文摘
小檗碱、黄芩苷和栀子苷的主要活性成分是Huang-Lian-Jie-Du-Decoction (HLJDD),一个著名的中国传统医学(中医),处方已用于治疗缺血性中风。本研究的目的是将自己的角色在缺血性中风的治疗效果。大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型构建模拟缺血性中风和治疗小檗碱的影响,黄芩苷、栀子苷、和HLJDD评估神经功能缺陷评分、梗死体积,组织病理学、免疫组织化学、生物化学、定量实时聚合酶链反应(存在)和免疫印迹。此外,1H核磁共振代谢组学方法被用来评估代谢,并结合相关网络分析成功地揭示了代谢紊乱在缺血性中风治疗的三个主要从首次HLJDD化合物。合并后的结果表明,小檗碱、黄芩苷和栀子苷负责HLJDD在缺血性中风的治疗的有效性的改进异常代谢和氧化应激,调节神经元自噬和炎症反应。这种集成的代谢组学方法显示,理解其潜在的功能复杂的公式和澄清其组件的作用在整个治疗的效果。
1。介绍
中风是死亡和残疾的主要原因之一,其中缺血性中风占大约85%1,2]。在过去的几年中,制药行业已经从寻找“灵丹妙药”,专门针对单个致病分子追求组成多个活性成分联合疗法治疗缺血性中风等复杂的疾病。这一转变伴随着测试宣传中医药(TCM)利用组合治疗策略(3]。
组成的黄连,黄芩,黄柏,果实栀子花Huang-Lian-Jie-Du-Decoction (HLJDD)是一个著名的multiherb中药配方,用于治疗脑血管疾病,缺血性中风中医的临床实践(4- - - - - -6]。目前,相当多的研究旨在了解HLJDD的药理作用进行ischemia-induced脑损伤(7- - - - - -9]。我们之前的研究展示了良好的HLJDD治疗缺血性中风疗效[10,11]。然而,校长治疗中风的作用在很大程度上仍是个未知数。
生物碱(例如,小檗碱、非洲防己碱和黄连碱),类黄酮(,如黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩甙,和汉黄芩素),和环烯醚萜苷(例如,京尼平甙和shanzhiside)是HLJDD的主要活性成分,其中,小檗碱(Ber),(白)、栀子苷(雅)三个主要成分(12,13]。HLJDD提取物,以及它的组件,对缺血性中风的保护作用[14,15]。小檗碱的主要组成部分黄连和黄柏,是一个有着悠久历史的异喹啉生物碱药用的阿育吠陀和中药。最近,小檗碱已被证明拥有有效的神经保护效应对缺血性损伤(15,16]。的主要成分黄芩苷黄芩(最常见的一种草本植物,作为中医中风治疗药物(17),直接保护神经细胞免受各种毒害神经的刺激和缺血再灌注损伤(18]。栀子苷的有效组成部分果实栀子花提高生存能力的神经元,提示神经突生长,变弱在模仿缺血性神经元死亡环境(19]。
在这项研究中,老鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型建立,从而忠实地模仿中风患者中的病理生理变化(20.]。本研究进行探索三个主要活性成分的作用从HLJDD脑损伤后在大鼠局灶性脑缺血模型。此外,我们研究了三种活性成分的潜在机制在缺血性脑损伤使用代谢组学和分子生物学方法。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
细节(Ber)小檗碱、黄芩苷(白),栀子苷(雅)和准备HLJDD提取和其他材料的使用可以在补充信息网上找到https://doi.org/10.1155/2017/9848594。
2.2。通过高效液相色谱法定量分析
小檗碱的定量分析,一个标准的解决方案,黄芩苷、栀子苷制备甲醇。校准曲线被绘制峰面积与构造相应的浓度水平。小檗碱的含量,黄芩苷、栀子苷HLJDD提取被量化。标准和样品的解决方案都是透过0.22μm膜过滤器前注入到高效液相色谱系统。
安捷伦1290液相色谱的高效液相色谱分析仪器(安捷伦科技公司,圣克拉拉、钙、美国)。色谱分离了在日本岛津公司VP-ODS列(250×4.6毫米ID, 5μ米粒子大小;日本岛津公司、日本京都)的溶剂流率1毫升/分钟的温度30°C。流动相是由10更易/ l与醋酸醋酸铵滴定,pH值3.0 (A)和乙腈(B),采用的溶剂梯度是如下:0 - 4分钟,10% B;4-15分钟,10 - 26% B;15 - min, 26 - 28% B;27-35 min, 28 - 70% B;B - 55分钟,70 - 90%;和成本则高达55 - min, 90% B (21]。8分钟postrun时间回到初始流动相组成每个分析后使用。注射量是5μ发现l和238海里,254 nm和280 nm。看到补充方法进行方法验证。
2.3。定性分析了HPLC-QTOF-MS
在线HPLC-QTOF-MS分析使用一个安捷伦1290无穷LC系统连接到一个6520四极飞行时间质谱仪(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)配备一个电喷射接口。积极的和消极的离子谱实验使用条件如下:干燥气体温度、320°C;干燥气体(N2)流量、10 l /分钟;45 psi喷雾器;毛细管电压4000 V积极模式和3500 V -模式;和fragmentor, 175 V。所有的操作,数据的采集和分析是由安捷伦质量猎人收购软件版本B.04.00(安捷伦科技)。
2.4。实验动物管理规程
八周大男性Sprague-Dawley老鼠(250±20 g)购买Promedican制药有限公司(动物许可证号码:SCXK(胡)2013 - 0016;中国上海)。老鼠被放置在通风良好的房间在恒定室温(25±2°C)和空气湿度(50±10%)的光/暗周期12 h。所有的动物都被允许随意访问标准饮食(鼠标饼干)和水在整个研究。动物们适应了10天前剂量治疗。动物保健和使用过程都是按照国家卫生研究所(NIH)实验动物保健和使用指南和机构批准的动物保健和使用委员会中国药科大学(许可证号码:SYXK(超自然)2016 - 0011)。老鼠手术前禁食12 h MCAO模型但被允许免费使用水。
MCAO操作使用管腔内的丝方法是由一个有经验的研究人员根据隆以前方法et al。22)做了一些调整,如前所述10]。简单地说,动物是第一个与水合氯醛麻醉(3.5%,350毫克/公斤,i.p)。。右颈总动脉(CCA),右侧颈外动脉(ECA)和右颈内动脉(ICA)暴露从结缔组织和孤立。poly-L-lysine-coated尼龙单丝(0.26毫米,2636 - a3,北京Cinontech有限公司,北京,中国)提示热圆直径为0.36±0.02毫米插入到ICA通过ECA直到其技巧是住在大脑前动脉(ACA), 18 - 20毫米的距离从颈动脉分叉根据动物的重量,来阻止血液流入大脑中动脉(MCA),从而实现脑缺血。2 h后持续缺血,再灌注是由插入的灯丝的撤军。Sham-operated老鼠收到同样的手术,除了动脉没有阻挡。所有外科手术都是在无菌环境中完成的。直肠温度的动物被一个热敏电阻监控和维护为37.0±0.5°C,恒温控制的加热垫(ALCBIO、上海中华人民共和国)在手术和缺血。鼠的头骨是减少使用钻颅骨表面的核心区域提供的MCA(6毫米横向和2毫米后的前囱)直到一层很薄的骨头依然(观察增加发红),和区域CBF记录了激光多普勒流量计(FLPI2、沼泽仪器有限公司、阿、英国)。
在初步实验中,大鼠受到2 h MCAO其次是1 d、3 d,或再灌注7 d。样本收集的虚假的老鼠(NC);样本的收集MCAO大鼠1 d (1 d-M) 3 d (3 d-M),再灌注后和7 d (7 d-M);样本收集HLJDD-treated组1 d (1 d-HD), 3 d (3 d-HD),再灌注后和7 d (7 d-HD);样本收集berberine-treated组1 d (1 d-Ber), 3 d (3 d-Ber),再灌注后和7 d (7 d-Ber);样本收集baicalin-treated组1 d (1 d-Bai), 3 d (3 d-Bai),再灌注后和7 d (7 d-Bai);和收集样本jasminoidin-treated组1 d (1 d-Jas) 3 d (3 d-Jas),再灌注后7 d (7 d-Jas)。
血清和大脑样本进行分析1H核磁共振代谢组学方法。分箱核磁共振数据提交给OPLS-DA。OPLS-DA分数情节的血清和大脑提取(补充数据和),1 d-M组是离你最远的NC组与3 d-M和7 d-M团体之间,表明最显著的代谢紊乱发生在再灌注后1 d。进一步探讨代谢引起的扰动MCAO和HD /数量/白/雅,1M H NMR数据组相比,数控和HD /数量/白/雅组在每个时间点(1 d、3 d和7 d后再灌注)OPLS-DA(补充数据和),分别。结果表明,HLJDD、小檗碱、黄芩苷、和jasminoidin-induced神经保护有效1 d, 3 d和7 d后缺血。我们还发现小檗碱的浓度、黄芩苷、栀子苷在大鼠血液和大脑后15分钟日常管理和1 d、3 d,和7 d后再灌注,HPLC-QTOF-MS / MS方法。详情,请参见补充信息。
病理过程引起的血管损伤后大脑动脉的闭塞是动态的过程,可以分为急性(小时)、亚急性(几个小时到几天),和慢性(天个月)。根据核磁共振代谢组学的初步实验结果,MCAO的症状最严重的在再灌注后1 d,所以样品在我们的论文24小时进行了进一步的分析。
老鼠被随机分配到六组:(1)虚假的操作组(数控, ),(2)MCAO模型组(M, ),(3)HLJDD-treated集团(高清, ),(4)berberine-treated集团(Ber, ),(5)baicalin-treated集团(呗, ),(6)jasminoidin-treated集团(雅, )。药物溶解在0.5% CMC-Na(羧甲基纤维素钠)和intragastrically(专营)让老鼠的剂量服用10克/公斤,140毫克/公斤,66毫克/公斤,和HD - 55毫克/公斤,方方面面,白,和Jas-treated组,以同样的体积(10毫升/公斤体重),每天一次连续七天。虚假和MCAO大鼠管理CMC-Na等效容量的0.5%。
2.5。神经赤字测量
六组大鼠的神经功能障碍是评价再灌注后24 h时如前所述[10]。神经分数记录由一个侦探被蒙蔽实验小组根据隆et al。五点量表:0,没有神经赤字;1、未能延伸到右前肢;2、绕到侧方;3,下降到侧静止;4,没有自发运动活动。
2.6。TTC染色
脑梗死体积测量通过染色2,3,去除氯(TTC、σ)评估脑缺血的严重程度(23]。大脑被分为6 2毫米厚冠状切片、TTC沾2%,室温下孵化(RT)在黑暗中30分钟,然后用10%的缓冲福尔马林固定过夜。正常组织染色红色玫瑰,梗塞组织染色的白色。片与TTC染色拍摄和分析使用图像分析软件(Image-Pro + 6.0)。测试是由观察者盲治疗组。正确的梗塞体积(V我为脑水肿),梗死体积的百分比(我%)获得了使用以下公式:
Vc=体积的完整侧(左)半球。
V我=体积侧(右)半球的完整的区域(24]。
2.7。临床生物化学、组织病理学和免疫组织化学
氧化应激相关的水平生物组件,包括一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、二硫化谷胱甘肽(GSSG), Mn-superoxide歧化酶(Mn-SOD),铜/ Zn-SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),测量使用商用试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
大脑组织浸在10%中性缓冲福尔马林24 h,嵌入在石蜡,切成5μ米厚度。切部分是沾hematoxylin-eosin())和检查光学显微镜(×400放大,奥林巴斯DX45)。组织病理学结果进行评估,宁教授苏(东南大学,南京,中国)盲实验。
免疫组织化学检查,formalin-fixed脑组织石蜡包埋部分使用和NF -的活性κB-p65被Goodbio评估技术有限公司(南京,中国)。光学显微镜下的染色被拍到和分析使用图像分析软件(Image-Pro + 6.0)。
2.8。样品制备,1H NMR分析和光谱预处理
血清和大脑样品制备的细节,1H NMR光谱测量和光谱预处理的补充信息。
2.9。相关网络分析
代谢相关网络进行使用R-package igraph软件。网络可能存在的相关性之间的皮尔逊相关系数的代谢物水平及其结构相似。常见的皮尔森相关网络可视化代谢物的相关性不同的状态。然而,这种相关性并不病因的关系。分子间的网络,实线表示分子之间的相关性;红色和蓝色的线颜色显示积极的和消极的关系,分别。节点代表代谢物,节点之间的线表示生物两个相关代谢物之间的关系。代谢物类似的结构连接的虚线表示一个可能的分子之间的生化反应。丰富了网络的结构相似性信息以来,几乎所有的生化反应的底物和产品应该是相似的。在这种背景下,高相关性代谢物的结构相似之处可能反映它们之间可能的生化反应的理论,从而诱发效应。
2.10。实时定量rt - pcr分析
实时定量rt - pcr分析是由使用引物补充表中列出据中描述的方法,补充信息。
2.11。免疫印迹分析
免疫印迹分析进行描述的补充信息。
2.12。统计分析
化验进行至少三次,除非另有说明。所有实验数据,除了死亡率,表示为±标准差(SD)的手段。统计学意义是使用学生的双尾执行t以及两组之间的比较和单向方差分析(方差分析)其次是图基的多重比较测试数据包括三个或更多组。一个p值小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。定量和定性分析
优化随后应用于高效液相色谱法(HPLC)同时定量分析小檗碱、黄芩苷、栀子苷在HLJDD提取数据1(一)和1 (b)和补充图年代),其内容确定为5.32%,2.51%,和2.09%,分别。如数据所示1 (c)和1 (d)HLJDD提取物,47岁的组件通过HPLC-QTOF-MS,并补充表中列出- - - - - -,主要包括生物碱、环烯醚萜苷和黄酮类化合物。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。神经赤字、缺血性梗塞和组织病理学评估
所有组的大脑中动脉血流减少20 - 30%的preischemia水平闭塞后被用来确认(补充图),说明优秀的模型。在再灌注后24小时,死亡率、梗死体积,功能反应,和形态异常MCAO大鼠采用高清,方方面面,巴姨,和雅在本研究评估。结果表明,(1)死亡率和高清的分数和误码率治疗组明显低于模型组(图2(一个));(2)在HD -,误码率,和雅——治疗大鼠梗死体积的百分比相比显著降低模型的控制老鼠(图2 (b));(3)HD和系统治疗显著改善MCAO大鼠的脑组织病理变化,病理异常时偶尔观察到白和雅集团(数字2 (c)和2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。代谢物鉴定中1H NMR谱的血清和组织
代表500 MHz1H NMR谱的血清样本和大脑补充图所示代谢产物的标签。26代谢物在血清和42代谢物在大脑中提取被确定通过查询公开代谢组学数据库,如麦迪逊(http://mmcd.nmrfam.wisc.edu/)和HMDB (http://www.hmdb.ca/),由于Chenomx NMR套件(8.1版本,Chenomx Inc .,埃德蒙顿,加拿大)。代谢物补充表中列出的详细信息和。
3.4。多元和单变量分析1H NMR谱数据的所有组
整个1血清和大脑的H NMR数据提取分析正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)探索高清的效果,方方面面,巴姨,和雅MCAO大鼠。探讨代谢引起的扰动MCAO和HD /数量/白/雅,1H NMR数据属于MCAO组(M)比较与那些属于虚假的组(NC)和HD /数量/白/ OPLS-DA雅集团(数字3和4),分别。分情节,展示了集群与代谢模式在不同的小组,每个点代表一个样本。OPLS-DA分数情节的血清和大脑提取,数控,高清,方方面面,巴姨,和雅集团是完全分开的M组,证明严重MCAO引起的代谢紊乱,可改善高清后,方方面面,巴姨,和雅治疗。OPLS-DA加载情节和S-plots生成辨认代谢物负责比分情节的分化。彩色编码加载块是color-encoded根据分组每个变量的绝对相关系数;hot-colored信号(红色)表示类分离更重要的贡献比cold-colored(蓝色),提出了covariance-based pseudospectrum。S-plots是另一种方法来识别显著改变代谢物,应位于右上和左下象限远离原点。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
这些重要的微分代谢物被OPLS-DA加载情节和S-plots进一步测试使用单变量分析的组间差异。代谢物的褶皱变化值sham-operated或药物治疗的老鼠相对于MCAO组和相应的pBenjamini-Hochberg值调整的方法(25由褶皱变化计算和可视化情节(补充图);详情,请参见补充信息。
3.5。SUS共享和独特的结构分析
在目前的研究中,一个扩展的S-plot的SUS-plot(共享和独特的结构),应用于进一步比较两个治疗组的结果(例如,HD和误码率,高清与白,和HD和雅)的MCAO组。SUS-plot结合。柯尔(tp, X)两个模型的资料,在一个二维图。SUS-plot显示相关,应该扩展−1和+ 1之间的轴。代谢物接近对角线将类之间共享,和代谢物对角线外指定的类将是唯一的;看到的结果数据5(一个)得了,5 (b)得了。然后,四个区域的SUS-plot在维恩图(可改善地可视化数据5(一个)D-F和5 (b)D-F)。
(一)
(b)
如图5,共享和独特的代谢物结构从大脑中提取被发现HD组数量/白/雅组相比,基于OPLS-DA SUS-plots。Glu、空调采暖和Cit是独特的代谢产物为所有的误码率,巴姨,和雅组;ATP, Gyo, 3-HB高清的独特的代谢产物;乙炔、Cr、王牌,Pyr HD和误码率之间的负相关/白/雅,这表明HD做的更好在改善MCAO大鼠的能量代谢紊乱和雅比误码率。
3.6。相关的网络微分代谢物
而不是只调查个人代谢物变化,代谢相关网络进行使用R-package igraph软件破译候选人之间的生物相关生物标志物。如图6,网络建立了基于微分血清代谢物的骗局,MCAO,选择药物治疗大鼠基于OPLS-DA载荷/ S-plots。虚假的网络,柠檬酸,柠檬酸循环的关键中间体,与许多代谢物是高度相关的,包括葡萄糖、亮氨酸、乙酰乙酸盐、谷氨酸,β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、半胱氨酸、乳酸和磷酰胆碱(OPC)。然而,这些相关性MCAO大鼠的缺席。对MCAO大鼠,乳酸glycolysis-related代谢物是位于网络中心的上升趋势。观察葡萄糖和乳酸之间强烈的负相关,表明有氧呼吸的能源生产转向无氧糖酵解。3-hydroxybutyrate之间的强相关性(3-HB),丙酮酸,丙氨酸也表明,酮体的新陈代谢被激活来补充能量。MCAO大鼠的摄动相关网络可以部分纠正HLJDD及其三个主体。
一些明显的差异观察之间的虚假和缺血/再灌注(I / R)老鼠。在大脑(图7)、高负相关性观察乳酸和柠檬酸和抗坏血酸盐和磷酸肌酸在MCAO大鼠(PCr),表明能源生产的转变意味着对无氧糖酵解。酮体(如3-HB和乙酰乙酸盐)和许多代谢产物出现高度相关。积极的水平之间的相关性观察肌酸(Cr)和PCr,展示Cr-PCr系统和酮体的加速利用ATP生产在缺血性中风。很强的相关性之间的谷胱甘肽和虚假的老鼠,观察谷氨酸在MCAO大鼠缺席。betaine-taurine一对相同的被发现,在MCAO大鼠缺席,在虚假的老鼠和治疗组。甜菜碱和牛磺酸是重要的有机osmolytes大脑,从而渗透平衡直接相关。betaine-taurine相关性的缺席在MCAO大鼠建议干扰离子平衡I / R,最终导致脑水肿。
相关网络分析提供了证据的能量不平衡和氧化应激在缺血再灌注损伤,如glycolysis-derived代谢物,柠檬酸循环中间体、磷酸化合物,酮体、谷胱甘肽代谢,治疗的三个主体在缺血性中风HLJDD。
3.7。HLJDD及其三个主体对氧化应激的影响
在我们的实验中,测量水平的氧化应激相关生物制品(图8(一个))。与假组相比,没有和MDA,氧化应激标记,在I / R组显著增加和减少在高清,方方面面,雅组。的活动antioxidases Mn-SOD、铜/ Zn-SOD,猫,和GPx显然是抑制M组与虚假的集团相比,大大增强了HD治疗,方方面面,雅。I / R生产谷胱甘肽和相应的数量显著减少显著积累GSSG M组,由高清逆转,方方面面,雅治疗。
(一)
(b)
此外,氧化酵素的表达式(这种破坏,Prx3 Prx5, Prx6)和NAD (P) H:醌氧化还原酶(NQO-1)是由免疫印迹分析(图8 (b))。结果显示,大鼠MCAO组有一个轻微的增加蛋白质的表达这种破坏,Prx3, Prx5 Prx6, NQO-1。与MCAO组相比,高清,方方面面,雅显著增加了这些蛋白的表达水平。
3.8。HLJDD及其三个主体在自噬的影响
与MCAO组相比,大大增加的比率microtubule-associated蛋白轻链3 - II (LC3 -) / LC3-I和polyubiquitin-binding蛋白表达降低p62观察高清,方方面面,巴姨,和雅集团(图8(c)),展现一个诱导自噬的四种治疗方法。确认推论,几个autophagy-related蛋白质的表达,比如phospho-mammalian雷帕霉素靶(p-mTOR) beclin-1;Atg-3、Atg-5 Atg-7, Atg-12;phopho-phosphatidylinositol-3激酶(p-PI3K) phospho-protein激酶B (p-AKT), phospho-glycogen合成酶激酶3β(p-GSK-3β),用免疫印迹分析(图进行了分析9)。与那些在MCAO组相比,除了p-mTOR之外,所有这些蛋白质在所有四个治疗组明显增加,表明HLJDD及其三个主体的能力诱导自噬。
(一)
(b)
(c)
3.9。HLJDD及其三个主体对炎症反应的影响
在我们的实验中,基因和蛋白质表达的诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和cyclooxygenase-2 (cox - 2)在MCAO大鼠显著增加(图10),展示强烈的炎症反应。除了这些促炎的酶,促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)、白介素2(- 2)和白细胞介素- 6 (il - 6)也增加I / R后在mRNA水平。高清,方方面面,白治疗有效地抑制活化的I / R-induced促炎的酶(cox - 2和间接宾语)和促炎细胞因子(例如,TNF -α,il - 1β、2、il - 6)。
(一)
(b)
(c)
(d)
HLJDD及其影响的三个主体的表达phospho-NF -κ(B) -核factor-kappa B - p65 (p-p65)研究了I / R后使用免疫组织化学分析和免疫印迹。蛋白质的表达核p-p65和细胞质phospho-I-kappa-B激酶(p-IKK)在MCAO组显著增加,大大减少了高清,方方面面,白和稍微下降了雅。相应地,p-p65抑制剂phospho-inhibitor nf -κB的表达α(p-IKBα)胞质分数显著降低MCAO组,可明显增加了高清,方方面面,白治疗。
4所示。讨论
在这项研究中,伴随着死亡率、神经功能缺陷评分、梗死体积,组织病理学检查、临床生物化学、免疫组织化学分析,存在和免疫印迹分析,1H NMR-based采用代谢组学方法探索HLJDD的三个主要活性成分的作用,也就是说,小檗碱、黄芩苷、栀子苷对缺血性中风的治疗和探索底层机制。相关网络分析的最显著影响途径代谢的变化表明,MCAO大鼠是参与能量代谢和氧化应激。
4.1。能量代谢
脑I / R损伤造成的破坏,然后随后恢复葡萄糖和氧气供应到大脑。当葡萄糖和氧气供应是有限的,ATP合成葡萄糖的有氧代谢通过电子传递链(等)介导的氧化磷酸化是抑制,显著降低葡萄糖水平所示,ATP,丙酮酸在MCAO大鼠。此外,小丙酮酸可以进入三羧酸(TCA)循环在这些条件下;因此,柠檬酸也减少。乳酸(无氧呼吸的副产品)水平显著增加,表明转向更高效厌氧糖酵解ATP合成,这是不足以支持正常的脑功能。这种转变的结果在其它方式产生能量的增加,如Cr-PCr系统和酮体。Cr-PCr系统,通过肌酸激酶(CK)反应,维持一个恒定的ATP水平中扮演着关键角色(26]。大脑的下降水平建议加速转化为ATP。酮体,例如3-HB和乙酰乙酸盐,也可以作为燃料如果大脑挨饿。酮的尸体从血清转移到大脑补充能源供应不足(27),这是由他们所观察到的减少和增加,分别在MCAO大鼠血清和大脑。
结果表明,能量代谢在MCAO大鼠严重受损。HLJDD及其三个主体在很大程度上改善了能量代谢受损MCAO大鼠就是明证的能力增加血糖水平,从而增加能源的可用性。作为能源生产的主要途径,提高了柠檬酸循环HLJDD及其三个组件表示的柠檬酸和丙酮酸的显著提高。改善能源供应,其他能源生产就意味着不再需要以Cr和PCr水平升高和降低酮体含量治疗大鼠的大脑比MCAO大鼠。
4.2。氧化应激
神经元缺血后再灌注使氧气和葡萄糖的量超过正常消费,这将导致再灌注损伤。再灌注损伤脑组织的氧化应激是有据可查的最显著特点28]。氧化应激是一种自由基的生产之间的不平衡,特别是活性氧(ROS),并删除它们的生物的能力,这是脑缺血再灌注损伤的主要机制(29日,30.]。大脑是非常容易氧化应激损伤由于其快速氧化代谢活动,多不饱和脂肪酸含量高,抗氧化能力相对较低,和神经细胞修复能力不足31日]。脑缺血诱导活性氧的生成,视为最早的组织损伤的迹象,再灌注后缺血器官(32]。
没有显著增加的水平(过氧亚硝基的前身)和MDA(脂质过氧化的产物)在MCAO组表示严重缺血/再灌注引起的氧化损伤(33]。身体也出现了对氧化损害的防御机制。NQO-1模型中增加集团是一个重要的cytoprotective基因。等抗氧化酶SOD, CAT和GPX低分了体重ROS食腐动物,如谷胱甘肽、抗坏血酸盐,关键减弱了缺血/再灌注引起的伤害。他们的活动严重降低MCAO大鼠的大脑(与虚假的老鼠相比)。SOD和CAT的金属离子催化歧化反应,解毒O2−和H2O2,分别。SOD是研究最多的抗氧化剂酶中风。有两个主要内生亚型的细胞内超氧化物SOD:铜/ Zn-SOD主要存在于胞质和溶酶体分数和锰SOD (Mn-SOD)主要是线粒体基质中。与虚假的老鼠相比,铜/ Zn-SOD和Mn-SOD MCAO大脑严重下降。
GPx的催化下,谷胱甘肽氧化二硫(GSSG) (34]。GSSG是转换回谷胱甘肽,谷胱甘肽还原酶(GR),这样可以减少等价物来自NADPH。GPx谷胱甘肽在MCAO大脑严重下降而sham-operated老鼠的大脑。
(插件可以)配合抗氧化蛋白GPx维持恒定细胞过氧化水平。插件可以被发现在反应诱导氧化应激(35)和显示时防止氧化应激在动物,因此在脑缺血再灌注损伤保护作用[36]。在我们的研究中,脑缺血略同功酶的表达增加插件可以(这种破坏,Prx3 Prx5, Prx6)。
与I / R组相比,高清,方方面面,雅降低NO和MDA水平的提高和增强的活动antioxidases(杆、猫、GPx)和抗氧化蛋白(插件可以)和NQO-1,谷胱甘肽的水平。这些生化参数结合免疫印迹结果表明HD的防护能力,方方面面,雅来抵消ROS和改善氧化应激的状态由I / R损伤。
4.3。自噬
自噬,一个重要的细胞间隙系统降解废物或受损的细胞器为重用,只报道发挥保护作用在I / R (37,38]。LC3和p62是重要的蛋白质在自噬,在胞质模式LC3 (LC3-I)转化为autophagosomal膜LC3 (LC3-II),导致增加LC3-II或LC3-II / LC3-I水平(39]。然而,p62表达水平通常是在自噬(有所下降40]。
我们之前的研究表明,一种蛋白激酶信号转导途径可能参与HLJDD对脑缺血损伤的保护(41]。一种蛋白激酶磷酸化和随后的失活是已知函数的许多蛋白质,与丝氨酸/苏氨酸激酶GSK-3β作为其主要目标之一(42]。一种蛋白激酶/ GSK-3β信号通路在调节自噬发挥了重要作用[43]。
在这项研究中,我们表明,高清,误码率,和雅LC3-II / LC3-I升高,beclin-1, Atg-3, Atg-5, Atg-7,和Atg-12水平,减少p62的表达和抑制mTOR的激活(最重要的蛋白质之一负调节自噬),和调节的一种蛋白激酶磷酸化及其相关基质GSK-3β在再灌注24小时。这些发现表明,数量和雅促进自噬通过增加LC3-II / LC3-I beclin-1, Atg表达式,激活GSK3 AKT /β信号通路,通过减少p62表达,抑制mTOR的磷酸化。
4.4。炎症
NF -κB, a redox-sensitive炎症基因的转录因子调节电池,扮演了一个至关重要的角色,在缺血后炎症的规定,这是对经济复苏的缺血性中风(44]。如果,NF -κB位于细胞质中作为一个不活跃的异质二聚体由两个亚基组成,p50 p65。抑制蛋白质的异质二聚体形式复杂κB -α,保留蛋白质在细胞质中。活性氧可以激活酶κB激酶(IKK),进而导致我κB -α磷酸化,紧随其后的是我κB -α退化和NF -κB p65 / p50激活。激活NF -κB是易位到细胞核,蛋白质绑定到特定的DNA序列称为响应元素(RE),最终导致多种促炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β、2、il - 6,诱导促炎的酶(cox - 2和间接宾语),加剧大脑损害的炎症进展(45,46]。
在目前的研究中,伊诺和cox - 2在再灌注后24 h调节。同样,促炎的基因,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β、2、il - 6,在大脑中存在少量的sham-operated老鼠和诱导的I / R。的upregulation伊诺被生产的增加没有平行的,这可能与ROS产生过氧亚硝基反应,臭名昭著的神经元损伤过程中引发的脑I / R (47]。
高清,方方面面,白治疗保护老鼠大脑的I / R-induced核易位NF -κB-p65和促炎基因的超表达(TNF -α,il - 1β、2、il - 6)和酶(进气阀打开,cox - 2)。高清,误码率,白可以抑制激酶的我κB和IKK通过干扰他们的磷酸化和泛素化,防止NF的易位κB到细胞核和促炎细胞因子的转录。
高清,方方面面,白治疗显著增强PI3K和AKT蛋白的磷酸化。PI3K / Akt和NF -κB信号通路可能是功能上相互关联的,而不是单独行动。PI3K / Akt通路的激活可以发挥突出对脑I / R损伤的神经保护作用调节炎症(48,49]。AKT通路激活已被证明废除NF -κB-driven激活基因表达的50),建议有助于抑制NF -κB激活通过调制transactivation NF -的能力κB p65亚基(51]。因此,高清,误码率,白可能影响NF -κB通过PI3K / Akt信号级联激活。直接的实验证据来决定是否应填入PI3K / Akt激活和抑制NF -κB活动高清,误码率,白代表直接的抗炎机制高清,方方面面,白在瞬态脑I / R。
5。结论
总之,这种集成的代谢组学方法提供充足的证据证明大幅改善脑I / R损伤的误码率,白族,雅。图11描述HLJDD及其三个主要组件如何影响代谢,表现出对缺血性中风治疗的影响,这可能是由于无序的改善新陈代谢,神经元自噬的upregulation,氧化应激和炎症反应的差别,对这些基因。改善神经功能I / R的数量和白可能由于他们诱导增加NF -κB,进气阀打开,cox - 2蛋白表达。此外,数量和雅的神经保护效应相关的氧化应激的调节和自噬。本研究的结果表明,方方面面,白族,雅HLJDD负责HLJDD在缺血性中风的治疗的有效性,从而药物开发潜力巨大的基于他们的缺血性脑损伤。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81173526),中国国家自然科学基金重点项目(没有。81430092),程序在大学长江学者和创新研究团队(IRT_15R63)和项目优先资助的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD)。
补充材料
补充表S1。引物用于实时PCR检测LC480系统上执行。补充表S2。化合物的提取检测HLJDD HPLC-Q-TOF-MS获得的。补充表S3。化合物的提取检测HLJDD HPLC-Q-TOF-MS获得的。补充表S4。化合物的提取检测HLJDD HPLC-Q-TOF-MS获得的。补充表S5。化合物的提取检测HLJDD HPLC-Q-TOF-MS获得的。 Supplementary Table S6. Compounds detected in the extracts of HLJDD obtained by HPLC-Q-TOF-MS. Supplementary Table S7. The assignment of metabolites in serum of all groups. Supplementary Table S8. The assignment of metabolites in brain extracts of all groups. Supplementary Table S9. Calibration curve, correlation coefficient (r2)、测试范围和工具性LOD、定量限小檗碱、黄芩苷、栀子苷在甲醇溶液(n = 6)。S10补充表。精度、准确性和恢复小檗碱、黄芩苷、栀子苷(n = 6)。S11补充表。校准曲线相关系数(r2),测试范围、体重cofficient和LLOQ小檗碱、黄芩苷、栀子苷在甲醇溶液(n = 6)。S12补充表。精密度和准确度的小檗碱、黄芩苷和栀子苷QC样品的大鼠血浆(n = 6)。补充表向。复苏和基体效应对小檗碱、黄芩苷和栀子苷在大鼠血浆(n = 6)。补充表S14系列。小檗碱、黄芩苷稳定性和栀子苷在不同储存条件下等离子体(n = 6)。S15补充表。小檗碱、黄芩苷稳定性和大脑中栀子苷提取物在不同储存条件(n = 6)。补充图S1。 Score plots according to OPLS-DA analysis based on1从血清H NMR数据组在每个时间点。补充图S2。分数据OPLS-DA情节分析基础上1H NMR数据从大脑中提取所有组在每个时间点。补充图S3。概要文件的概要文件的紫外线色谱和抽搐和色谱图。补充图S4。定量分析区域脑血流量(rCBF)在不同的组。补充图S5。典型的500 MHz1H NMR光谱血清和脑组织。补充图S6。褶皱变化块颜色Benjamini-Hochberg假定值调整的方法改变血清中代谢物的指示意义和大脑提取。补充图S7。大脑和血浆浓度与时间的小檗碱、黄芩苷、栀子苷后政府的老鼠。