DMEM补充的边后卫在特定温度条件下为10%。数据被表示为细胞/毫升。每个实验进行了至少四个单独的细胞培养。条形图代表±SEM手段。数据分析使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。 与NT(不处理); 和《国际先驱论坛报》(间歇式热处理)。
3.2。《国际先驱论坛报》的影响和CHT肌原性的分化

3天,形成肌管的数量在分化高十组相比,《国际先驱论坛报》和NT组( ,数据2(一个)和2 (b))。4天,肌管的数量在《国际先驱论坛报》组相比,NT组最高数量CHT集团(数字2(一个)和2 (b))。深入探讨肌小管形态,肌凝蛋白重链和myonuclei肌管分化为4天沾MF20和DAPI (4 ,6-diamidino-2-phenylindole)(图2 (b))。总myonuclei数低、组相比,《国际先驱论坛报》和NT组(图2 (d)),而肌管融合指数(计算中肌管的细胞核数量除以总数量的核数)是最大的十组( ,图2 (e)),这表明更多的成肌细胞参与肌原性的分化。肌管的宽度和长度是最大的,其次是《国际先驱论坛报》和NT ( ,数据2 (f)和2 (g))。

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图2
温和的热处理促进肌原性的分化治疗时间的方式。(一)成肌细胞分化与2%马血清DMEM补充5天在指定的温度条件。分化成肌细胞在相差显微镜下观察和统计每24小时(放大倍数= 10倍)。比例尺代表100μm。(b)肌管数,表示为每个字段。(c)分化肌管与DAPI染色和MF20抗体和可视化荧光显微镜(放大x = 20)。比例尺代表50μm。(d) Myonuclei (e)融合指数(f)肌管宽度,(g)和肌管长度是量化的。每个实验进行了至少四个单独的细胞培养。条形图表示±SEM手段。数据分析使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。 与NT(不处理); 和《国际先驱论坛报》(间歇式热处理)。
3.3。《国际先驱论坛报》和本契约对基因表达的影响线粒体重构

线粒体生物起源的多个基因表达式(Pgc1 -α、Nrf1 Tfam)增加治疗时间的方式( ,图3(一个))。Ncor1的表达,消极的线粒体生物起源的调节器,是没有改变的治疗(图3(一个))。所有线粒体动态的基因表达标记(Mfn1, Opa1、Drp1 Fis1)既增加了治疗方法。具体来说,表情Mfn1和Drp1最大的十组,其次是《国际先驱论坛报》和NT组( ,图3 (b))。

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图3
温和的热处理促进线粒体重建治疗时间的方式。成肌细胞分化与2%马血清DMEM补充在指定的温度条件。(a)基因的表达积极的监管机构(Pgc-1α、Nrf1 Tfam)和负监管机构(Ncor1)线粒体生物起源的量化。线粒体融合(b)基因的表达(Mfn1和Opa1)和裂变(Drp1和Fis1)被量化。每个实验进行了至少四个单独的细胞培养。条形图表示±SEM手段。数据分析使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。 与NT(不处理); 和《国际先驱论坛报》(间歇式热处理)。
3.4。《国际先驱论坛报》和本肌球蛋白重链亚型的基因表达和Myogenin

肌球蛋白重链亚型的基因表达式和测量肌原性的标记。MyHCI的表达增加两治疗组治疗时间的方式。MyHCIIa增加的表达只在CHT组相比,NT组( ,图4(一))。IIb MyHCIIx的表达,都没有改变治疗。的表达myogenin增加治疗时间的方式( ,图4 (b))。

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图4
温和的热处理促进MyHCI的表达式和myogenin治疗时间的方式。(a)基因的表达肌球蛋白重链亚型(IIb MyHCI、活动花絮,IIx)和(b)肌原性的因素(myogenin)在指定的温度条件下肌管分化量化。每个实验进行了至少四个单独的细胞培养。条形图表示±SEM手段。数据分析使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。 与NT(不处理); 和《国际先驱论坛报》(间歇式热处理)。
3.5。PGC-1α端依赖温和燥热引起肌原性的分化

温和的燥热引起肌管的宽度和长度和myogenin表达减少PGC-1 nonheat-treated细胞的水平α针对siRNA-transfected细胞( ,图5)。

(一)
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图5
温和的热处理PGC-1促进肌原性的分化α依赖的方式。(一)成肌细胞和控制核或Pgc-1转染αsiRNA,孵化区分72小时在特定温度条件下与2%马血清DMEM补充,青霉素100单位/毫升和100毫克/毫升链霉素。差异化的肌管与DAPI染色,用荧光显微镜(放大x = 20)。比例尺代表50μm。(b)肌管宽度,(c)肌管长度和(d)的水平肌原性的量化表达式。每个实验进行了至少四个单独的细胞培养。条形图表示±SEM手段。数据分析使用单向方差分析图基的事后测试紧随其后。 与未经处理的细胞。

4所示。讨论

控制温度对损伤部位的应用被认为是普遍的无创性方法肌纤维再生(8,18]。然而,细胞机制并不完全清楚。在这里,我们表明,轻度超热状况治疗促进成肌细胞增殖和肌原性的分化治疗时间的方式,而不是迁移。我们的研究结果也显示,轻度燥热引起肌原性的分化是PGC-1控制α端依赖的方式。

卫星细胞存在于一层磷利基mitotically基底条件下静止状态(19]。一旦激活等创伤性细胞外刺激肝细胞生长因子和一氧化氮,静止卫星细胞进入自我更新过程的相位变换称为成肌细胞的增殖肌原性的细胞(20.]。在目前的研究中,轻微的超热状况的治疗刺激成肌细胞增殖率。这个结果是按照以前的研究报道,核DNA含量,代孕的标志增殖,增加热敏的方式(21),暗示可能温和的热处理在39°C促进卫星自我更新过程的初始步骤。这个想法进一步支持的一种啮齿动物研究表明,20分钟的经皮应用热处理,受伤后,趾长伸肌肌腱牵向前(EDL)再生纤维的数量增加4]。

卫星细胞沿肌纤维molecule-dependent方式(在外部的趋化作用22]。由于卫星沿肌纤维细胞稀疏分散,一个高效的成肌细胞的能动性是保证快速复苏肌纤维(23]。在目前的研究中,超热状况的治疗并没有改变成肌细胞迁移(数据的速率1(一)和1 (b))。这表明高热本身并不足以加快卫星细胞的能动性。目前,温和的热处理对成肌细胞迁移的影响还没有被报道。因为它已经知道成肌细胞迁移的速度明显受到外部信号分子如胶质瘤、FGF, SDF-1 [22),未来的研究是必要的测试如果热处理协同影响卫星细胞移植的治疗下已知外部化学引诱物。

成肌细胞融合是由myogenin-induced纳入肌纤维肌原性的分化,这被认为是一个关键的和不可逆转的步骤在卫星细胞介导肌肉再生(19]。在目前的研究中,更多的肌管观察本和《国际先驱论坛报》的细胞相比,NT分化的第四天。支持的增加肌原性的分化进一步增强融合指数和肌管尺寸热处理时间的方式(数字2(一个)- - - - - -2 (g))。在以前的在活的有机体内研究使用啮齿动物,高热的影响已经被浸泡了动物受伤的腿到温水每天只有20到30分钟,以避免过度增加的体温4,24,25]。因此,它仍然是难以捉摸的较长的治疗是否会进一步增强骨骼肌再生的速率。关于这个概念,我们的研究结果意味着一块细胞的可能性,在肌原性的分化阶段,当地超热状况的持续治疗受伤的骨骼肌可以扩展到促进卫星细胞分化再生肌纤维。

线粒体是动态的亚细胞的细胞器在必要时调节它们的大小和质量,以及他们的生物转化和重构聚变和裂变是必不可少的对于维持代谢能力,肌纤维(26- - - - - -28]。在这项研究中,超热状况的治疗增加了线粒体生物(Pgc-1的表达式α、Nrf1 Tfam)和重构(Mfn1, Opa1 Drp1, Fis1)标记(数字3(一个)和3 (b))。符合这一点,多项研究证明了线粒体生物起源和装修成肌细胞肌原性的分化是必不可少的步骤(29日,30.]。这表明代谢转移到线粒体氧化磷酸化发挥核心作用,温和heat-mediated肌原性的分化。这个概念进一步增强表达支持的mitochondria-rich氧化纤维(MyHCI和MyHCIIa)和肌原性的调节因子(myogenin)热处理细胞(图4)。肌原性的监管因素,myogenin已经知道不仅启动肌细胞生成的过程,也作为重要的行列式肌纤维特性。具体地说,它已经证明,myogenin主要表达在slow-twitch肌肉31日,32myogenin),表示一种独特的角色在改变肌肉纤维氧化纤维类型。随着myogenin表示处理时间的方式,似乎myogenin发挥了重要作用,增加更多的氧化纤维的表达式(MyHCI和MyHCIIa)在heat-mediated肌细胞生成。

PGC-1已被广泛接受α线粒体生物起源的,主监管机构,监管网络控制中扮演着中心角色众多mitochondria-related转录因子在肌原性的分化(33,34]。因为它已经证明PGC-1枯竭α变弱myogenin表达式(35),成肌细胞和PGC-1转染α核和超热状况条件下分化调查的可能机制heat-mediated肌原性的分化。有趣的是,轻微的燥热引起PGC-1分化潜力明显减弱α针对siRNA-transfected细胞(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。这是符合的表情下myogenin热处理在转染细胞(图5 (d)),这表明轻度燥热引起肌原性的微分控制通过PGC-1的调制α和myogenin轴。

总之,这项研究表明,轻度热处理促进扩散的速度和肌原性的分化治疗时间的方式,而被认为提供一个重要的细胞证据表明临床局部超热状况治疗可以被认为是一个有效的策略来提高再生肌纤维(图6)。然而,在解释我们的研究中,应该注意的是,温度是39°C作为一个温和的超热状况条件。鉴于骨骼肌的温度可能会升高到44°C在高热和肌原性的分化潜力明显在41°C(特异表达36),仔细考虑应该考虑开发一个有效的超热状况的疗法。


图6
拟议的机制在轻度超热状况条件下卫星细胞肌原性的再生。虚线箭头表示细胞过程的卫星细胞肌纤维再生。轻微的箭头指示效果超热状况的治疗。SC:卫星细胞。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

所有作者参与设计、解释的研究和审查的手稿。

确认

这项工作是由韩国国家研究基金会(格兰特nrf - 2016 r1c1b2015125)和Kyungsung大学2018年研究资助。