文摘
癌症是一种最发生在发达国家和发展中国家的疾病。植物性化合物仍是研究其抗癌的活性和植物的数量。因此,现代色谱方法应用于量化植物,例如,UPLC-MS /女士(ultraperformance液相色谱串联质谱)。因此,本研究的目的是评估的内容血根碱、小檗碱、protopine, chelidonine荷色牡丹海棠(l)登月舱。Fumaria officinalislGlaucium flavumCrantz,静脉延胡索l小檗属植物thunbergii直流。Meconopsis cambrica(l)中收取。十大功劳aquifolium纳特(Pursh)。Macleaya cordataWilld。,Chelidonium majus首次l . N N-dimethyl-hernovine被确认m . cambrica,b . thunbergii,m . aquifolium,c .静脉,g . flavum,c . majus;methyl-hernovine被确定在g . flavum;columbamine被确定在b . thunbergii;,chelidonine methyl-corypalmine和血根碱中确定f . officinalisl . protopine在所有研究物种最丰富的地区m . cordata(5463.64±26.3μg / g)。最高的大量chelidonine和血根碱被发现c . majus(51040 0±1.8μg / g和7925.8±3.3μg / g,职责),b . thunbergi含有小檗碱的最高金额(6358.4±4.2μg / g)。
1。介绍
世界不同民族的几个世纪以来一直使用植物性药物管理各种疾病。天然来源的药物,如紫杉醇(水松杂草),长春花生物碱,例子的传统植物用于现代药物开发的价值。植物分子经常用作药物前体转化为药物的化学改性,例如,10-deacetybaccatin。它建立了约120植物化合物用于西医和大约80%的世界人口在初级卫生保健中使用药用植物。尽管已经取得了很大的进展向有效的抗癌药物的发现,许多西方社区仍然使用植物性药物,包括植物从传统中药。发达国家和发展中国家使用的植物性药物单独或一起合成药物(1]。
生物碱与最强的天然化合物的药理活性物质合成植物之一。他们负责许多植物的毒性。高生物活性使其使用这些化合物研究的主题在药房,尤其是作为抗癌药物。血根碱、小檗碱、protopine第四纪异喹啉生物碱,而chelidonine是高等生物碱。这些化合物是广泛研究的抗肿瘤活性。据文献报道,血根碱许多肿瘤细胞株的凋亡[2,3]。小檗碱还具有抗癌活性与一些细胞系(4,5]。Chelidonine是伟大的白屈菜的主要生物碱(Chelidonium majusl .)。增加兴趣chelidonine观察21世纪之初,当科学家开始关注其有前途的抗癌活性,如对葡萄膜黑色素瘤细胞(6),肝癌7),白血病细胞(8),或黑素瘤细胞(6]。Protopine是一个生物碱高药理活动。它能抑制血小板聚集和徒antihistaminically抗菌(9]。关于其抗肿瘤活性,非常重要的是,化合物显著增加CYP1A1的mRNA水平在人类肝细胞和肝癌HepG2细胞(10]。在前列腺癌细胞中,化合物抑制有丝分裂和凋亡11]。这些生物碱是目前主要的植物物种罂粟科,Rannunculaceae,小檗科家庭。
抗癌生物碱的方法有不同的行动,包括诱导和激活凋亡信号通过诱导蛋白质和促进细胞凋亡的DNA损伤,半胱天冬酶催化剂,细胞生长抑制剂。除了这些模式的行动,有其他的基于G-quadruplexes的形成。这种模式的行动可以被认为是一种治疗癌症的新方法(12,13]。
c . majus,m . cordata,d .海棠,f . officinalis,g . flavum,c .静脉,b . thunbergii,m . cambrica,m . aquifolium生物碱的来源。最著名的研究物种之一c . majus和m . cordata,其特点是chelidonine含量最高。直到现在,只有这两个物种进行了分析使用UPLC法(14]。b . thunbergii是目前引起的物种的研究很感兴趣,尤其是在中国。是中国和西藏传统医学的植物高效的地方该地区许多炎症性疾病的治疗。其他物种也作为民间药物在北美和欧洲,阿育吠陀医学,他们非常丰富的化学成分15- - - - - -17]。直到现在,讨论等方法分析了植物物种的非水毛细管electrophoresis-electrospray离子阱质谱(18),硅胶柱色谱,薄层色谱(19)和高效液相色谱法(18]。的物种f . officinalis和g . flavum、个人物质提取方法大多是发达(14,20.]。m . aquifolium研究了主要的抗菌活性的存在(4 -O -甲基-α-D-glucurono) -D-xylan拥有强力的免疫调节活性21]。
在本文中,我们报告四个异喹啉生物碱的分离和测定9个植物物种为了确认公布的数据,使用其他分析方法获得的。调查的七个物种从未使用UPLC分析。这项研究也是为了进行识别的新生物碱植物种类调查。UPLC法被选为是准确的,准确的,可再生的,并允许根据鉴定化合物组分/ MS谱。
2。实验
2.1。材料和化学物质
小檗属植物thunbergii,Chelidonium majus,静脉延胡索,荷色牡丹海棠,Fumaria officinalis,Glaucium flavum,Macleaya cordata,十大功劳aquifolium,Meconopsis cambrica收集2012年6月在卢布林Maria-Curie·斯卡洛多斯卡大学的植物园,波兰。这些标本是由安娜Bogucka-Kocka教授(身份验证凭证标本:ds - 0612, fo - 0612 gf - 0612 cc - 0612, BT -。马0612,- 0612,- 0612 cm - 0612,并宏观- 0612)。参考化合物protopine (P), (B)小檗碱,chelidonine (CH)和血根碱(S)均为分析纯Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,美国)。每个化合物的纯度超过98%,根据制造商。乙腈、乙酸铵、甲醇梯度高效液相色谱级,和醋酸(> 98%)LC-UV-MS分色买来j.t贝克(Phillipsburg NJ)。水净化内部使用一个简单- 185与Milli-Q净水系统(微孔有限公司)。
2.2。样品制备
混合标准股票的解决方案包含protopine (P)(0.960毫克/毫升),小檗碱(B)(1.105毫克/毫升),chelidonine (CH)(1.225毫克/毫升),和血根碱(S)(1.065毫克/毫升)与甲醇在甲醇制备和稀释6不同浓度范围内(P) 4.4 - -131.5μg / ml;6.1 - -183.8 (B)μg / ml;(CH) 5.5 - -165.8μg / ml;和(S) 5.3 - -159.8μg / ml的准备校准曲线。标准的解决方案是0.22毫米膜过滤前注入。所有的解决方案都存储在一个冰箱在4°C的分析。
准备的提取是根据方法如前所述22]。5克干和地面植物材料的浸渍和80毫升的甲醇为3 - 4天。随后,甲醇倒了,添加了一个新的部分。这个过程重复了9次。最后提取后,蒸发后没有残留溶剂。获得的部分提取的总和。溶剂在飞机真空蒸发器UnipanPro部分蒸发了365到100毫升的总量。
2.3。Ultraperformance液体Chromatography-Tandem质谱(UPLC-MS /女士)
色谱条件是基于Lu et al。12)做了一些调整。UPLC分析使用水域ACQUITY UPLC系统(水Corp .,米尔福德,妈,美国)配备一个二进制泵系统,样品经理,列经理,PDA检测器(水域Corp .)。水域MassLynx v.4.1用于采集和数据处理软件。生物碱的分离提取进行了分析与本·C18柱(100毫米×2.1毫米×1.7μCorp . m),水域,米尔福德,马,美国。列温度保持在35°C。流量被调整至0.40 ml / min。使用流动相进行洗脱(醋酸铵,20毫米,调整与醋酸pH值3.0 Milli-Q水)和移动阶段B(乙腈)梯度程序如下:0 - 0.8分钟,3% B;0.8 - -1.0分钟,3 - 12% B;1.0 - -9.5分钟,12% B;9.5 - -15.0分钟,12 - 20% B;15.0 - -20.0分钟,20 - 30% B;20.0 - -21.0分钟,30% B;21.0 - -21.1分钟,30 - 80% B; 21.1–22.1 min, 80% B; 22.1–22.2, 80–3% B; and 22.2–25.0 min, 3% B. The samples were kept at 15°C in the sample manager. The injection volume of the sample was 1.0 μl(偏循环针满溢模式)。强大的针清洗解决方案(95:5、甲醇-水v/v)和一个弱针清洗解决方案(acetonitrile-water 5: 95年,v/v)使用。色谱图在240 nm和270 nm)获得5点速度,为4.8纳米的分辨率。山峰被分配的基础上他们的保留时间,充电质量比(m / z质/ MS)和分散模式,相比那些参考化合物和文献数据(23]。女士分析是进行TQD质谱仪(水域corp .)配有Z-spray电喷射接口。ESI源的参数是毛细管电压3.0 kV,锥电压30 V,反溶剂气体N2800 L / h,锥气体N280 L / h,临时来源。120°C,反溶剂温度。350°C,居住时间0.6秒。分析使用一个完整的扫描模式(250 - 450年的质量范围阿姆河是扫描)。化合物在正离子模式下进行了分析。内容确定化合物的估计是基于峰面积在270 nm(+ /−含量很低(低于5%的总峰面积在270海里),+含量低(低于总量的15%峰值在270海里),+ +温和的内容(15 - 30%的总峰面积在270海里),和+ + +高含量(总峰面积的30%以上在270海里)]。小檗碱,protopine chelidonine,血根碱是量化的基础上,峰值区域,比较获得的校准曲线与相应的标准。
方法验证的准确性、精密LOD和定量限。此外,校正曲线的线性范围确定。股票的解决方案的四个标准准备和稀释到六适当浓度校正曲线的建立。回归方程是线性回归后的峰面积与相应的浓度。检测极限(LOD)和限制每个分析物的量化(定量限)测定在色谱条件下的信噪比(S / N) 3和10个,分别。盘中interday变异和选择确定发达的精度分析。三种不同浓度的解决方案(低、中、高)的标准准备。盘中变化是由分析一天七复制。Interday变异在七天检查。重复性确认来自六个样品1的解决方案准备,其中一个是注入装置(0)3、6、12、16、18、24小时访问解决方案的稳定性。 Variations were expressed by RSDs.
3所示。结果与讨论
在我们的实验中,建立分析方法应用于测定生物碱在9个物种属于小檗科和罂粟科家庭。样品的分析揭示了十九生物碱的存在。最后的识别B, CH, P和S,保留时间与可用化学标准的比较。的鉴别生物碱除了B, CH, P, S是基于检测最大值和光谱的形状。这项研究的结果发表在表1。模范UPLC色谱的b . thunbergii提取如图1。
最不分化的类群m . cambrica和d .海棠包含的两个生物碱。最富有的是c . majus八个确定的生物碱和c .静脉七个生物碱。
protopine被检测到的最低水平m . cambrica(74.4±0.4μg / g),而它的最高含量检测m . cordata(54636±2.6μg / g)。在m . aquifolium和b . thunbergii,protopine没有检测到。小檗碱中检测出的四个植物物种——调查c . majus,m . cordata,b . thunbergii,m . aquifolium。中检测出小檗碱的最低水平m . cordata(1401.4±2.4μg / g),而最高的b . thunbergii(6358.4±4.2μg / g)。
发现血根碱的最低水平c .静脉(69.0±0.1μg / g),而中发现血根碱的含量最高c . majus(7925.8±3.3μg / g)。在b . thunbergii,m . cambrica,m . aquifolium血根碱,没有检测到。Chelidonine只有在检测到f . officinalis(650.0±0.5μg / g)c . majus(51040 0±1.8μg / g)。N, N-Dimethyl-hernovine之前没有发现的植物调查。化合物被观察到m . cambrica,b . thunbergii,m . aquifolium,c .静脉,g . flavum,c . majus。Methyl-hernovine首次被发现g . flavum和columbamineb . thunbergii。根据文献数据,columbamine发生c .静脉(24),m . aquifolium(25在本研究没有证实。Methyl-corypalmine中检测出f . officinalis第一次。在这项研究中,存在fumarophycine [26]和corydamine [27在这种植物材料被确认。jatrorrhizine的存在m . aquifolium(25)和榛子蛋白质c .静脉(28,29日)也证实,但不是f . officinalis(27]。Corydine和延胡索乙素只在这项研究中被发现c .静脉但是没有在其他植物种类调查。Allocryptopine只有在检测到c . majus和m . cordata。分析证实cryptopine的存在Chelidonium majus但不是在f . officinalis(27),也m . cordata(30.]。这项研究并没有证实columbamine的存在c .静脉(23),m . aquifolium(25)和cryptopinef . officinalis(27),d .海棠(31日),而m . cordata(30.]。
UHPLC的验证方法的准确度和精密度进行LOD和定量限。回归的结果表明,所有四个参考化合物在较宽的浓度范围显示良好的线性。所有校准曲线的相关系数R2> 0.9992。钟表和定量限的四个分析物是10.0 - -47.8和33.2 - -159.6μ分别g / g。参数校正曲线以及LOD和定量限值表中给出2。
相对标准偏差(RSD %),重复性的测量,从(黄连素)的0.58%到1.25% (chelidonine)。这些值是在良好的协议与开发方法的要求。内部和interday精度对所有化合物RSD值小于3.0%,显示出该方法的重现性好。结果总结在表3。
4所示。结论
尽管进行了广泛的研究,研究物种的植物化学的成分,一些生物碱在这项研究首次检测到。这些都是cryptopine在Chelidonium majus;N, N - dimethyl-hernovineMeconopsis cambrica,小檗属植物thunbergii,十大功劳aquifolium,静脉延胡索,Glaucium flavum,Chelidonium majus;methyl-hernovine在Glaucium flavum;columbamine在小檗属植物thunbergii;methyl-corypalmine、chelidonine和血根碱Fumaria officinalis;和血根碱静脉延胡索。环境条件的变化可能的原因之一是生物碱的成分测试的植物材料,由于数据得到研究的原材料来自土耳其和中国。这些差异也可能由于所使用的分析方法,因为提取物c .静脉和f . officinalis并非由UPLC-MS / MS分析方法。
缩写
| 病人: | Protopine |
| B: | 小檗碱 |
| CH: | Chelidonine |
| 史: | 血根碱 |
| UPLC-MS /女士: | Ultraperformance液体chromatography-tandem质谱分析。 |
的利益冲突
作者声明没有竞争的经济利益。