文摘

的能力摘要blazei蘑菇干和粉菌丝的形成是评估首次antigenotoxic属性。Antigenotoxic效应在人类外周血细胞H₂O₂全身的DNA损伤检测的预处理和后处理协议彗星试验。结果显示antigenotoxic性能更好摘要blazei在介入层面,分别在治疗后。摘要blazei250年的浓度μg / mL后治疗最有效的关于其对DNA损伤的作用。修复动力学的评估显示,减少H₂O₂诱导DNA损伤的应用后15分钟答:blazei30分钟后,达到最大的效能。分析抗氧化的性质摘要blazei揭示了强清除属性和温和的还原能力,而其DPPH清除能力弱。关于我们的研究,我们可以得出这样的结论:初步结果表明antigenotoxic属性的摘要blazei和它的强大清除能力。机制其属性在体内研究中应该进一步评估。

1。介绍

摘要blazei,也被称为上帝的蘑菇,蘑菇,皇家太阳双孢蘑菇的太阳,杏仁蘑菇,或公主,来自巴西南部[1,2]。这是一个可食用的蘑菇和有益健康的影响,如预防糖尿病、高脂血症、动脉硬化、慢性肝炎(2]。摘要blazei大大用于传统医学的形式药用提取物预防和治疗癌症,它显示了强劲的immunomodulating属性(3,4]。潜在antigenotoxic和抗诱变剂活动报告。然而,的保护作用摘要blazei对众所周知的诱变剂尚未建立(5- - - - - -14]。

一般来说,蘑菇的主要成分是水(90%)、蛋白质(2 - 40%),碳水化合物(1 - 55%),纤维(3 - 32%),火山灰(8 - 10%)(灰主要由盐和钙、镁等金属)(3]。在一些生物活性多糖碳水化合物,如β葡聚糖,吸引研究人员的注意(15]。多糖phytocomplex被认为是负责其pharmacotoxicological影响(16]。Kozarski等人的结果表明,多糖提取物的药用蘑菇双孢蘑菇和就双取代巴西橡胶树作为天然抗氧化剂(17]。

环境中自由基的大量存在与氧化应激的出现有关,这是一个基础的老化和各种疾病和疾病的起始和进展(18]。过氧化氢氧化DNA损伤原因通过氢氧自由基的生产(),它可以生成多个DNA修改,如基础伤害,糖损伤、DNA蛋白质交联。这些修改可能最终导致单链和双链断裂,诱导基因毒性效应。这些改变可以影响免疫反应不仅在炎性疾病,而且在癌症19,20.]。

彗星试验是一个完善的和高度敏感的方法已被用于研究DNA损伤,可以应用于评估基因毒性和genoprotective势几种天然产物(19- - - - - -21]。同时,这颗彗星试验可用于测量单个细胞的DNA修复潜力(19]。

genoprotective活动的蘑菇可以预防和治疗中发挥重要作用的几个提到的障碍,但是很少有研究已经完成检查它作为一个可能的治疗方法(22,23]。Menoli等人观察antigenotoxic甲基显示出潜在的对DNA损伤诱导的彗星试验(8]。

基于上述发现,本研究的目的是评估潜在的基因毒性摘要blazei在人类周围白细胞体外的浓度,以确定其安全nongenotoxic浓度和进一步测试其对H antigenotoxic效应₂O₂诱导的DNA损伤。此外,目标是评估的抗氧化潜力摘要blazei使用还原能力、清除,DPPH化验。

2。材料和方法

2.1。主题

外周血样本收集的三个健康的参与者:女性,年龄在20到35年。他们没有使用香烟、酒精、药物、食品补充剂在一段时间的两个月。参与者把他们同意按照规定的道德标准的临床试验伦理委员会的制药、贝尔格莱德大学。

2.2。研究设计

在当前的研究中一个商业产品摘要blazei测试以胶囊的形式(双blazei,阿罗哈医药公司,公司,卡森城,NV,美国/圣克鲁斯、钙、美国设施)。胶囊含有蘑菇菌丝体的形式被种植在白高粱,岁,干和粉。粉末溶解在磷酸盐(PBS),搅拌30分钟在37°C,通过滤纸过滤。三个浓度的250、500和1000μg / mL是执行彗星试验实验。

2.2.1。基因毒性和Antigenotoxic评估摘要blazei由彗星试验

一颗彗星试验进行评估基因毒性和antigenotoxic属性摘要blazei蘑菇。的浓度为50μM H₂O₂被选为诱导一个一致的水平在人类周围白细胞DNA损伤。暂停人类外周血细胞是嵌入在低熔点琼脂糖0.67%,蔓延到微观的幻灯片。细胞受到以下治疗方法:(1)评估蘑菇的基因毒性,细胞接触摘要blazei在三个不同浓度(250、500和1000μg / mL)为30分钟37°C;两个协议被用来评估antigenotoxic潜力,治疗前和治疗后:(2)在治疗之前,这些细胞被孵化的摘要blazei之前他们暴露在H₂O₂(评估蘑菇的行动预防水平);(3)治疗后,这些细胞被蘑菇接触后治疗H₂O₂(评估蘑菇的行动在介入级别)。细胞治疗答:blazei为30分钟37°C,而治疗H₂O₂在4°C进行20分钟。

antigenotoxic评估,一个众所周知的抗氧化剂的溶液,在PBS槲皮素,作为一个积极的控制。槲皮素高的抗氧化剂和antigenotoxic活动之前我们测试浓度的实验条件:100年、250年和500年μ克/毫升,而H₂O₂治疗的细胞表现为消极的控制。

测试的基因毒性,细胞治疗与PBS -控制和H₂O₂作为一个积极的控制。

2.2.2。衰减动力学的H₂O₂全身的DNA损伤与摘要blazei治疗后由彗星试验

评价修复动力学在H₂O₂治疗后全身的DNA损伤摘要blazei从先前的治疗后,选择最有效的浓度测试。20分钟后H₂O₂(50μ在4°C M)治疗,细胞治疗答:blazei在孵化37°C 4时间:15、30、45、60分钟. .同时,积极控制,细胞治疗与PBS和检查间隔。

2.3。单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)

细胞中使用不同治疗方法的可行性和台盼蓝排斥法检查。估计的死细胞分数,细胞样本沾0.4%台盼蓝在PBS溶液。的数量中(死)细胞在2000细胞是指望血球计。细胞的生存能力是90%以上。

彗星试验进行了基本描述,辛格et al。24]。简单地说,6μL(全血样品是悬浮在0 67%低熔点琼脂糖(LMP) (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和用移液器吸取到superfrosted显微镜玻片预镀一层1%的normal-melting-point琼脂糖(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼),由盖玻片,传播和维护巩固5分钟在冰箱里。轻轻地将盖玻片后,细胞悬浊液对幻灯片处理测试蘑菇和H₂O₂如上所述的三种提到的实验。治疗后,所有幻灯片都覆盖着的第三层0,5% LMP琼脂糖又可以巩固在冰箱里5分钟。切除盖玻片后,幻灯片被放置在寒冷的赖氨酸溶液(2、5 M氯化钠,100毫米EDTA, 10毫米三,特里同X 100 1%和10%二甲亚砜,pH值10调整与氢氧化钠)一夜之间在4°C。第二天,幻灯片从赖氨酸溶液取出,放置在水平凝胶电泳槽(CHU2制造商,连接到一个电源供应器601年每股收益),充斥着冷新鲜电泳缓冲(10 M氢氧化钠,200毫米EDTA)允许变性的DNA电泳前30分钟。电泳是在变暗的光进行25 V和300毫安30分钟,之后和幻灯片和溴化乙锭染色,表现被辛格et al。24]。彗星使用50奥林巴斯显微镜观察和分析(奥林巴斯光学有限公司GmbH德国汉堡),配备100 x放大荧光记录装置。

彗星的数量被用作参数,反映了DNA损伤。细胞核的细胞,就像彗星,被眼睛检查分级成5类,根据DNA损伤的程度不同,所描述的安德森et al。19代表(1)类:未损坏的细胞没有彗星的尾巴(< 5%受损DNA);(2)乙级:低级损害(5% - -20%);(3)丙级:中级损害(20% - -40%);(4)类D:高水平的损害(40% - -95%);和(5)类E:总破坏(> 95%)。彗星试验的幻灯片准备与不同种类的彗星在图给出1。DNA损伤为特征作为移植DNA损伤时超过5% (B + C + D + E彗星类)。均值计算100年彗星总/主题(从100年的平均数量在每两个幻灯片),对于每一个实验。凋亡和坏死细胞被排除在分析之外。

2.4。还原能力测定

还原能力是决定根据Oyaizu的方法(25]。每一个浓度答:blazei(0062 - 2毫克/毫升)在50% DMSO溶液与去离子水混合2,5毫升的200毫米/ L钠磷酸盐缓冲剂(pH值6,6)和2 5毫升10毫克/毫升铁氰化钾,和混合是在50°C的环境中为20分钟。后来2、5毫升100毫克/毫升三氯乙酸被添加到混合然后离心机10分钟。上层和5毫升的去离子水和1毫升1毫克/毫升氯化铁;然后吸光度是测量在700海里一片空白。吸光度值越高表示更高的还原能力。丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)作为标准。的浓度摘要blazei用于分析和二叔丁基对甲酚的0.019,0.039,0.078,0.156,0.132,0.625,1.25,2.50和5.00毫克/毫升。

2.5。测定DPPH自由基清除能力

清除能力1日,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl自由基(DPPH)决心根据岛田的方法等。26]。每一个浓度答:blazei(0062 - 2毫克/毫升)与1毫升50% DMSO溶液混合methanolic解决方案包含DPPH (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)自由基,导致最终浓度为0,2毫米/ L DPPH。混合大力动摇了,在黑暗中站了30分钟。然后吸光度是测量在517海里一片空白。清除能力计算如下: 集成电路₅₀值(毫克/毫升)显示的有效浓度50%的DPPH自由基抑制和插值得到的线性回归分析。Trolox作为比较的标准。的浓度摘要blazei和Trolox用于分析的0.062,0.125,0.250,0.500,1.00和2.00毫克/毫升。

2.6。测定羟自由基清除活性

氢氧自由基的影响化验使用2-deoxyribose氧化方法中描述的钟et al。27]。2-Deoxyribose由氢氧自由基氧化所形成的芬顿反应和退化的丙二醛。反应混合物中含有0,45毫升0,2 M磷酸钠(pH值7日6),0,15毫升10毫米2-deoxyribose, 0, 15毫升10毫米FeSO4-EDTA, 0, 15毫升10毫米过氧化氢,蒸馏水的0525毫升,0075毫升(0062 - 2毫克/毫升)答:blazei管解决方案。反应是由添加过氧化氢。孵化后37°C 1 h,反应停止通过添加0,75毫升的8% (w / v)三氯乙酸和0,75毫升的1.0% (w / v)的硫代巴比土酸。混合物煮10分钟。,cooled in ice, and then measured at 535 nm. The reaction mixture not containing test sample was used as the control. Trolox (0,0078–2 mg/mL) was used as standard antioxidant. The scavenging activity on hydroxyl radicals was expressed as follows: 集成电路₅₀值(毫克/毫升)的有效浓度50%的2-deoxyribose退化,从线性回归分析得到的插值。Trolox作为比较的标准。的浓度摘要blazei和Trolox用于分析的0.007,0.015,0.031,0.062,0.125,0.250,0.500,1.00和2.00毫克/毫升。

2.7。统计分析

执行的统计分析是利用克鲁斯卡尔沃利斯测试中,邓恩的事后比较不同的治疗和相应的控制。数据表示为平均值±标准平均误差(SEM)。一个区别被认为是具有统计学意义。GraphPad棱镜(5.0)统计软件(美国GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)是用于分析。

3所示。结果

3.1。基因毒性的属性摘要blazei

在评估潜在的基因毒性摘要blazei,发现应用于agarose-embedded血细胞浓度的测试范围没有增加DNA迁移相比,负(即控制。PBS)(图2)。此外,对于所有的测试浓度,主要病变的基底水平减少控制。基于我们的研究结果,摘要blazei在测试浓度表示缺乏基因毒性效应。

3.2。Antigenotoxic的属性摘要blazei

antigenotoxic的影响摘要blazei检查下两个实验协议:预处理前蘑菇H₂O₂接触和后处理后的蘑菇治疗H₂O₂导致氧化DNA损伤通过氢氧自由基的生产()。

图3(一个)表明,预处理的应用显示的蘑菇轻微受损细胞的平均数量的减少,在500的浓度μg / mL相比,表现出显著的衰减控制(细胞治疗50μM H₂O₂)。有趣的是,u型浓度趋势可能注意到的预处理衰减引起的DNA损伤H₂O₂。

后处理条件显示在图3 (b)。结果表明,所有三个浓度显著降低细胞的数量与DNA损伤(),显示一个antigenotoxic的效果摘要blazei干预水平。

图4显示了积极的结果控制的细胞治疗与100年,250年和500年μ槲皮素的g / mL, DNA受损细胞的百分比浓度的方式降低了预处理和后处理实验。然而,antigenotoxic槲皮素在治疗后的实验,更深刻的效果。

根据治疗后的结果摘要blazei,250的浓度μg / mL被选为最有效的干预行动水平。它后来被用来研究DNA修复的时间进程(H的补偿动力学₂O₂诱导的DNA损伤)。衰减的结果H₂O₂全身的DNA损伤4倍周期:15、30、45、60分钟,在细胞治疗答:blazei和控制,呈现在图5。在控制细胞被提到的孵化期后没有任何额外的治疗H₂O₂曝光,H的水平₂O₂全身的DNA损伤没有显著降低(图5(一个)),尽管数据显示,未经处理的细胞显示可能减弱DNA损伤。然而,应该注意的是,在的存在答:blazei在时间点15、30和45分钟,有明显的衰减H₂O₂诱导损伤(图5 (b))。

3.3。还原能力测定摘要blazei

的还原能力答:blazei呈现在图6。在测试浓度(0062 - 5毫克/毫升)答:blazei显示浓度温和的还原能力相比,二叔丁基对甲酚作为控制能力。

3.4。DPPH自由基清除活性的测定摘要blazei

的彻底清除的影响答:blazei展示在表1。结果表明,答:blazei在本测试中使用浓度没有自由基清除活性。的自由基清除活性答:blazeiTrolox相比,合成抗氧化剂。答:blazei2毫克/毫升显示只有3%的抑制DPPH。

3.5。羟基自由基清除活性的测定摘要blazei

图7显示了氢氧自由基清除效果取决于2-deoxyribose氧化方法。的清除效果答:blazei对氢氧自由基对所有测试显示,50%抑制浓度高于0196毫克/毫升(IC₅₀= 0196毫克/毫升),而Trolox作为标准同时显示,60%抑制浓度。这些结果表明一个优秀的氢氧自由基清除活性摘要blazei。

4所示。讨论

在这项工作中,我们评估了基因毒性和antigenotoxicity效果答:blazei人类外周血细胞。使用一个简单的和可复制的DNA链断裂测量技术,彗星试验。与其他大分子相比,DNA是一个敏感的分子和损伤可能导致接触外源性代理。长期或重复DNA损伤和基因组不稳定性会引起多种疾病包括癌症(28]。

在当前的研究中,没有基因毒性的影响答:blazei在人类外周血细胞的测定。这是同意的报告Radakovićet al。29日)和Guterrez et al。10,12]。即细胞蘑菇的暴露在我们的实验中甚至会导致减少基线水平的DNA损伤。与此同时,有益的作用摘要blazei在减少H₂O₂诱导的DNA损伤在全血细胞。作为一个积极的控制使用槲皮素。槲皮素是一个标准的抗氧化剂,有效地减少了H₂O₂全身的DNA损伤(30.]。DNA损伤的减少槲皮素在这个实验中证实活性氧攻击DNA构成链断裂的起源。因此,它可以指出摘要blazei也表现出了自由基诱导DNA链断裂的有效衰减。

阐明的antigenotoxic行动背后的可能机制答:blazei,两种方法都是为了调查蘑菇是否可以预防和干预的水平。在预处理条件下,答:blazei加入细胞管理氧化剂前30分钟,让他们成为积极的预防水平(31日]。在预处理条件下蘑菇可能通过增加细胞的抗氧化能力,使他们更耐氧化DNA损伤(32]。预处理的结果显示适度能力降低DNA受损细胞的数量,在500年μ克/毫升浓度表现出显著的保护作用对H₂O₂。它是由德Sa-Nakanishi显示et al。33)的管理答:blazei是保护老老鼠的大脑对氧化应激通过增加大脑酶抗氧化能力,对他们的活动表现出诱导的影响。此外,行动的答:blazei预处理对扑热息痛受伤的老鼠表现出的能力提高过氧化氢酶的水平(34]。

另一方面,后处理数据显示显著降低细胞的数量与DNA损伤检测浓度的介入活动表现突出答:blazei。Antigenotoxic的影响答:blazei观察治疗后可能会分配到独立机制的协同行动可能造成的DNA损伤:减少自由基清除和DNA修复的刺激。

它已经建立,蘑菇可以展示他们的抗氧化特性的生化氧化过程的不同阶段和不同的机制(35]。考察了研究中的抗氧化性能降低幂法和氢氧自由基和DPPH自由基清除能力。的还原能力摘要blazei显示浓度趋势,是0,3 2毫克/毫升也被认为是一个温和的力量。这是依照以前的结果显示蔡et al。36]证明类似ethanolic提取物的还原能力答:blazei。

清除能力是重要的抗氧化剂防止自由基的反应活性高。我们的数据对DPPH清除显示活动的能力答:blazei非常温和。这可以解释为天然化合物的抗氧化活性与其结构有关,和可访问性的激进的中心可能会影响他们的抗氧化能力37]。应该强调,我们评估的能力摘要blazei作为一个蘑菇干和粉溶解在PBS菌丝体的形式,所以它的化合物的结构会影响其抗氧化能力。通过蔡et al。36)表现出不同的抗氧化性能答:blazei依赖于提取过程。另一方面,答:blazei在我们的研究显示明显哦扫气属性浓度高于0196毫克/毫升。氢氧自由基是最被动的化学物种已知诱导氧化损伤蛋白,脂质和DNA。因此,哦扫属性的化合物在生物系统极为重要。应该注意的是,应用程序的答:blazei在后处理彗星试验提供最好的250年衰减的DNA损伤μ克/毫升浓度,同时显示,70%抑制哦激进。

为了评估未来的机制,可能导致后处理效率、时间的细胞中DNA修复治疗的最佳浓度摘要blazei研究并与未经处理的细胞(只接触PBS)。与蘑菇数据显示,治疗后明显下降的水平细胞的DNA损伤15日30日和45时间进程,而细胞治疗只有PBS没有显示DNA损伤的显著减少在同一时间内。应该提到类似的趋势减少DNA损伤检测的实验条件:减少观察DNA损伤已经在15分钟,45分钟后达到最大限度的减少。先前的研究表明,重要的修复DNA损伤发生后1小时内暴露于氧化代理(38]。因此,这些结果表明,摘要blazei可能大大刺激DNA受损细胞的修复过程,香菇,细胞的修复能力比未经处理的细胞的修复能力更高效。研究Da Silva et al。39)的保护作用β葡聚糖提取摘要blazei表达的基因ERCC5(参与切除修复DNA损伤)HepG2细胞。

记住可以解释为预处理效率摘要blazei属性,能够提高细胞的抗氧化能力,可能协同(额外)后治疗的作用机制可能是抗氧化酶刺激。

以前的研究结果总结,摘要blazei活动介入水平可以归因于其清除属性,刺激DNA修复,以及额外的抗氧化酶激活。应该特别强调,第一次发现摘要blazei有很强的潜力减少哦。

我们的研究是作为一种体外进行测试,这应该有助于突出摘要blazei作为一种抗氧化剂,对抗氧化应激对DNA的影响。根据这些研究结果,有必要进行进一步调查其在体内的系统属性。

5。结论

摘要blazei正在调查中广泛的应用。这个初步的研究显示antigenotoxic性质摘要blazei在人类外周血细胞对H₂O₂全身的DNA损伤的介入的水平。第一次,这是显示摘要blazei有很强的哦,清除属性。机制antigenotoxic属性在体内研究中应该进一步评估。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究受到了教育部、科学和技术发展的塞尔维亚(格兰特OI173034)。