文摘
目的。调查的保护作用,儿茶素(EGCG),绿茶提取物,其潜在的机制在膀胱功能障碍大鼠模型,膀胱出口梗阻(BOO)。材料和方法。Sprague-Dawley BOO手术引起,其次是治疗的老鼠与EGCG(5毫克/公斤/天)或通过腹腔内注射生理盐水(控制)。Cystometry在术后4周进行有意识的老鼠。他走时,马森三色的,TUNEL染色进行观察组织改变。氧化应激标志物测定和蛋白表达Nrf2-ARE通路被免疫组织化学和免疫印迹检测。结果。我们的数据表明,EGCG可能增加膀胱排尿高峰压力和遵从性和延长排尿间隔BOO老鼠相比,控制并最终减少尿的频率。EGCG可以改善胶原纤维的增加,活性氧引起的梗阻,增加SOD的活性,氧化酶,猫。细胞凋亡水平是减少BOO老鼠EGCG处理与控制相比,和caspase-3表达减少。此外,EGCG可以激活Nrf2表达抗氧化蛋白高度的目标。结论。EGCG减轻BOO-induced膀胱功能障碍通过抑制氧化应激和激活Nrf2-ARE蛋白表达的途径。
1。介绍
良性前列腺增生(BPH)逐渐表现为良性的前列腺肿大(1,2)是一种很常见的慢性疾病的老年人。随着人们年龄的增长,大多数良性前列腺增生病人会诱发膀胱出口梗阻(BOO)膀胱高压力和低流量(3]。BOO是一种常见的尿路障碍可能影响生活质量和是一个很少危及生命的疾病,但可以诱发膀胱的重要结构和功能改变,从而带来下尿路症状(附近地区)包括尿频、尿急、夜尿症、急迫性尿失禁(4]。BOO良性前列腺增生引起的随着年龄的增长变得越来越普遍被认为是主要的公共卫生问题,严重影响患者的生活质量和他们的合作伙伴。
先前的研究表明,氧化应激的机制被认为是一个触发连锁反应参与的开发和发展良性前列腺增生,导致膀胱功能损伤(5]。氧化应激发生时在细胞环境中有一个不平衡的产生活性氧(ROS)和生物系统修复氧化损伤的能力或中和活性中间体的影响包括过氧化物和自由基。生产高浓度的活性氧导致显著降低抗氧化防御机制导致蛋白质、脂质、DNA损伤和随后的破坏细胞功能和细胞死亡,但下级胞内信号通路产生微妙的变化。活性氧的增加可能导致改变老化的膀胱功能(6]。超氧化物歧化酶(SOD)的首席防御激活细胞的氧自由基。在几乎所有需氧细胞过氧化物酶体,过氧化氢酶(CAT)行为与SOD保护细胞免受自由基损伤(7,8]。SOD和CAT的活动与膀胱的从补偿转向失代偿性的功能(7]。作为转录因子、核erythroid-related因子2 (Nrf2)可以通过抗氧化反应促进抗氧化基因的表达元素()来调节细胞抗氧化反应和氧化还原状态(9]。它已经建立在文献中Nrf2-ARE通路的激活可能改善膀胱功能障碍引起的膀胱出口梗阻(10]。
绿茶作为一个主要组成部分,epigallocatechin-3-gallate (EGCG)一直在研究其抗氧化和抗炎作用。报告显示,与EGCG预处理可以诱导Nrf2激活细胞中演示了通过增加表达式和核易位Nrf2 [11,12]。机械拉伸和缺氧已报告作出贡献嘘后膀胱功能和结构变化,和以前的研究已经表明,Nrf2通路的激活EGCG显示有效的保护在各种疾病。然而,EGCG能否保护膀胱组织通过激活Nrf2通路BOO模式还没有被很好地定义的。基于我们之前的研究(10],减少氧化应激和Nrf2-ARE通路的激活可能改善膀胱功能障碍引起的嘘,我们探讨了EGCG改善膀胱功能障碍的能力通过抑制氧化应激通过Nrf2-ARE通路的调节BOO在当下研究的大鼠模型。
2。材料和方法
2.1。BOO模型和药物治疗
BOO SD模型成立于成年男性Sprague-Dawley老鼠(SD)重240 - 260克(动物中心上海第九人民医院的上海交通大学医学院,上海,中国)根据我们以前的方法(10]。所有的动物每笼在一个房间里住了两个控制温度、湿度、和12小时光/ 12小时黑暗周期与免费的食物和水。老鼠被允许适应前至少5天的实验。所有实验程序经伦理委员会批准的上海交通大学医学院。SD大鼠随机分为三组:sham-operated集团BOO集团和BOO对待EGCG(纯度> 98%,生物技术有限公司,中国),和8个老鼠包含在每组。BOO手术应用根据先前详细描述的方法(13]。简单地说,老鼠被麻醉,然后腹部中线切口(约1.0厘米),使膀胱和尿道近端。近端尿道是松散和针使用3 - 0丝线19克针后被周围的针后删除并关闭切口。虚假的操作以相同的方式进行而不把丝线。
从术后第一天,老鼠的BOO + EGCG组每日腹腔内注射EGCG(5毫克/公斤)。EGCG是溶解在PBS,老鼠的虚假的组和BOO组被给予相同体积的PBS。
2.2。Cystometry和Cystometric分析做准备
cystometry准备和cystometric分析进行4周后操作。导管放置在所有团体前三天的老鼠的膀胱cystometric分析。在以前的研究中,所述扩口的聚乙烯管50 (PE-50)成为一个气球作为一个锚维持膀胱内的管(7,11]。1厘米的切口是在麻醉大鼠的肩胛骨之间的背其次是开发一个平面之间的皮肤和底层肌肉来创建一个隧道在腹侧腹部。Cystometry制备之后,进行大鼠麻醉和一个1厘米切口肩胛骨之间的背。然后,我们开发了一个平面之间的皮肤和底层肌肉来创建一个隧道在腹侧腹部。后腹部中线切口暴露膀胱,我们抓住的顺利结束PE-50油管夹和拉通过背部切口。球状的结束后被放置在周围的钱包字符串缝合膀胱圆顶和油管被拉紧,背部和腹部切口因cystometric分析。
cystometry,有意识的老鼠被置于代谢笼,留置管是连接到一个两通阀连接到一个压力传感器和一个输液泵。生理盐水注入到膀胱12毫升/小时的速度在室温下在所有组。cystometric参数最大压力、膀胱容量、和其他测量。实验后的老鼠安乐死,膀胱组织收集深造。
2.3。组织学检查和免疫组织化学染色
5μ米部分是由膀胱后被固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡。苏木精和伊红())染色进行观察膀胱的一般形态,马森和三色的染色是用来评估组织纤维化的程度。免疫组织化学染色在我们的研究也进行了如前所述。简单,部分受到10毫米柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)为抗原热检索。的主要抗体anti-Nrf2 (Abcam,剑桥,英国),HO-1 (Abcam,剑桥,英国),细胞核抗原(CST,丹弗斯、马、美国),二次抗体goat-anti-rabbit IgG-HRP (DAKO、丹麦),goat-anti-mouse IgG-HRP (DAKO、丹麦),和民建联检测工具(DAKO、丹麦)根据制造商的指示使用。组织学分析是由一个病理学家蒙蔽的方式。
2.4。通过TUNEL细胞凋亡检测
膀胱平滑肌细胞凋亡水平是衡量一步TUNEL细胞凋亡测定工具包(南京凯基生物生物技术,中国)根据制造商的指示。总之,经常水化和沉浸在1%的部分Triton x - 100紧随其后与蛋白酶K孵化解决方案30分钟。与TdT)解决方案和部分反应1小时30分钟然后streptavidin-TRITC解决方案在一个湿、黑室,分别。最后,用检测工具被用来染色的部分观察和分析凋亡细胞病理学家蒙蔽的方式。
2.5。MDA、氧化酶、总SOD (tSOD), ROS,猫的决心
根据我们之前的研究10),我们选择一些常规实验室指标的氧化应激标志丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶),总超氧化物歧化酶(tSOD)和过氧化氢酶活性(CAT)进行。MDA的含量、氧化酶、总tSOD,猫和膀胱组织中测量根据制造商的协议分析工具的MDA, tSOD,氧化酶,猫(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。短暂,最大吸光度在532 nm基于硫代巴比土酸(选项卡)方法检测MDA水平,tSOD活动测量的基础上,结合黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶和吸光度是阅读在550 nm,氧化酶活力和分析了使用酶催化反应产物(减少谷胱甘肽)和吸光度被记录在412海里。测量猫活动,过氧化氢与钼酸铵反应,和405海里的吸光度检测。考虑积累活性氧(ROS)发生并导致功能改变和病理条件下,如膀胱功能障碍随着年龄的发展(6,14,15];ROS也在我们的研究中发现。根据ROS的过程分析工具(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国),DCFDA被清洗使用后用作荧光探针分析缓冲区。后立即激发波长485 nm,读取吸光度在535海里。
2.6。西方墨点法
总蛋白提取自冻结膀胱组织选择随机从每组( )通过台盼蓝里帕缓冲含有蛋白酶抑制剂。肌肉溶解产物是离心机在4°C 10000×g /分钟10分钟,和上层清液收集作为总蛋白提取。核蛋白质提取根据制造商的指示核蛋白质提取工具包(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)。下面的步骤后,膀胱组织切成块,均质在细胞质蛋白质提取试剂含有蛋白酶抑制剂、溶菌产物是离心机(10000×g /分钟)在4°C 5分钟,然后沉淀收集与核蛋白质提取试剂混合冰30分钟;溶菌产物离心后(10000×g /分钟)在4°C 10分钟,上层的收集,用作核蛋白质提取物。蛋白质浓度测定用BCA分析工具包(美国马热科学)。样本运行在10% SDS-polyacrylamide凝胶(20μg / lane),然后,蛋白质被转移到PVDF膜electroblotting(200毫安)。PVDF膜被孵化5% BSA在室温下2小时,三洗5分钟TBST紧随其后。PVDF膜被孵化一夜之间在4°C anti-Nrf2 (1: 1000), HO-1 (1: 1000), NQO1 (1: 1000), Caspase-3 (CST,丹弗斯、马、美国)(1:1000),GAPDH (CST,丹弗斯、马、美国)(1:2000),和Lamin-B (CST,丹弗斯、马、美国)(1:2000)抗体。GAPDH和Lamin-B被用作内部标准化者。然后,膜洗了10分钟三次TBST和孵化IgG-HRP抗体(1:2000)2小时,最后由化学发光检测。
2.7。统计分析
被当作平均数±标准差的值。SPSS 17.0被用于评估的区别。使用单向方差分析与组织之间的差异进行了分析 被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。EGCG改善排尿功能障碍引起的嘘声
每组cystometry结果显示在表1得到据尿动态曲线(图1)。阻塞的排泄压力显著增加大鼠与虚假的老鼠。排泄压力峰值与EGCG阻塞大鼠治疗高于阻塞大鼠在四周的时间点。膀胱容量明显高于BOO老鼠而虚假的老鼠。BOO + EGCG组的老鼠显示膀胱的容量在所有组最高。膀胱合规嘘后在四周时间点明显减少。EGCG可能通过增加膀胱容量救援合规恶化。发现排尿的时间间隔短于BOO比虚假的老鼠,老鼠和排尿间隔BOO + EGCG老鼠BOO老鼠相比明显增加。
(一)
(b)
(c)
3.2。作用EGCG BOO大鼠膀胱逼尿肌的组织学变化
作为显示在图2(一个)EGCG有保护作用,BOO膀胱基于圆)染色。BOO造成明显的组织学变化,如逼尿肌平滑肌的结构性破坏而治疗EGCG显著缓解这些老鼠BOO膀胱的组织学改变。胶原纤维的面积比是10.77±2.39,32.53±4.15,23.41±3.53虚假的组,嘘,嘘+ EGCG组,分别为(图2 (c))。EGCG在BOO + EGCG组抑制胶原纤维的价格相比BOO组(图2 (b))。
(一)
(b)
(c)
3.3。EGCG的氧化应激的膀胱BOO老鼠
评估氧化应激水平,我们测量的内容MDA, SOD,氧化酶,猫的活动,和活性氧。作为显示在图3(一个)在膀胱,MDA的含量显著增加与虚假的老鼠相比,BOO老鼠(2.81±0.58和1.52±0.33)。与BOO老鼠相比,EGCG治疗显著地抑制MDA水平增加引起BOO(1.81±0.37和2.81±0.58)。tSOD和氧化酶的活动有内容的减少与虚假的老鼠相比,BOO老鼠(89.65±10.70和108.06±11.88;分别为174.71±11.68和218.18±12.44)。然而,EGCG治疗可以显著提高tSOD和氧化酶活动BOO老鼠(数字3 (b)和3 (c))。而虚假的老鼠,猫活动显著减少BOO集团( ),由EGCG调节,甚至比虚假的组(图3 (d))。与猫相比,ROS增加BOO组与虚假的集团相比,EGCG下降显著( )(图3 (e))。
(一)
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(d)
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3.4。EGCG抑制细胞凋亡,促使扩散BOO膀胱的老鼠
TUNEL染色进行探索EGCG对细胞凋亡的影响BOO膀胱的老鼠。凋亡细胞的数量的膀胱BOO老鼠与虚假的老鼠相比明显增加( ),而EGCG治疗显著减少凋亡细胞的数量的膀胱BOO老鼠( )(数据4(一)和4 (b))。免疫印迹显示caspase-3表达显著增加的膀胱BOO老鼠;然而,caspase-3的表达减少BOO + EGCG老鼠(图4 (c)),是按照TUNEL染色的结果。此外,PCNA的表达的免疫组织化学染色显示,EGCG导致显著增加细胞增殖与BOO BOO + EGCG组相比(图组4 (d))。
(一)
(b)
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3.5。EGCG Nrf2-ARE通路的蛋白表达的影响
考虑到Nrf2在调节细胞抗氧化反应是一个重要的中介,我们探讨了EGCG对Nrf2和其下游目标蛋白质的影响在我们的研究中。Nrf2用免疫组织化学染色的表达明显高于在膀胱的肌肉层布+ EGCG组相比,BOO组(图5(一个))。Nrf2的表达在细胞(t-Nrf2)和核(n-Nrf2)也是以西方墨点法。这是如图5 (b)和5 (c)Nrf2表达式(t-Nrf2和n-Nrf2)显著增加的膀胱BOO + EGCG组相比,BOO组,和t-Nrf2增加膀胱的BOO组与虚假的组。值得一提的是,我们的研究结果表明Nrf2的表达主要位于膀胱细胞的细胞核,细胞核Nrf2显示的表达无显著区别BOO组和虚假的。然后我们发现Nrf2下游目标蛋白的表达和HO-1 NOQ1调查它的抗氧化功能。我们的数据表明,HO-1的表达增加与BOO BOO + EGCG组相比,这是符合n-Nrf2表达式(数据的结果5 (d)和5 (e))。水平NQO1 BOO组高于虚假的组,但低于BOO + EGCG组(图5 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
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(f)
4所示。讨论
作为动物模型研究,慢性膀胱缺血可能产生氧化导致去神经的膀胱和膀胱壁tissue-damaging分子的表达,这可能是负责膀胱过度活跃的发展进步膀胱缺乏活动(16,17]。它也表明氧化应激中起着至关重要的作用在膀胱出口obstruction-mediated膀胱功能障碍[16,17]。BOO-induced膀胱重建在老鼠模型中类似于良性前列腺增生患者患有膀胱出口梗阻。在我们先前的研究显示,老鼠BOO模式是有用的模型来探讨结构和功能改变在膀胱10]。因此,探索好的方法来减少氧化应激引起的膀胱BOO已经相当有吸引力。
EGCG是一个主要在绿茶儿茶素的抗氧化功能,抗增殖、抗炎,和衰减代谢综合症,没有副作用(18,19]。谢长廷等人。报道,EGCG可以减弱在良性前列腺增生大鼠前列腺肿大伴有代谢综合征引起的高脂肪饮食结合注射睾酮(10]。人类,根据文献报道,十天的重复政府的口服剂量的EGCG 800毫克每天被发现是安全的和非常良好的耐受性。绿茶的EGCG含量约为10%。没有明显的副作用发生在每天20杯绿茶的数量(20.]。在目前的研究中,我们调查了EGCG对体内BOO-induced膀胱功能障碍的影响和每日腹腔内注射剂量(5毫克/公斤EGCG)是使用类似于剂量已经被证明是有效的在其他的研究(10,21]。
我们进行有意识的老鼠尿动态研究BOO准确地反映实际情况。cystometric参数如膀胱容量、最大压力、合规、排尿时间间隔测量;我们发现排尿间隔、容量和遵从性显著增加,排尿高峰压力与EGCG在某种程度上增加治疗的老鼠发出嘘声。组织学染色显示膀胱平滑肌束受损严重,胶原沉积增加BOO老鼠。胶原纤维沉积增加抑制了EGCG在嘘模型大鼠治疗4周。我们的结果表明,有一个逆膀胱合规和胶原纤维之间的关系,并从BOO-induced EGCG能够保护膀胱功能障碍和形态学损伤。
为了研究抗氧化活性膀胱的EGCG BOO老鼠,我们测量的膀胱组织三组MDA水平。MDA水平作为指标的脂质过氧化作用,细胞膜的脂质被摧毁MDA生成的数量与组织破坏的程度成正比。我们的研究结果表明,BOO膀胱的MDA水平显著提高。这是我们的研究结果还显示,MDA水平的增加显著降低在嘘老鼠与其他抗氧化剂(EGCG相对应处理9]。我们发现一些氧化还原状态的活动标记,如氧化酶和总SOD,降低BOO组与虚假的组中类似于预测结果与其他文献[10],EGCG显著增强这些标记BOO老鼠的活动。我们的数据还显示,EGCG可能上调猫活动和表达下调ROS BOO而引起的虚假的组。值得一提的是,猫活动增加的膀胱组织嘘后大鼠4周是类似于我们之前的研究22],虽然不是所有匹配的其他报告,猫活动增加后2 - 4周的阻碍,但它与呼吸困难明显降低兔膀胱8周后部分膀胱出口梗阻(PBOO) [7),这需要我们进一步探索。所有的结果可能表明EGCG可以减轻氧化应激增加抗氧化酵素的活动在嘘老鼠。
众所周知,细胞凋亡起着至关重要的作用在导致膀胱功能障碍BOO模式。在我们的研究中,TUNEL染色结果显示,显著减少凋亡细胞的数量被发现在治疗EGCG BOO老鼠;也发现膀胱中的表达caspase-3减少BOO老鼠当EGCG对待。这些结果表明,儿茶素作为抗氧化剂可能防止膀胱BOO-induced通过减少细胞凋亡caspase-3的表达。与此同时,EGCG对细胞增殖的影响,PCNA染色也测量。结果表明,细胞增殖水平明显高于BOO老鼠EGCG膀胱的治疗。
EGCG近日报道可以产生一种保护作用与阻塞性肾病大鼠通过激活Nrf2信号通路。H2O2暴露hMSCs显示水平显著增加蛋白质的细胞衰老acetyl-p53和acetyl-p21相比,控制hMSCs由与EGCG预处理预防21,23]。相比之下,在Nrf2-knockdown hMSCs, EGCG失去了它的抗氧化作用,表现出高水平的acetyl-p53和acetyl-p21 EGCG预处理和H2O2曝光。这表明Nrf2可能参与的antisenescent作用EGCG在hMSCs [10]。综上所述,这些研究结果提出的重要作用EGCG在防止氧化应激通过Nrf2激活细胞衰老和细胞凋亡。抗氧化剂可以改善膀胱功能障碍BOO老鼠根据我们之前的研究10];嘘的EGCG对改善膀胱功能障碍的影响模型和改变Nrf2-ARE信号通路在本研究调查。通过免疫组织化学染色和免疫印迹,我们发现Nrf2蛋白质的表达的膀胱BOO老鼠EGCG治疗BOO老鼠相比显著增加。此外,Nrf2水平细胞核明显增加BOO老鼠当EGCG对待。结果表明,EGCG可能促进Nrf2运输成核和目标抗氧化基因的转录。我们的表达水平来衡量HO-1 NQO1、Nrf2-ARE通路的下游基因免疫印迹。HO-1和NQO1 BOO EGCG治疗后大鼠显著增加。最重要的是,我们的研究表明,EGCG可以促进Nrf2易位到细胞核和目标抗氧化基因的表达,从而改善氧化应激在嘘老鼠。
总之,我们的研究表明,EGCG对氧化应激具有显著的保护作用,可以改善膀胱功能障碍可能是Nrf2-ARE通路的激活和抑制细胞凋亡的膀胱BOO老鼠。
缩写
| 是: | 抗氧化反应的元素 |
| 嘘: | 膀胱出口梗阻 |
| 良性前列腺增生: | 良性前列腺增生 |
| 氧化酶: | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| 猫: | 过氧化氢酶活性 |
| ): | 苏木精和伊红 |
| HO-1: | 血红素oxygenase-1 |
| 附近地区: | 下尿路症状 |
| MDA: | 丙二醛 |
| NQO1: | NAD (P) H:醌氧化还原酶1 |
| Nrf2: | 核erythroid-related因子2 |
| PE-50: | 聚乙烯管材50 |
| ROS: | 活性氧 |
| EGCG: | Epigallocatechin-3-gallate |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| TUNEL: | TdT-mediated dUTP尼克结束标签。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
孟古,庄刘本研究同样起到了推波助澜的作用。
确认
这项研究是由上海市科学技术委员会的程序(15 dz1941502和15 dz1941503),上海浦东新区卫生和计划生育项目(没有。PW2013D-3),关键学科集团建设工程浦东上海卫生局(PWZxq2014-11)和项目优秀医疗学术领袖和专业建设项目上海浦东卫生和计划生育委员会(没有。PWZz2013-16)。