文摘
线粒体功能受损和DNA损伤的积累被认为是与年龄相关的疾病的标志。线粒体功能障碍发起保护信号机制协调核水平特别是通过调节转录的压力信号的因素。反过来,细胞DNA损伤反应包括一系列相互关联的复杂的保护途径,需要的能量和代谢支持线粒体。这些都是参与细胞内和细胞外信号的损失。在这里,我们已经发起了一项研究,地址mitochondria-nucleus沟通如何发生在线粒体功能障碍和基因毒性压力和条件的后果是什么这相互作用在细胞系统。在这项工作中,我们使用细胞缺乏PINK1,线粒体激酶参与线粒体质量控制的损失函数会导致线粒体功能失调的积累,挑战与诱导的DNA损伤,即电离辐射和radiomimetic博来霉素。复合应力水平的线粒体和核损害线粒体和核函数。我们的研究结果揭示了情感在PINK1-deficient细胞基因毒性压力。相同的细胞显示受损感应旁观者现象后压力的侮辱。然而,这些细胞反应自适应当一个挑战随后剂量应用低剂量治疗的细胞。 The data demonstrates that PINK1 modulates intracellular and intercellular signalling pathways, particularly adaptive responses and transmission of bystander signalling, two facets of the cell-protective mechanisms against detrimental agents.
1。介绍
细胞中线粒体有重要的功能,包括ATP生成iron-sulfur集群生物起源,核苷酸生物合成,代谢,钙稳态和细胞死亡的监管。在神经元中,线粒体膜离子梯度的维护至关重要,神经传递,突触可塑性。大多数神经元ATP生成通过线粒体氧化磷酸化,糖酵解产生的只有10%。神经功能需要线粒体活动严格监管和体内平衡。线粒体生物起源是由原子核和大多数线粒体蛋白质是由核基因编码,线粒体和细胞核之间的通信网络的发展,包括信号级联、蛋白质与双定位两个隔间,线粒体和遥感产品由核蛋白质(1]。这些使organellar相声,促进了细胞与环境之间的集成信号来调整其功能对维持细胞内稳态细胞生活中特别是在功能检查点。
线粒体功能障碍一般指一个扩展覆盖展开蛋白质的积累过多的缺陷线粒体基质和条件,如基因毒性损害OXPHOS活动压力和化学压力。线粒体通过分子和压力应对内生和外生因素organellar线粒体质量控制(mtQC)线粒体的形式展开的蛋白质反应(mtUPR),聚变和裂变过程,mitophagy。mtUPR是转录响应由线粒体功能障碍和涉及到mitochondria-nucleus沟通和仍在多层次的监管包括转录和染色质重塑(2,3]。Organellar线粒体质量控制,也称为mitophagy,一直得到广泛的研究在过去的十年。当前流行的模型提出PINK1帕金构成主要的传感系统和调节线粒体功能失调。因此,在“基本条件”下健康的线粒体,磷酸酶和tensin同族体——(PTEN)诱导激酶激酶1 (PINK1)是完全导入到线粒体基质,它是由蛋白质水解迅速退化(4,5]。在线粒体应激条件和线粒体膜电位的损失,PINK1积累在线粒体外膜完整形式(石),其细胞质面临的激酶结构域。这种形式,参与mitophagy的过程,这其中牵扯到一系列相应的生化过程涉及E3-ligase帕金。因此,PINK1磷酸化帕金石,反过来帕金ubiquitinates PINK1和其他线粒体蛋白质出现在石准备接受溶酶体降解[受损的线粒体6- - - - - -8]。
丧失突变PINK1和帕金导致早发性帕金森病(PD)的9]。各种细胞参数和生化途径分析了关于PINK1作用线粒体内稳态。除了在mitophagy良好的作用,激酶参与了其他几个mitochondrial-related通路包括ATP生产,钙稳态,和细胞凋亡10]。最近的研究发现了额外PINK1除了线粒体功能的维护功能。因此,线粒体功能受损由PINK1或帕金损失函数表示的内质网(ER), mitochondria-ER信号增强神经退化(11]。此外,PINK1也参与老化(12)和可能致癌的潜在健康的线粒体的保护(通过癌细胞)(13]。因此,破译PINK1函数的过多会进展的理解线粒体的作用在衰老和衰老相关疾病等复杂现象。
随着线粒体、核DNA完整性有着至关重要的作用在决定细胞命运的挑战与内生的整个生命周期的威胁(ROS, DNA复制错误)以及外源压力由物理和化学药剂。为了应对压力诱导的DNA损伤的侮辱,哺乳动物细胞激活一个复杂的细胞防御系统,DNA损伤反应(DDR)旨在检测DNA损伤,并触发信号转导途径,导致DNA修复、细胞周期延迟,细胞凋亡、衰老(14,15]。未修理的DNA损伤可能导致细胞死亡或基因组不稳定性的主要来源(15- - - - - -17]。
众多研究表明,接触生物系统的底层物理或化学应力传递单剂量或累积剂量(启动治疗)诱发的变化能够准备应对后续的生物系统强调因素(挑战治疗)的方式会导致损伤的积累水平低于水平挑战单独治疗诱导的损害(了18])。这诱导抗压力刺激一般的防御机制被称为适应性反应(AR)。适应性反应可能被视为一种特殊的激效,有益的反应。毒物兴奋效应是适应性反应剂量后的第一反应,然后一些刺激的影响导致适应性反应随后高剂量压力挑战。基于“增大化现实”技术曾被观察到在不同的端点包括细胞生存,基因突变,染色体畸变和微核感应,肿瘤转变在体外和DNA单-和双链断裂。
除了这些细胞内信号,受损的细胞胞间信号发送给他们的邻居。信号可以通过缝隙连接细胞直接接触或通过释放的可溶性因子在细胞外的媒体。信使分子包括ROS、一氧化氮、细胞因子以及DNA和RNA分子。这些参与细胞直接治疗细胞产生的响应信号通过信号的过程,被称为旁观者效应(是)19- - - - - -23]。演示的端点地址survival-cell相似的DNA损伤和细胞死亡的基于“增大化现实”技术,最初被认为是有害的二次辐射的影响,考虑到他们的DNA损伤表现为增加,染色体畸变,增加细胞凋亡在邻近未暴露的细胞可以累积诱导细胞死亡或肿瘤发生[22- - - - - -26]。然而,这一观点已被证明是挑战可能代表一个有益的,自适应现象(26]。线粒体与不属预定目标的影响引起的基因毒性代理,包括适应性反应,毒物兴奋效应,旁观者效应,和基因组不稳定性27- - - - - -29日]。
线粒体功能异常、遗传损伤的积累和摄动衰老的细胞间通讯是公认的标志(30.,31日),也与神经退行性疾病密切相关,癌症,心血管疾病(32- - - - - -35]。分析分子细胞之间的相互作用与内部和外部的环境变化将允许的理解机制的改善老化的标志。
很少研究解决PINK1贡献mitochondria-nucleus沟通。phosphoproteomic最近的一项研究显示,43%的核蛋白质的磷酸化(转录因子参与DNA和RNA和蛋白质代谢)是由PINK1调制(36]。基底PINK1水平很低,由于其高流动率。因此,这样的一个显著改变核蛋白质由激酶的激酶缺乏症表明更广泛的作用。因此,我们相信PINK1参与mitochondria-nucleus信号值得更高的考虑。其他领域仍有待研究关注的角色PINK1在细胞内和细胞间信号后细胞DNA的压力。
这里,我们已经进行的研究中,我们使用一个组合的线粒体功能障碍包括PINK1损失函数和诱导的DNA损伤radiomimetic博来霉素或x射线辐照。使用这个模型,我们一起解决线粒体和细胞核如何运作整合细胞和氧化应激信号维护细胞内稳态。在这项研究中,我们已经确定了关键特性mitochondria-nucleus通信在细胞内和细胞间信号强调他们的扰动可能会导致过早衰老和神经退行性疾病。
2。结果
为了解决mitochondria-nucleus沟通在维持细胞内稳态应力状态,我们使用了一个模型,结合线粒体和基因毒性压力。我们采用细胞线粒体功能障碍模型包括PINK1损失函数,即来自小鼠基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(mef) (KO)PINK1基因(37)和神经母细胞瘤多巴胺能细胞行SH-SY5Y PINK1表达式的位置被撞倒了(KD) RNA干扰(38连同他们的野生型(WT)和紧急控制(SC)线。我们首次确认细胞系的基因型并随之减少约50%的基底ATP水平相关PINK1损失函数(补充图S1)。我们有这些已知模式相结合的线粒体功能异常与诱导基因毒性应激使用化学radiomimetic博来霉素(BLM)或x射线照射治疗。不会治疗的选择是考虑到整个一生,人体暴露在DNA损伤因素(电离辐射,化疗药物)在低水平通过环境因素(自然辐射对地球表面,工业放射性物质)和更高水平的医疗风险诊断和/或治疗(39]。
这是两种类型的基因毒性暴露的情况我们已经使用,化学radiomimetic和x射线辐照。因此,我们进行了研究低/中剂量的治疗不诱导高水平的细胞死亡。此外,这种适应模式使我们能够揭示新的核和线粒体的沟通机制,允许细胞应对环境压力信号。
2.1。PINK1损失函数提高细胞对DNA损伤的敏感性
首先,我们如何解决线粒体导致DNA损伤条件下DNA完整性的维护。频率的微核(MN)归纳和评估DNA双链断裂的发生γH2AX / 53 bp1疫源地端点描述基因毒性效应的程度后,直接用BLM和x射线治疗(补充数据S2和S3和图1(一))。
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直接BLM治疗诱导剂量依赖性增加MN在MEF细胞频率。这一增长发生在更高水平PINK1-KO细胞(图1 (b))。神经母细胞瘤相似的结果,但在这种情况下,表型之间的差异不是很明显(图1 (c))。神经元SH-SY5Y细胞系表现出更高的抵抗治疗与mef相比。细胞系之间的差异可能是由的代谢特征作为tumoral SH-SY5Y细胞系(40]。DNA双链断裂评估水平γH2AX / 53 bp1焦点之后所呈现的模式MN积累接触radiomimetic代理后,BLM(数字1 (d)和1 (e))。焦点的数量在两种类型的细胞与PINK1-deficient线粒体与正常细胞相比。这些差异振幅较低而MN感应端点。因此,线粒体活动牵涉到的数据调制在细胞易受PINK1基因毒性诱发的应激radiomimetic代理,BLM。
从获得的数据处理的细胞有不同的基因毒性剂、x射线辐照(图2),强化了BLM的治疗结果。因此,锰的频率和数量γH2AX / 53 bp1疫源地,随着辐照剂量的增加在所有的细胞类型。然而,MN收益率的差异诱导突变表型与正常细胞相比,在两种类型的细胞照射后更明显较BLM治疗(数字2(一个)和2 (b))。MEF细胞再次被证明是比SH-SY5Y细胞对放射线敏感的。分析归纳的γH2AX / 53 bp1疫源地x射线辐照(数字2 (c)和2 (d))支持提供的结论MN测试。所有的影响引起的辐照引起的低振幅比BLM治疗。
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总的来说,这些结果表明,线粒体活动调制PINK1参与维护核DNA的完整性。
2.2。额外的措施引起的DNA损伤的敏感性PINK1损失函数
除了DNA损伤积累的措施,我们有调查其他细胞的行为参数后基因毒性压力应对线粒体调制的作用在维持细胞内稳态PINK1 BLM引起的DNA损伤反应。我们评估的影响radiomimetic代理只使用在我们的研究中使用的最高浓度(40μg / mL)可行性,诱导细胞凋亡,活性氧积累,在正常和突变mef和ATP水平。
博来霉素治疗诱导细胞的生存能力下降以核形态的变化和MTS试验,丧失生存能力是高PINK1-deficient细胞(数字3(一个)和3 (b))。细胞凋亡诱导(图的分析3 (c))是由测量半胱天冬酶水平的3/7。半胱天冬酶水平的3/7是增强(有统计学意义)和博来霉素治疗后在两种类型的细胞;然而,之间没有差异激活WT和PINK1-KO细胞。BLM诱发氧化应激的海拔(图3 (d)在PINK1-deficient细胞),这种效果更加明显。这个结果证实了线粒体的参与质量控制细胞应激诱导的基因毒性。
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线粒体功能的测量评估变化在线粒体ATP水平和潜力(数字3 (e)和3 (f))似乎没有影响到BLM治疗虽然基底ATP含量和线粒体可能都是减少PINK1-KO mef相比WT。这减少ATP生产活动(图与下呼吸道3 (g))。我们已经调查了线粒体呼吸活动和高分辨率的呼吸运动计量法使用特定基质复杂我(苹果酸和谷氨酸)和复杂II-linked(琥珀酸)在digitonin-permeabilized细胞呼吸结合特定的呼吸抑制剂。OXPHOS呼吸状态的测量能力确定氧化磷酸化的ADP而解偶联电子传递系统(ETS)的探测能力与CCCP滴定实现。有趣的是,PINK1损失减少了呼吸活动在随后所有呼吸参数,即耦合复杂I和II的呼吸(OXPHOS),总非耦合呼吸,ETS产能过剩。ETS产能过剩是可用的驱动过程除了磷酸化与ATP生产竞争。这表明减少了PINK1-KO成纤维细胞的能力完全使用线粒体的代谢需要。
在SH-SY5Y,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性的变化和在MEF细胞ATP显示相同的模式。由于细胞治疗的敏感性降低,振幅的变化是减少而mef和其他参数,如可行性和ROS似乎没有明显(补充图修改S4)。
数据显示到目前为止加剧了感性基因毒性压力PINK1-deficient透露的哺乳动物细胞DNA损伤的显著提高与增强活性氧的积累。PINK1-KO细胞ATP水平较低和呼吸活动表明,PINK1损失函数不支持DNA损伤后的修复过程需要导致增加敏感性基因毒性治疗。
我们有另外调查标记的细胞应激实验条件的变化。由于低/中水平的基因毒性的侮辱,BLM没有诱导高水平的线粒体应激反应的改变,胞质压力,或ER应激(补充图S5)。此外,高可变性之间实验对这些标记上下文低级基因毒性的压力。然而,观察DNA损伤和修复的因素,我们已经观察到的变化反映了线粒体功能障碍引起的损伤和基因毒性压力(图4)。因此,在转录水平没有变化nonphosphorylated H2AX(图4(一))。然而,高水平的磷酸化活性形式(gamma-H2AX)蛋白质的存在,如图1 (d)。值得注意的是,PARP1 PINK1-KO细胞增强反射增强这些细胞需要处理恒定应力情况由PINK1损失函数(图4 (b))[41,42]。类似的模式提出了CCAAT增强蛋白β(CEBPB) bZIP转录因子与细胞应激反应(43)(图4 (d))。有趣的是,这两个因素不修改BLM在转录水平。一个特定压力因素似乎是修改PINK1损失函数和DNA损伤DNA damage-inducible成绩单4 (DDIT4)(图4 (c))。DDIT4调节细胞生长、增殖和生存通过哺乳动物雷帕霉素靶复杂1 (mTORC1)。最重要的是,DDIT4已被证明改变其水平以应对压力和增强在大脑和与年龄相关的神经退行性疾病如帕金森症(44,45]。
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2.3。PINK1损失函数有助于诱导适应性反应
low-dose-induced适应性反应的基因毒性代理代表一个独特的DNA和细胞代谢之间的通信路径。在这里,我们已经测试了PINK1损失函数是否可以诱发细胞的改变,使细胞更容易应对DNA损伤引起BLM以自适应的方式。
WT KO mef, 4μg / mL BLM作为启动剂量和40μg / mL BLM作为一个具有挑战性的剂量,治疗(图24小时间隔5(一个))。MN频率检测观察低剂量的BLM引发的适应性反应。MN率显著增加了挑战性的治疗剂量WT和PINK1-KO细胞高振幅PINK1-KO mef和预期结果后提出。然而,启动BLM治疗剂量减毒的MN频率挑战性的额外治疗剂量后PINK1-KO mef但不是在WT mef(数字5 (b)和5 (c))。mef的适应性反应只观察到神经元SH-SY5Y细胞没有回应自适应(数据没有显示)。
(一)
(b)
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我们的研究结果表明,线粒体活动发挥作用在调节细胞功能以应对不利的压力,根据细胞类型。
2.4。PINK1丧失功能损害旁观者信号的传播
最近的证据表明,除了胞内信号,直接受损细胞胞间信号发送到他们的邻居旁观者细胞。
我们研究了线粒体功能完整性之间的关系调制PINK1和旁观者BLM引起的信号。我们采取了介质传输技术与介质被传输到接收机细胞(旁观者)治疗供者细胞孵化与介质(图24小时6(一))。我们研究了在中转移细胞行为从WT / SC WT / SC和WT / SC PINK1-KO / KD或从PINK1-KO / KD WT / SC细胞。传输介质后,旁观者细胞生长在这种媒介为另一个24小时之前分析(图6 (b))。
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在图6 (c),我们表明,锰产量显著增加了WT mef旁观者对待媒介从WT细胞。从WT细胞条件培养液对BLM诱导旁观者反应通过增加基因毒性在WT PINK-KD SH-SY5Y细胞(图6 (d))。媒介从PINK1 KO / KD没能引起这些类型的影响。
一个类似的趋势是衡量分析观察到双链断裂γH2AX / 53 bp1疫源地mef (WT和PINK1 KO)和SH-SY5Y (SC和PINK1 KD)旁观者介质(处理数据6 (e)和6 (f))。该参数显示了显著增加WT mef和SC SH-SY5Y细胞以及PINK-KD SH-SY5Y细胞收到WT mef和SC SH-SY5Y介质,分别。没有旁观者的反应可以观察到在WT mef和SC SH-SY5Y细胞接收条件培养基从PINK1-KO mef或PINK-KD SH-SY5Y细胞,分别。
DNA损伤的程度(显示参数MN和γH2AX / 53 bp1疫源地)旁观者细胞低于直接引起BLM治疗和不依赖于治疗剂量的增加。这种现象是常见的旁观者效应的信号,它被称为“饱和反应”(46]。我们得到同样的旁观者反应模式mef和SH-SY5Y利用主基因毒性代理x射线辐照(补充图S6)。
这些研究结果显示,第一次,线粒体功能调节的重要作用PINK1在细胞间传递,旁观者DNA损伤后的信号。
3所示。讨论
越来越多的证据表明,线粒体功能障碍与年龄有关的疾病。PINK1基因编码一个高度保守的serine-threonine激酶突变导致常染色体隐性震颤麻痹。这些突变妥协激酶活性或干扰蛋白质稳定性表明PD的功能丧失的机制。PINK1损失函数的影响帕金森病模型被彻底的记载,并强调了PINK1在维护线粒体质量控制中的作用和细胞内稳态。因此,PINK1已被证明能够防止细胞死亡引起的各种毒素,而PINK1损耗增加易受氧化应激细胞死亡。提出了几种机制来解释PINK1 cytoprotective活动,包括对线粒体生物能疗法和钙稳态的影响。因此,帕金森疾病发病机理的研究,通过大量的信息相关的角色在维持细胞内稳态PINK1生成和相关信息已经广泛的与年龄相关的障碍(了47])。
我们的研究显示新发现强调线粒体通过PINK1 mitochondria-nucleus通信有重要贡献的维护外部细胞基因毒性应激条件下细胞内稳态。该模型mitochondria-nucleus通信是描绘在图7。线粒体和细胞核沟通通常由线粒体在维持细胞内稳态生产ATP和核活动所需代谢物。反过来,细胞核负责编码大多数线粒体蛋白质(图7(一))。线粒体应激后,在我们的模型是通过PINK1损失函数,导致增加活性氧和线粒体损伤积累改变ATP生产。所有这些触发信号导致逆行性响应的核转录组成的变化,代谢适应,增强mtQC和减少ROS为了重建细胞内稳态(图7 (b))。线粒体应激信号机制最近审查(2]。DNA损伤的积累也影响线粒体功能通过多种机制:DNA损伤与氧化应激增强有关。DNA修复酶使用NAD +从而减少基质对线粒体功能的可用性;因此,线粒体蛋白质的合成可能影响(图7 (c))。最近的证据支持的假设似乎线粒体异常增强DNA损伤的积累通过降低激活的NAD + -SIRT1-PGC1a hyperactivation通路引起的DNA损伤传感器PARP1 [41,42]。
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结合应力水平的线粒体和细胞核可能出现在神经退行性疾病/老化影响线粒体过程(例如,mtQC)和核函数(例如,DNA修复),在当前的研究中,我们提供了增加DNA损伤的积累的例子在PINK1损失函数,在PINK1-KO细胞适应性反应,受损的旁观者信号(图7 (d))。一个有趣的功能,特点mitochondria-nucleus沟通在我们的实验条件是PINK1损失函数的背景,DNA损伤引发BLM不产生额外的线粒体损伤所反映的缺乏线粒体功能的变化参数的测量。这也可以由实验设计的方式;也就是说,治疗持续一个小时和端点测量24小时后。在这段时间里,可能很多没有累积损伤的细胞增殖和补偿在整个测量。我们使用这种实验方法与旁观者效应的研究,媒体需要的时间间隔(在我们的模型中,24小时)后,直接治疗。总的来说,在合并后的线粒体DNA的压力,DNA修复机制似乎优先为了维持细胞内稳态。
引发的压力侮辱在WT细胞但不是由一个适应性反应。建议辐射或化学诱导旁观者效应反映了细胞间通讯的功能。这被认为是一种机制,通过这种DNA损伤积累在细胞被传输到其他细胞和组织内传播,甚至整个有机体(48]。这些反应可能是保护生物层面上加强社区的细胞修复和消除严重受损的细胞。PINK1-deficient细胞显示改变细胞间信号的压力,削弱旁观者的感应现象,通过抑制信号形成细胞和治疗也通过改变响应信号在相邻细胞的能力。我们假设直接治疗PINK1-deficient细胞释放能力的降低旁观者因素在细胞外环境中可能由于减少了能量的能力。当PINK1-deficient细胞处于旁观者的接收端信号,他们也存在处理能力受损旁观者信号根据细胞类型。因此,只有在SH-SY5Y PINK1-KD细胞应对旁观者信号通过SC细胞。尽管PINK1-deficient细胞受损的旁观者的信号,他们响应自适应当一个挑战剂量(BLM 40μ随后g / mL)应用低剂量治疗(BLM 4μg / mL)的细胞。存在的基底压力的低剂量略有增加线粒体和引发了一场刺激的DNA修复过程,因此,细胞出现剂量更好地应对挑战。这种现象可能是由于线粒体的mitohormesis能力暴露于背景水平的内源压力。线粒体的增强抗逆性后续压力是众所周知的(49]。有趣的是,WT细胞不存在这种适应性反应。作为DNA损伤的积累减少KO的损伤积累细胞相比,我们假设应力不是足够有挑战性WT细胞触发自适应机制。
在我们的模型中,氧化应激,线粒体功能障碍和DNA损伤的结果似乎是一个常见的中介细胞损伤,但也展示了一个关键的角色在发电和输电的信号在细胞内或细胞间的水平。综述了氧化物种的这种双重角色Pizzino et al。50]。这些氧化物种可能调解适应性反应或后代的基因组不稳定性直接和旁观者都强调细胞根据其浓度、反应性、空间和时间分布(51]。
细胞抵抗氧化应激已经适应了限制ROS的危害,同时保持其信号能力。因此,细胞进化不同反应机制来保护ROS生成的细胞氧化所面临的挑战。低剂量的细胞应激反应可能是一个复杂的相互作用直接影响中,适应性反应,旁观者效应。
我们的假设是PINK1有助于细胞压力的管理参与旁观者通过细胞间的信号传输通信。因此,我们首次展示PINK1激酶不仅参与细胞内信号在细胞间的信号。在我们的研究中,基于“增大化现实”技术,代表两个方面对细胞健康有保护作用的机制对压力的侮辱。这些结果指向一个重要的线粒体为细胞内稳态防止不利影响的积累通过PINK1激酶功能。
4所示。结论
我们的研究表明,线粒体活动调制通过PINK1参与细胞反应基因毒性压力。因此,线粒体功能调节PINK1有助于管理细胞内的细胞应激反应防止不利影响的累积。此外,在DNA损伤后的细胞间通讯的过程,PINK1丧失细胞显示一个旁观者信号受损但自适应应对挑战剂量,可能由于mitohormesis类似的机制。
综上所述,所有这些结果发现PINK1的作用在亲密的连接上核和线粒体功能障碍之间依赖的逆行反应。
5。材料和方法
5.1。细胞培养
实验是在野生型(WT)或PINK1-knockout (KO)小鼠胚胎成纤维细胞(mef), LM马丁斯博士的礼物和WT PINK1-knockdown (KD)人类神经母细胞瘤SH-SY5Y H Plun-Favreau博士的礼物。细胞被使用,直到通过25湿润孵化器在37°C。mef和10%的边后卫,生长在DMEM补充2毫米谷酰胺,50 U /毫升青霉素,50μg / mL链霉素,SH-SY5Y细胞在DMEM / F12相同的补充剂。
5.2。基因毒性治疗、中传输和自适应感应
细胞产生的x射线直接暴露于0 - 3 Gy医用直线加速器(博智Mevatron 2 d, 6 MV、西门子、德国),剂量率为1.85 Gy /分钟(23硫酸),或者接受博来霉素(BLM, Sigma-Aldrich,美国)在有些人1小时μg / mL紧随其后3洗培养基(22]。
旁观者效应是引起介质传输方法。后基因毒性治疗、细胞(直接治疗,供者细胞)孵化24小时的新鲜媒介为了让旁观者的分泌的因素。这个媒介(旁观者条件)被收集,过滤(0.22μm过滤器,微孔、德国)和转移到一个新的细胞。未经处理的细胞(旁观者,接收机细胞)生长在培养基从供者细胞治疗收集在24 h后治疗。之间的转移媒体进行WT KO mef和SC KD SH-SY5Y如下。媒介从WT / SC转移到了WT / SC和WT / SC PINK1-KO / KD或从PINK1-KO / KD WT / SC细胞。
细胞诱导适应性反应,细胞处理低浓度的BLM, 4μg / mL 1小时,与培养基洗3次,然后添加新鲜培养基。我们额外的细胞孵化24小时;然后,我们把细胞与高浓度的BLM (40μg / mL) 1小时,其次是3洗培养基和添加新鲜培养基。在每次实验中,我们使用消极的控制(没有BLM治疗),治疗低剂量控制(只有第一个4μg / mL BLM),高剂量控制(治疗只有40岁μg / mL BLM)除了接触到的样品4的综合治疗μ40 g / mLμ克/毫升。
5.3。分析γ-H2AX / 53 bp1疫源地
染色的焦点是由一个典型的免疫荧光协议。这些细胞被固定在3.7%多聚甲醛(σ,德国)20分钟,permeabilized 0.1% Triton-X(σ,德国)20分钟,驴和屏蔽5%血清(美国杰克逊ImmunoResearch) 1小时。我们使用初级抗体兔子anti-53BP1 (Abcam、英国;反1:800)和老鼠γ-H2AX(微孔、德国;1:400)在一夜之间在4°C和二级抗体驴anti-rabbit共轭和若丹明红色(美国杰克逊ImmunoResearch;1:200)和驴anti-mouse共轭Alexa萤石488(美国杰克逊ImmunoResearch;1:200)1小时在室温下(52]。用荧光显微镜拍摄的图像,分析是由手工评分。gamma-H2AX得分,幻灯片是可视化使用荧光显微镜(奥林巴斯BX51)配备合适的过滤器DAPI, Alexa 488,若丹明红和100 x的目标。代表图像的条件从事这项研究提出了补充图S2。对于每一个样本,焦点在100年取得了细胞核。细胞核被DAPI染色鉴定。在每一个核,我们计算焦点由强烈的染色gamma-H2AX和53 bp1标记。细胞凝聚核和饱和染色没有得分,因为这些细胞凋亡的标志。我们计算焦点的平均数量为每个条件每个细胞。在每个实验中,我们为每个实验点得分3张幻灯片。代表的意思是±SEM结果三个独立的实验。
5.4。微核分析
使用的微核测定协议是改编自51使用荧光染色。细胞被播种在玻璃盖玻片和作为描述(BLM、x射线或旁观者介质)。细胞松弛素B前20 h添加分析3μg / mL MEF细胞和6μSH-SY5Y g / mL。在PBS染色,细胞被洗,固定在乙酸:甲醇(1:9),并在10和吖啶橙染色μg / mL 10分钟之后洗在PBS和安装23]。代表图像的条件从事这项研究提出了补充图S3。微核是1000年根据Fenech得分标准的双核细胞(53]。
5.5。细胞Viability-MTS测试
细胞生存能力是由MTS试验,基于线粒体氧化还原酶活性比色法根据制造商的指示(G3581 Promega)。短暂、中摘除和MTS的解决方案是添加的比例1:5培养基的边后卫为5%。这是孵化3 h,使用分光光度计吸光度测量在490海里(贝特密特拉神,技术)。在每次实验中,我们使用至少3技术复制/生物条件和相应的消极的控制和空白样品。
5.6。细胞Viability-Nuclear形态
分析的时候,细胞先用PBS洗一次,固定在3.7% PFA 20分钟,洗了三次PBS和permeabilized Triton-X 0.1%另一个20分钟。染色是由孵化的解决方案1μ33342克/毫升的赫斯特(美国热Fisher)在PBS 30分钟,其次是与PBS洗3次。
使用荧光显微镜的细胞被可视化。图像对应于至少500个细胞被为每个样本。细胞分析手动以下标准:细胞与圆形或椭圆形的细胞核和常规的形状和颜色都算作生活和细胞与浓缩和小核和形状不规则或核碎片被得分为凋亡。至少500个细胞/ 3独立实验样本进行了分析。
5.7。线粒体的潜力
线粒体的变化潜在测量TMRE(英杰公司)根据制造商的协议。简而言之,这些细胞被镀在24-well盘子和作为描述的直接影响。分析的时候,他们满载100海里TMRE培养基中30分钟;然后,分析了细胞流式细胞术(Accuri C6, BD生物科学)。线粒体潜在的相对差异是由细胞的相对变化百分比高荧光强度的窗口,是控制细胞在10%左右。
5.8。ROS测量
H2O2测量使用ROS-Glo分析工具包(Promega)后,制造商的指示(G8820 Promega)。96孔板的细胞被播种。三个小时前的分析,中了100人μ25 L的一个解决方案μM H2O2基质是补充道。分析,100μL ROS-Glo的解决方案是添加,其次是在室温下20分钟的孵化。化学发光测定使用分光光度计(贝特密特拉神,技术)。
5.9。半胱天冬酶3/7分析
细胞凋亡诱导半胱天冬酶的变化评估3/7水平,由化学发光方法根据制造商的协议(G8090 Promega)。半胱天冬酶水平在每个样本被归一化蛋白质含量。
5.10。ATP水平测量
ATP水平测定使用CellTiter-Glo (Promega)后,制造商的指示(G7572)。简单地说,这些细胞被种植在96 - 100年孔板μL媒介。分析,我们提供的混合工具添加到细胞和介质,孵化30分钟,化学发光测定使用分光光度计(贝特密特拉神,技术)。ATP水平量化使用ATP标准曲线,通过系列稀释培养基中ATP(σ,德国)。此外,蛋白质含量的ATP水平正常化,布拉德福德试验测量。
5.11。蛋白质含量测定(布拉德福德方法)
蛋白质含量测定使用布拉德福德方法标准化的目的。简单,细胞生长在96孔板在PBS洗,permeabilized 1: 7乙酸:甲醇20分钟,潜伏在布拉德福德的解决方案(σ,德国)30分钟。与PBS细胞被洗,我们添加了乙醇溶液化染色的复合物。在每个实验中,我们归一化样品标准曲线由BSA标准储备溶液(PBS)和连续稀释在布拉德福德的解决方案。每个实验包括空白样品为测试样本,标准曲线,和消极的控制。
5.12。基因表达分析
RNA提取使用试剂盒(σ)根据制造商的指示。逆转录使用高容量进行逆转录工具包(应用生物系统公司)。定量rt - pcr进行应用生物系统公司的循环使用SYBR绿色rt - pcr系统。Gene-specific引物设计、从σ。相对目标基因的转录水平正常化GAPDH信使rna水平。使用比较Ct方法量化了(54]。
5.13。统计分析
提出了数据为平均值,误差表明±SD或±SEM如上所述。推论统计分析使用棱镜和StatMate软件包(http://www.graphpad.com)。显著性水平是表示 , , , ,NS表示 。
5.14。测量呼吸活动的
线粒体呼吸在37°C的高分辨率的呼吸运动计量法化验使用OROBOROS Oxygraph。奥地利因斯布鲁克DatLab软件包(OROBOROS)被用于数据采集和分析。复杂的,复杂的我——和第二驱动的活动是化验MiR05呼吸缓冲区(KH 20 mM玫瑰,10毫米2阿宝4,110 mM蔗糖、20毫米牛磺酸和60毫米K-lactobionate), MgCl EGTA 5毫米,3毫米2×6小时2啊,1 g / L BSA(脂肪酸免费)的饱和ADP(5 - 10毫米)),并使用基质酸盐(2毫米),谷氨酸(10毫米)和琥珀酸(10毫米)。解偶联实现CCCP滴定。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
信息披露
投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究是由罗马尼亚国家权威研究和创新的框架核计划(PN 16420203和PN 16420203)戴安娜朱莉娅Savu De Montfort大学和VC2020启动和研究投资基金通过Nicoleta Moisoi。作者要感谢l·m·马丁斯和h . Plun-Favreau细胞系和材料。本研究贡献成本行动CA15203 MitoEAGLE。
补充材料
补充文件包含六个补充数据。补充图1:水平的差别PINK1对这些细胞株用于研究和基底上PINK1损失函数的影响ATP水平。补充图2:代表的图像γ-H2AX / 53 bp1染色。补充图3:代表micronuclear染色的图像。补充图4:BLM治疗对SH-SY5Y生存能力的影响,细胞凋亡蛋白酶活化、氧化物种积累,和ATP。补充图5:区划的压力信号似乎没有受到BLM的影响。补充图6:PINK1丧失功能损害细胞间的传播,旁观者x射线辐照后的信号。(补充材料)