文摘
本研究调查了蒜素的功效作为抗菌、抗炎、抗氧化、免疫刺激剂代理减少的严重程度巴斯德菌multocida(p . multocida)B型感染的兔子。五十个新西兰兔,5周大,被同样分为五组。除了第1组,所有组鼻内感染p . multocidaB型(2×105集落形成单位/毫升/兔子)。然后,组3只兔子被口头处理蒜素(50毫克/公斤体重)5天,单剂口服组4兔子收到诺氟沙星30%(100毫克/公斤体重),而治疗组5只兔子诺氟沙星和蒜素的结合。血液、血清生化、炎性细胞因子、免疫和组织病理学分析。结果显示,兔子,感染p . multocidaB型,表现出macrocytic低贫血和白细胞增多。吞噬百分率和吞噬指数显著升高此外,显著降低血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白(免疫球蛋白和IgM)水平观察到感染的兔子。受感染的兔子增加血清炎性细胞因子(TNF -α和il - 6)、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、血清胆红素(总、直接和间接)的水平。此外,p . multocida感染诱导氧化应激显著减少为代表的血清水平的减少谷胱甘肽和酶超氧化物歧化酶和血清丙二醛明显海拔。大蒜素治疗,诺氟沙星,或它们的组合显著改善所有研究参数的变化。总之,大蒜素能改善炎症和氧化应激反应,引起的p . multocidaB型感染的兔子。
1。介绍
巴斯德菌multocida (p . multocida)是一种微生物,它自然发生在一些动物的呼吸道;然而,它可能是一个致命的病原体感染其他动物宿主(1]。巴斯德菌病是一种疾病,影响兔子、鼻炎、肺炎、睾丸炎,中耳炎,败血症,脓肿形成2];然而,感染p . multocida可能是无症状(3]。
诺氟沙星是一代氟喹诺酮类广谱的活动,组织强有力的杀菌作用和高渗透(4,5]。尽管它的功效,它已被证明,抗生素的痕迹出现在动物产品可以直接影响人类健康的副作用和对肠道菌群和降水的影响或间接通过增加细菌抵抗抗生素诺氟沙星(最大残留限度是0.02 - -0.1在猪和家禽)(6]。抗生素耐药性的出现(7]和兔子的过敏症几种抗菌药物排除了抗生素的广泛应用在这个物种8]。
大蒜(大蒜)被认为是最古老的草药,用于治疗一些疾病。有效对抗几个革兰氏阳性,革兰氏阴性,抗酸的细菌(9]。此外,它有抗氧化、免疫调节和抗炎作用[10- - - - - -12]。大蒜素是大蒜的主要生物活性成分丁香提取物具有强力的抗氧化活性(11]。此外,它已被证明对一些外源性物质,起到organoprotective作用如溴氰菊酯和阿霉素(13,14]。
这项研究进行了评估的抗氧化、抗炎和免疫调节作用的蒜素单独或与诺氟沙星治疗相结合p . multocida感染的兔子。
2。材料和方法
2.1。实验动物
雄性新西兰白兔(850 - 1000克,5周的年龄)得到教师的兽药、Zagazig大学。兔子被安置在一个无菌设施,保持在24±2°C 50 - 60%的相对湿度和12 h:光暗周期。兔子有随意访问自来水和基底配给。所有的兔子都适应一周之前实验。兔子处理和治疗程序进行根据实验动物保健和使用指南的国家卫生研究院(NIH)和研究伦理委员会批准在兽医学院,Zagazig大学。所有的努力都是对减少动物痛苦。
2.2。菌株
巴斯德菌multocida B型获得国家研究中心Dokki(埃及吉萨)和用于实验感染2×10的最终浓度5菌落接种前(CFU)。
2.3。药物
诺氟沙星是购自ATCO制药(300毫克/毫升Atonor 30日,口服暂停)。蒜素是来自安徽Ruisen生物科技有限公司、中国。所有使用的包被Spinreact销售,西班牙。
2.4。实验设计
驯化后,五十个兔子(6周的年龄)被随机分配到五组(每组10只兔子)。组1只兔子有鼻内(在)磷酸盐(1毫升),继续作为阴性对照组。兔子在其他组在感染2×105CFU / ml /兔子的p . multocida B型在实验的第一天15]。五天之后(出现临床症状),组3只兔子被口头处理蒜素50毫克/公斤体重5天(16),组4兔子收到一个口服剂量的诺氟沙星(100毫克/公斤体重)17),而治疗组5只兔子被口头与诺氟沙星和大蒜素在同一剂量方案用于组3和4。
2.5。样本收集和准备
收集血液样本的实验最后剂量(24小时后)耳静脉:2毫升的血液在肝素化试管吞噬百分率和评价指数0.5毫升的试管抗凝血液研究(EDTA)和5毫升玻璃管不抗凝血清分离评估生化参数。肺和肝脏组织解剖了颈椎脱位后,用生理盐水洗净,与10%的中性缓冲福尔马林固定的组织病理学检查。
2.6。吞噬作用分析
兔子从不同群体的肝素化血样用于白细胞分离。白色念珠菌(白念珠菌)吞噬活动的准备和用于评估方法的威尔金森(18]。巨噬细胞的数量(中性粒细胞和单核细胞)包含白念珠菌(吞噬%)连接到或被100年每个人准备吞噬细胞是由光学显微镜。此外,吞噬指数计算确定的平均数量上和吞没了白念珠菌乘以吞噬百分率(19]。
2.7。血液指标
血液样本,收集管中含10% EDTA溶液,用于测定红细胞(红血球)、血红蛋白(Hb)、红细胞比容/包装细胞体积(HCT / PCV %),白细胞(WBC:白细胞像),并根据高斯微分白细胞计数(DLC) (20.]。均值小体体积(MCV)和平均小体血红蛋白浓度(MCHC)计算。
2.8。生化试验
血清样本进行了分析测定丙氨酸转氨酶(ALT)的方法,莱特曼和弗兰克尔21据Tietz)、碱性磷酸酶(ALP) (22),乳酸脱氢酶(LDH)酶根据Buhl和杰克逊(23]。总蛋白和白蛋白水平测量根据杜马et al。24]和Drupt [25),分别。球蛋白浓度被减去计算获得了总蛋白浓度的白蛋白浓度根据杜马和比格斯(26]。
2.9。免疫球蛋白和细胞因子测定
血清浓度的免疫球蛋白G(免疫球蛋白)和免疫球蛋白M (IgM)测定使用商业免疫球蛋白和IgM ELISA试剂盒,购自Bethyl实验室、美国(猫。不。e121 - 111,很多没有。e121 - 111 - 150331,猫。不。e120 - 110,很多没有。分别e120 - 110 - 29)。血清肿瘤坏死因子-α(TNF -的浓度α)和白细胞介素- 6 (il - 6)是衡量使用标准工具获得Genorise(紫菜™兔子TNF -α酶联免疫试剂盒,猫。不。分别GRC144010)和CUSABIO (CSB-E06903Rb)。
2.10。估计血清氧化应激标记
血清样本被用来测定谷胱甘肽(GSH)水平降低据Jollow et al。27),超氧化物歧化酶(SOD)活性根据Nishikimi et al。28)和脂质过氧化反应标记(丙二醛(MDA)根据硫代巴比土酸反应使用的方法Ohkhawa et al。29日]。
2.11。组织病理学研究
不同组的肺和肝的标本收集和中性缓冲福尔马林固定在10%,转移在乙醇(70%),然后清除在二甲苯和嵌入在石蜡。Five-micron-thick部分石蜡是准备与苏木精和伊红染色染料(30.),显微镜下检查。
2.12。统计分析
所有的数据都表示为 意味着(SEM)和误差统计分析了SPSS / PC软件(2001)使用单向方差分析(方差分析),紧随其后的是事后图基的测试。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。临床症状和死亡率
实验的第三天,医生。2rabbits (infected but untreated) started to show the acute form of the disease (depression, reduced food intake, sneezing, conjunctivitis, respiratory distress, dyspnea, or even sudden death) with a mortality rate of 60%. However, rabbits treated with allicin (gp.3) and norfloxacin (gp.4) showed less severe clinical signs than did gp.2 with mortality rates of 40 and 30%, respectively. Rabbits treated with both allicin and norfloxacin (gp.5) were nearly healthy with much less severe clinical signs and a mortality rate of 10% till the time of scarification at the end of the experiment.
3.2。Erythrogram
在实验结束时,有显著降低( 红细胞计数、Hb浓度,PCV %和MCHC值,而MCV值表现出显著增加( 在兔子感染p . multocida(gp.2),而控制(gp.1)。然而,gps的兔子。3,4,和5showed non-significant changes in the RBCs count, Hb concentration, PCV%, MCV, and MCHC% except Hb concentration and MCHC% showed significant increases in gp.5 compared to gp.2 (Table1)。
3.3。白细胞像
白细胞的总数、嗜中性粒细胞和单核细胞计数显示显著增加( )和明显降低( )淋巴细胞计数和嗜酸性粒细胞计数无显著变化p . multocida兔子(gp.2)来华,而控制(gp.1)。对gps。(3、5)显示一个非显著下降( )在前面的参数除了嗜中性粒细胞计数,显示明显降低( ),白细胞总数显示明显降低( 在全科医生。5compared to gp.2, while gp.4 showed a significant increases ( 白细胞的总数),中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数与gp.2相比,淋巴细胞和单核细胞数量的变化。吞噬活动吞噬%和吞噬指数显著增加( )p . multocida来华的兔子(gp.2)相比,控制。治疗兔子(gps。3,4,和5) exhibited significant increases in both parameters ( ),而受感染的参与群体;然而,这些治疗可以恢复正常范围内浓度与对照组(gp.1)(表1)。
3.4。生物化学分析
表2显示详细的变化在不同的生化参数控制,感染,和治疗组。此外,血清免疫球蛋白(免疫球蛋白和IgM)水平显示显著降低( 在全科医生。2,while gps.3, 4, and 5 demonstrated significant increases ( ),而受感染的兔子。联合治疗恢复正常控制水平的血清总蛋白浓度(gp。1只兔子)。
3.5。炎性细胞因子
血清炎性细胞因子(il - 6和TNF -α)增加( 在全科医生。2和significant decreases ( )治疗组(4和5),除了接受蒜素(gp.3),未能改善血清TNF -α浓度,而感染参与兔子(表2)。联合治疗可能恢复血清TNF -α浓度正常控制范围(如医生。1只兔子)。
3.6。肝酶
血清ALT的活动、高山和LDH显著增加( )p . multocida来华的组比对照组显著降低( )在治疗组(3、4和5)gp.2相比。总、直接和间接胆红素浓度增加( 在感染的兔子);然而,它表现出显著减少( )治疗组(3、4和5),而感染参与兔子(表3)。
3.7。抗氧化剂/氧化应激标记
组2只兔子显示显著减少血清谷胱甘肽和SOD水平( )和显著增加( )的血清MDA浓度,控制相比,治疗兔子(gps。3、4和5)表现出显著增加( 在谷胱甘肽和SOD含量明显降低( )在MDA浓度,而感染参与兔子(表4)。
3.8。组织病理学研究
正常控制兔子表现出正常的肺组织与正常的肺泡和支气管和细支气管结构perialveolar毛细血管。另一方面,从肺组织部分巴斯德菌来华的兔子显示严重的支气管周炎,拥挤的血管,血管血栓和血管炎。弥漫性间质性炎症反应,肺泡崩溃,组织破坏,和补偿肺气肿也被观察到。另一方面,受感染的兔子,大蒜素处理,显示轻度至中度病变,轻度拥堵和白血球的牙槽间的毛细血管的渗透有轻微肺气肿肺泡和灶性坏死病灶。兔子在感染后接受诺氟沙星轻度增厚的牙槽间的隔膜与炎症细胞和堵塞。此外,集团V兔子(接受组合治疗)显示肺泡之间的轻度水肿和炎症细胞稀疏,没有坏死或组织破坏(图1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
正常的肝组织控制兔子显示嗜酸性辐射中央静脉周围肝索。肝细胞有丰富的细胞质和大集中位于细胞核。相比之下,肝脏部分从兔子,感染巴斯德菌,展示了严重拥堵的肝血管和血管周围水肿,肝细胞弥漫性变性,灶性坏死。受感染的兔子,大蒜素处理,漫空泡的变性和轻度至中度充血的血管。兔子,在感染后收到了诺氟沙星变性的病灶部位有轻度充血的血管。此外,接受联合治疗的感染兔子的部分显示相当正常肝索focal-to-discrete肝细胞遭受轻微空泡变性(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
兔子饲养需要良好的环境条件来降低感染的风险。打喷嚏,流鼻涕,呼吸窘迫,结膜炎是常见的迹象p . multocidaB型感染,在这项研究中观察到。此外,我们发现频繁在肺组织脓肿形成,支气管肺炎、败血症,可能是发病率和死亡率的主要原因在兔子31日,32]。我们的研究结果与之前的研究一致,马蒂诺和西郊鹭鹚[7),Palocz et al。33],Katoch et al。15]。
Allicin-treated兔子表现出更严重的临床症状,死亡率较低,可能与蒜素的抗菌和抗炎活动(34,35]。此外,据报道,蒜素清除自由基和抑制半胱氨酸蛋白酶和thiol-containing蛋白在细菌细胞,抑制其增长(36,37]。同样,受感染的兔子对待诺氟沙星(100毫克/公斤)显示显著降低死亡率和临床症状的严重程度38),可能由于强大的抗菌活性诺氟沙星(39]。有趣的是,有一个明显减少临床症状,死亡率几乎在所有受感染的兔子allicin-norfloxacin组合组相比,要么单独治疗。
兔子,感染p . multocida,表现出macrocytic低贫血(网状细胞过多症),可能由于增强红细胞生成的反应骨髓血液损失的增加trachea-pulmonary出血,引起败血症(40]。我们的结果同意那些由Nassar et al。41)报道,有一个显著减少红细胞计数和PCV %p . multocida来华的兔子。兔子处理蒜素和诺氟沙星显示改善贫血的照片,尤其是Hb水平,反映了细菌减少毒性作用在骨髓减少或停止出血。与heterophilia白细胞像调查显示白细胞增多,单核细胞增多症p . multocida来华的集团可以归因于身体炎症反应(40];白细胞升高是在我们的研究克服感染的第一行身体的防御机制对任何致病原。
感染p . multocida通常与白细胞增多的生理反应从身体减少感染的传播41- - - - - -43]。淋巴细胞减少可能发生在本研究中由于增加了细菌毒素和淋巴细胞产生的细胞溶解引流到受感染的组织(44]。相比之下,兔子处理蒜素单独显示白细胞计数显著升高,反映了蒜素的抗菌和抗毒素的影响(45]。中性粒细胞显示蒜素和/或诺氟沙星治疗后显著增加可能是应对增加的血清il - 6和TNF -的浓度α(46- - - - - -48]。
体内的细胞免疫反应增加生理上,以防感染杀灭感染剂,减少感染的传播(42]。本研究显示显著提高吞噬活动(吞噬百分率和吞噬指数)p . multocida来华的兔子。同意El-Deeb和Elmoslemany49),促炎细胞因子(TNF -的血清水平α和il - 6)是显著升高增强白细胞游走到感染的网站(46- - - - - -48]。据报道,il - 6增加血液感染后炎症反应来调节中性粒细胞和单核细胞在炎症过程中过渡50,51]。
大蒜素治疗显著增加吞噬活动感染兔子,可能由于蒜素的能力调节外周白细胞的免疫功能(52通过刺激免疫细胞的增殖,溶菌酶的活动,和氧化破裂53,54),以及增强促炎介质移行细胞和CD4的扩张+T细胞(55]。此外,大蒜素显著减轻炎症通过降低TNF -的生产α和il - 6 (56- - - - - -58]。蒜素的抗菌和抗炎作用可能是由于调制的细胞因子激活巨噬细胞,控制感染。
血液蛋白不足和hypoglobulinemia被观察到p . multocida来华的兔子,这可能是由于出血期间蛋白质损失。厌食症和感染而导致的发烧导致蛋白质分解代谢和蛋白质合成减少了退化肝细胞(33]。Allicin-treated组显示,血清蛋白和白蛋白水平显著改善,表明肝脏损伤和炎症引起的衰减p . multocida感染(35),出血减少,改善动物的食欲。
Allicin-treated组有海拔球蛋白、免疫球蛋白和血清IgM水平,反映了增加产量的Igs淋巴器官来调理p . multocida细菌和限制系统性感染(59]。据报道,蒜素显著增强免疫应答过程中通过高度感染的搞笑水平(60]。同样,诺氟沙星是一种有效的抗菌剂,能改善蛋白,白蛋白、球蛋白、搞笑的水平感染的兔子。
有关酶活性和肝脏功能、ALT、高山,LDH,胆红素显著海拔巴斯德菌来华的兔子,可能与损伤和肝细胞的变性61年- - - - - -63年]。然而,受感染的兔子,大蒜素治疗和/或诺氟沙星,显示显著降低血清ALT,高山,LDH,和胆红素水平,证实大蒜素的抗菌活性和诺氟沙星,减少细菌对肝脏的危害64年]。
兔子,感染p . multocida显示,显著降低血清谷胱甘肽和SOD与MDA水平的高度,反映脂质过氧化和活性氧的生产增加了细菌感染(49]。我们的研究结果表明,大蒜素治疗,单独或结合诺氟沙星,改善氧化应激和一代的感染兔子用改进的自由基脂质过氧化和海拔的谷胱甘肽和SOD水平通过其抗氧化作用[58,65年,66年]。几个大蒜组件,包括蒜素和硒,已被证明能够减弱活性氧的信号通路和增加内源性抗氧化剂酶活性(67年- - - - - -69年]。大蒜素与诺氟沙星治疗,单独或结合,提高了抗氧化和减少侵染诱导的氧化应激状态。
5。结论
这项研究的结果表明,临床观察损伤兔感染p . multocida大蒜素可以改善管理,可能通过其抗氧化,抗炎、免疫刺激剂作用。这种保护作用可以减少抗生素的使用在宠物和牲畜,减少人体接触抗生素残留和细菌对抗生素的耐药性。此外,诺氟沙星可用于有效治疗出血性败血病的兔子。蒜素和诺氟沙星在改善更强大p . multocida全身的变化比每个单独治疗。
缩写
| 高山: | 碱性磷酸酶 |
| ALT: | 丙氨酸转移酶 |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽 |
| Hb: | 血红蛋白 |
| IL: | 白介素 |
| : | 鼻内 |
| LDH: | 乳酸脱氢酶 |
| MCHC: | 意思是小体血红蛋白浓度 |
| 公司: | 意思是小体体积 |
| MDA: | 丙二醛 |
| PCV: | 包装细胞体积 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| 肿瘤坏死因子: | 肿瘤坏死因子。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。