文摘

本研究的目的是评估antidegenerative效应仅在eriocitrin骨关节炎损伤和eriocitrin制定创新”饮食类黄酮补充。“eriocitrin之间的络合和羟丙基β环糊精的溶解/冷冻干燥方法。复杂的解决方案被相溶解度的研究和评估最优1:2黄烷酮/环糊精摩尔比率被选中。羟丙基β环糊精能够复杂eriocitrin证实了紫外可见吸收、DSC、红外光谱研究。复杂的形成增加了eriocitrin水溶性(从g·L⁻¹来g·L⁻¹)和溶解率在30分钟(从37.0%到100%)。体外研究展览eriocitrin及其复杂的观念抑制年龄以类似的方式,因为羟丙基β环糊精不会干扰黄烷酮的内在属性。相反,环糊精的存在提高了eriocitrin抗氧化稳定性维持高荧光值,直到8小时对纯材料。此外,羟丙基β环糊精显示中度笑料恢复代理多元复合的增效剂维持软骨细胞结构的完整性。结果指出,ERT / HP-betaCD复杂拥有技术和生物学特性能够获得一个容易可溶性营养产品,减少了退行性和氧化损伤发生在骨关节炎,,提高病人的依从性。

1。介绍

骨关节炎(OA)是一种进行性退化性关节疾病高对生活质量的影响。在营运过程中,体内关节组织结构和功能的变化。在文献中,据报道,氧化应激是极其增加OA和它负责疾病的发病机理(1]。氧化损伤可能是由于软骨细胞衰老和软骨老化(2,3),损失的细胞外基质(ECM)营业额和增加基质金属蛋白酶(MMPs)和细胞因子的生产4]。

此外,先进的糖化终端产品(年龄)积累在许多组织,包括关节,与氧化应激,导致办公自动化的发展5]。事实上,年龄水平升高导致扩增软骨细胞基质金属蛋白酶的生产,特别是胶原酶,进而诱导软骨退化和释放的蛋白聚糖(PG)碎片6]。

在这些基地,减少氧化应激、年龄积累,和PG释放可能代表一个好的治疗方法预防OA软骨破坏的。

最新的研究表明,“有意识的营养”从水果和蔬菜可以能够及时保护骨量(7]。保健品和膳食补充剂是从草药发挥重要作用在炎症和关节破坏OA (8]。事实上,由于风险因素有穷人中摄入天然抗炎化合物等一些类黄酮,抗氧化剂,和必需脂肪酸,OA也包括医学营养治疗计划与天然成分的混合从植物化学的食物9]。市场制定两个多酚的混合物,黄芩黄素和儿茶素,分别活跃在抑制环氧酶和脂氧合酶在体外和体内动物模型,是用于治疗慢性OA (10]。此外,在文献中,据报道,很多柑橘类类黄酮抑制软骨退化过程,通过抑制基质金属蛋白酶(11),减少粘多糖(笑话)释放和一氧化氮(NO)水平的恢复12]。

本研究的目的是探讨antidegenerative eriocitrin效果(ERT)(图1(一)),黄烷酮糖苷大量存在于水果柠檬和酸橙(13]。我们开发了一个创新的容易处理粉配方改进的ERT技术特征产生一个新的“饮食类黄酮补充”能够保护从OA损伤和提高病人的依从性。类黄酮在治疗使用的限制是由于其低水溶性,特点导致很低的溶解率和体内吸收不规则服用时口服固体剂型(14,15]。出于这个原因,羟丙基β环糊精(HP-betaCD)(图1 (b))是用来开发ERT /羟丙基β环糊精包含复杂容易可溶性粉的ERT膳食补充剂和稳定。HP-betaCD是可溶性的导数β环糊精和在文献中被选中,因为据报道,形成包含复合物与类黄酮和提高水水溶解度和溶解速率(16- - - - - -18]。此外,HP-betaCD似乎是有用的在许多疾病相关,增加笑料19,20.与PG),也参与OA。

为了建立ERT: HP-betaCD摩尔比、相溶解度的研究应用和体外溶解测试分析上也表现ERT及其包含复杂。

评估的能力独自黄烷酮、黄烷酮制定保护OA的损害,我们化验抗氧化功效(氧自由基吸收试验)和antiglycation活动。的能力,以防止粘多糖(笑话)释放与interleukin-1人类关节软骨细胞的刺激β(il - 1βOA的)细胞模型21,22)也被评估。

2。材料和方法

2.1。化学物质

Eriocitrin (ERT)是由Sigma-Aldrich(意大利米兰)。羟丙基β环糊精(HP-betaCD)从Cyclolab购买(Cyclolab环糊精研究与开发实验室,匈牙利、中分子量:8500克摩尔⁻¹)。所有其他化学物质使用的试剂级。

2.2。相溶解度的研究

Eriocitrin溶解度。ERT曾决定在水中的溶解度(g·L⁻¹)如下:过量的原始ERT被引入一个包含50毫升溶剂瓶;根据“摇瓶法”(23),样品动摇了3天,然后储存在室温下(25°C) (24]。3天后,溶解量的高效液相色谱法测定黄酮类和上层清液的紫外方法解决方案之前过滤。

紫外吸收法。紫外可见检测执行根据我(Q2 (R1))指导和验证统计使用%相对标准偏差(%相对标准偏差)。活跃的上层清液浓度是评估通过测量吸光度ERT 1毫米284海里的细胞(紫外可见1601年日本岛津公司欧罗巴,杜伊斯堡,德国)。溶解物质的浓度在示例计算Lambert-Beer法律根据USP 37: 在哪里吸光度的1 g / 100毫升1% (w / v)解决方案在1厘米细胞,溶液的浓度(g / 100毫升),然后呢的路径长度的细胞样本举行。

验证方法,活性浓度计算使用标准的校准曲线。线性。吸光度与浓度之间的比例是验证在室温在5个浓度水平的25.0到250.0 mg·L⁻¹(,,在那里吸光度和是使用的浓度)。参考标准的解决方案准备一式三份和5毫升的每个解决方案分析了一式三份,结果表示为%平均值±%相对标准偏差。

高效液相色谱法。ERT浓度也评估了一个高效液相色谱仪器(瓦里安瓦里安Prostar mod。230年,米兰,意大利)配有20μL Rheodyne 7125喷射阀(Rheodyne,加利福尼亚州,美国)autosampler瓦里安mod。D10(瓦里安、米兰、意大利)和一组紫外可见检测器284软件进行测试。色谱分析在LiChrospher®100 C18RP列(颗粒大小5μm;250×4毫米的ID;默克公司,达姆施塔特,德国),配有5μ100 LiChrospher C18RP警卫队列(ID 4×4毫米;默克公司,达姆施塔特,德国)和筛选了isocratically室温。的流动相由50:50 (v / v)甲醇/水混合物;流量被设定为1.0毫升/分钟。线性。参考标准的解决方案准备一式三份五个浓度水平(0.1 - -1.0μg·毫升⁻¹)。20μL一式三份的每个解决方案进行了分析。使用线性最小二乘回归方程分析了标准曲线来源于峰值区域(,),峰面积和吗是所使用的浓度。特异性。峰值与ERT被coinjection被保留时间和确认,以及紫外线(紫外可见1601年日本岛津公司欧罗巴,杜伊斯堡,德国)。

等温线溶解度和稳定常数。包含复杂的溶解度相图测定Higuchi和康纳斯的方法25]。过量的ERT (1.0×10⁻³摩尔)悬浮在100毫升的水然后HP-betaCD不同数量的摩尔比率1:0.25,1:0.5,1:1,1:1.5,1:2和1:3 (ERT / HP-betaCD)补充道。为每个摩尔比率是准备6个样本,动摇,储存在25°C,然后检查15岁,30、45、60、75和90分钟离心5分钟后在3000 rpm。分析了浮在表面的紫外线设备在1厘米细胞284海里,1小时后,平衡了。

每个实验进行了一式三份(RSD < 3%)。

2.3。复杂的制备和表征

制备固体的复杂。ERT / HP-betaCD固体复杂与溶解/冷冻干燥方法制备(26)如下:2×10⁻⁴摩尔的ERT悬浮在100毫升的水,然后用4×10了⁻⁴HP-betaCD摩尔。存储的样本是漩涡,持续60秒,1小时−4.0°C,和冻干24小时获得包合物ERT / HP-betaCD。

吸收光谱。吸收光谱的ERT / HP-betaCD复杂(2:1克分子比)和原材料是用日本岛津公司uv - 1601紫外可见光谱仪模型。摩尔浓度检查2×10⁻²摩尔对ERT和4×10⁻²HP-betaCD摩尔。

药品内容和包容效率(IE)。药物含量和IE ERT / HP-betaCD被紫外线和高效液相色谱法进行评估。

紫外线的方法。样品(2毫克)的复杂的被溶解在3毫升的水和漩涡,持续60秒。药物含量确定spectrophotometrically(紫外可见1601年,日本岛津公司,妈,美国)284海里(1毫米细胞;先进的产品Srl SpectraComp 602年,意大利米兰)。每分析一式三份,结果被表示为平均值。通过高效液相色谱法分析值重合。

高效液相色谱法。三个样品(2毫克)的ERT ERT / HP-betaCD物理混合物(ERT / HP-betaCD混合),和ERT / HP-betaCD复杂被溶解在3毫升H₂O,涡60秒,在3000转离心5分钟。上层清液的浓度确定解决方案使用相同的色谱条件下一节中描述的先例。每个分析进行了一式三份,结果,表示为平均值,被发表在表1。

包含效率(IE)计算比率的实际药物内容(ADC)理论药物内容(TDC)冻干复杂(表1)。

差示扫描量热法(DSC)。原材料,ERT / HP-betaCD混合,ERT / HP-betaCD复杂通过差示扫描量热法分析了铟校准梅特勒-托利多DSC凝视(梅特勒-托利多,哦,美国)。温谱图记录通过将精确给定的数量(1 - 2毫克与微量天平称重MTS梅特勒-托利多,哦,美国)每个样本的40岁μL铝锅密封和穿。样本扫描(10°C / min) 25到350°C (27]。熔化温度()和熔化热()测量。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)。傅里叶变换红外光谱得到使用Jasco ft - 300(日本东京)傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪。复杂的CD / IDB和原材料的样本分析KBr光盘的光谱区400 - 4000厘米⁻¹。

2.4。体外溶出研究

复杂的样品对应2.4毫克的ERT(水槽条件)进行了分析spectrophotometrically284海里的水。

体外溶解释放的ERT测试/ HP-betaCD复杂在1000毫升的水进行下沉的条件下(对应于2 g / L (ERT)使用SOTAX在智能设备(巴塞尔,CH)与分光光度计在284 nm (PerkinElmer仪器紫外可见光谱仪λ25日,妈,美国)和USP 37溶解试验装置n。2:桨,100 rpm在37°C。所有解散/释放测试进行了一式三份;图中只有平均值。

ERT独自ERT / HP-betaCD物理混合物(ERT / HP-betaCD混合)被用作控制。

2.5。抗氧化效率(氧自由基吸收试验)

修改后的氧自由基吸收能力(ORAC)分析是用来确定抗氧化剂的ERT质的活动,HP-betaCD, ERT / HP-betaCD复杂[11]。测试化合物(25μL)被放置在96 -组织培养板。150年μL(荧光素(FL) (10 nM)作为调查评估抗氧化活性。25μL水溶性偶氮化合物的2,2′-azobis (2-amidinopropane)盐酸盐(AAPH 100毫米)作为一个激进的发起者产生自由基以恒定速率。积极的控制(FL解决方案包含AAPH),一个消极的控制(FL解决方案包含没有AAPH),和所有的样品测试(1毫克·毫升⁻¹)同时运行。计时器开始引入自由基生成和存储的板是在黑暗中在37°C。在每一个指定的时间点,解决方案的荧光测量(励磁492海里,发射535海里)使用Wallac 1420维克多3 96孔板读者(美国PerkinElmer)荧光计和策划作为时间的函数与起源®7(美国北安普敦OriginLab公司)。的设在图划分如下:5000年到6000年RFU。

2.6。Antiglycation活动

荧光产生的时代形成的抑制通过美拉德反应28)是评估。蛋白质模型牛血清白蛋白(BSA)(10毫克/毫升)孵化与果糖(0.5米)磷酸盐缓冲剂(50毫米,pH值7.4)(NaN₃0.02%)获得积极的控制。BSA独自年龄相对应的负控制没有荧光的形成。氨基胍(AMG) (400μg / mL)作为参考化合物因其年龄抑制房地产(29日]。最后的糖化BSA的解决方案(300μL)单独和ERT、HPBCD或ERT (400 / HPBCD复杂μg / mL)于96年在37°C的环境,微量滴定板与硅盖子关闭7天。年龄在荧光测量(370海里;440海里)进行使用维克多Wallac 1420 Multilabel计数器荧光计(美国PerkinElmer)。报告的结果是相对荧光单位(RFU)和抑制对积极的比例控制与果糖(BSA)和计算从以下方程:

2.7。生物细胞试验

2.7.1。人体关节软骨细胞培养

正常的人类关节软骨得到从健康置换手术患者(30 - 40岁)和股骨颈骨折意外。知情同意之前。分离过程是在杀菌条件下进行的。软骨切成小碎片,仔细清洗使用杜尔贝科的修改包含NaHCO鹰的媒介(DMEM)₃丙酮酸钠,消息灵通的25毫米,1毫米,50毫克/毫升庆大霉素100 U·毫升⁻¹青霉素、100 mg·毫升⁻¹链霉素和2.5 mg·毫升⁻¹两性霉素b .软骨细胞分离通过三个连续的段落的酶消化细胞外基质:孵化0.1%透明质酸酶III型(1毫克·毫升⁻¹100毫克的软骨),30分钟37°C;孵化与链霉蛋白酶类型十四(5毫克·毫升0.5%⁻¹100毫克的软骨),60分钟37°C;最后,孵化0.2%胶原酶IA型(2 mg·毫升⁻¹100毫克的软骨),45分钟在37°C。获得细胞悬浮液过滤(过滤器从100和70毫米)来消除残留的消化、细胞聚集。刚分离软骨细胞被播种在单层培养的细胞密度细胞和培养1毫升10%胎牛血清的DMEM补充(的边后卫)37°C公司5%₂空气/ 95% (30.]。基本文化汇合的软骨细胞是镀和治疗如下:未经处理的控制,il - 1β10 ng / mL积极控制,和测试的化合物(ERT HPBCD, ERT / HPBCD复杂),溶解在DMSO和适当稀释杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)两个最终浓度(10μg·毫升⁻¹和100年μg·毫升⁻¹)。48和72小时后,软骨细胞文化的上层清液收集不同的化验。

2.7.2。细胞生存能力分析

实验物质的细胞毒性效应是由一个细胞生存能力评估测试劈理的基础上3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)有代谢活跃的细胞线粒体脱氢酶(31日]。

2.7.3。决心的笑话

软骨损伤的笑话,一个索引,通过分光光度法测定溶液1,9-dimethylmethylene蓝色nm。葡糖氨基葡聚糖的含量计算从标准曲线(100 - 500年μg / mL)获得了鲨鱼硫酸软骨素C,来源于鲨鱼软骨(32]。

3所示。结果与讨论

ERT制定的HP-betaCD聚合物获得复杂活跃在骨关节炎疾病和改善其水溶解度和溶解速度。

3.1。相溶解度的研究

穷人水ERT溶解度(g·L⁻¹)在室温下被HP-betaCD的存在明显影响。事实上,ERT / HP-betaCD复杂的显示,水溶性的g / L。根据康纳斯和Higuchi [25],HP-betaCD的存在给出了a类型相溶解度概要文件的典型可溶性环糊精与积极的偏离线性(Ap-type,图2)。这表明复杂的一阶与基质相比,但第二次或高阶与配体。最常见的化学计量学与美联社概要1:2主动/ HP-betaCD克分子比复杂。

出于这个原因,传统,我们假设1:2 ERT / HP-betaCD克分子比获得一个包含复杂的(ERT / HPBCD复杂)的溶解/冻干方法。

3.2。紫外可见吸收研究

水溶液中的交互的ERT和HP-betaCD可以检查通过比较紫外可见光谱的ERT与包合物(图3)。可能包含和noninclusion形式并存的解决方案,所以我们执行这个测试水的高度可溶与ERT复合物。接受方根据频谱和与羰基集团的电子跃迁α的芳环(33]。强烈的最大峰值在284 nm(称为乐队II)与肩在327 nm(称为带我)。只有在ERT / HP-betaCD复杂是一个轻微的修改两个吸收波长值的最大和。另外,修改的吸收带我指出(从327纳米到330)。根据文献数据对其他类黄酮类似物的ERT (34),测量进行了考虑带二世的ERT。添加HP-betaCD导致蓝转移2 nm(从284纳米到286纳米)和增色效应(k波段降低强度)。这些结果可能是由于ERT纳入HP-betaCD腔表明ERT / HP-betaCD复杂地层较差的债券(35]。

3.3。药品内容和包容效率(IE)

实际的ERT内容值由紫外线和高效液相色谱法分析都以完美的协议。ERT样品的范围的百分比来(),表明它是均匀分布(表1)。

3.4。DSC和红外光谱分析

DSC方法揭示了一些信息在主客体固体交互。发生络合的证明通常是通过药物的强度降低或消失融化温度(36]。ERT(图4)显示广泛的吸热事件35和90°C之间由于水分损失。“熔点”相变峰附近检测到152°C (135°C)。在其他类黄酮,这可能是由于分子重排的ERT变形在一个塑料物质(37]。峰值出现在250°C是由于ERT分解。HP-betaCD和ERT / HP-betaCD混合物(ERT / HP-betaCD混合)展览一个吸热的事件范围内的40 - 110°C,因为水的损失。此外,在ERT / HP-betaCD混合ERT低融化峰值强度可能是由于HP-betaCD amorphized ERT熔化温度低。冷冻干燥的ERT / HP-betaCD系统ERT信号消失明确确认复杂的形成。

络合过程与环糊精的ERT已经证实了红外光谱(图5)。红外光谱谱的ERT / HP-betaCD复杂显示峰值模式差异对原材料。红外光谱谱的ERT显示一个乐队在2925.2厘米⁻¹由于CH-aliphatic振动。乐队在1643.4,1622.1,和1531.4厘米⁻¹对应于债券- C = C的芳香。吸收乐队在1000 - 700厘米⁻¹间隔特定的脉动振动glucopyranosyl变形振动的单位和碳氢键(34]。在3390厘米HP-betaCD信号⁻¹,2931.5厘米⁻¹,1159厘米⁻¹,1082厘米⁻¹对应于对称,伸展运动,反对称ν(哦),ν(CH₂),而ν(CC)和弯曲ν(哦)现象,分别36]。的特征信号组件的ERT / HP-betaCD混合都是明显的,表明弱或没有互动ERT HP-betaCD当身体好坏参半。任何新的山峰中发现了ERT / HP-betaCD复杂的光谱;HP-betaCD信号较低的领域转移确认物理交互由于弱氢键的存在。相反,两人都没有显示带典型的强度和位置。特别是,ERT信号在1640.3和1622厘米⁻¹消失,而信号转变(1600 - 1550厘米⁻¹C = C价苯环上的振动;950 - 750厘米⁻¹,间隔特定脉动振动glucopyranosyl单元和碳氢键)及其强度的变形振动强烈降低。这些结果说明包含的ERT环糊精的空腔和黄烷醇之间的氢键的形成和HP-betaCD。

3.5。体外溶解/发布测试

解散/发布概要文件的ERT从ERT HP-betaCD复杂相比,解散概要的ERT / HP-betaCD混合和整洁的ERT图在水中6。结果显示一个标准偏差< 5%。

所有的加载剂量(100.0%)的ERT 30分钟从ERT / HP-betaCD被释放,而大约65.0%的黄烷酮溶解从ERT / HP-betaCD混合和只有37.0%的ERT单独溶解在同一时间。这些结果可以解释为增加导水相互作用由于可溶性HP-betaCD聚合物的存在能够复杂ERT和改善药物润湿性和水溶性。开发的水溶性粉末的技术特点可以提高患者依从性降低不适吞下固体剂型。

3.6。抗氧化效率

验证能力的ERT / HP-betaCD配方保持或延长活动包括化合物的抗氧化能力,我们使用氧自由基吸收试验。

图7报告荧光值(RFU)在一个函数的时间(小时)的测试化合物。导和ERT / HP-betaCD复杂拥有好的能力延迟减少脂肪肝的荧光。特别是,HP-betaCD ERT纯材料2和6小时后失去效果,分别ERT / HP-betaCD复杂维护高荧光值直到8小时(1980海里)。这一趋势表明,配方提高了ERT抗氧化稳定性,确认其高清道夫激进的效果。

3.7。Antiglycation活动

在文献中,据报道,氧化/ nitrosative压力和炎症,发生在OA疾病(38),诱导组织年龄积累导致ECM组件的属性修改(39,40与顺向软骨退化[]41]。

在此基础上,我们评估了抑制作用的ERT和ERT / HP-betaCD复杂的年龄形成(图8)。样品减少积极的最大荧光值控制与果糖(BSA),相比之下,独自HP-betaCD展品相同的荧光值。这表明所使用的环糊精不会干扰导的固有特性。事实上,ERT单独或制定年龄表现出良好的抑制能力形成以77.3%和75.3%的抑制(荧光值3006 nm和3269 nm),分别维护一个荧光值高于参考试验标准AMG (40%)。

3.8。细胞试验

il - 1β是不同的促炎细胞因子参与激活细胞OA介质,一氧化氮(NO)、前列腺素E₂(铂族元素₂)和基质金属蛋白酶,导致结构胶原降解大分子,像笑话12]。事实上,刺激软骨细胞il - 1β(10 ng·毫升⁻¹)作为细胞模型,办公自动化测试化合物的能力保护软骨退化过程。

3.8.1。MTT试验

MTT试验进行评估与测试化合物在治疗后细胞生存能力。结果表明,治疗72小时减少软骨细胞代谢的能力四唑在使用浓度(10μg·毫升⁻¹和100年μg·毫升⁻¹)。相反,治疗10μg·毫升⁻¹48小时不干扰细胞生存能力(数据未显示)。这剂量可用于评价化合物的笑话效果。

3.8.2。石斑鱼水平测定

OA软骨退化过程是由于年龄之间的交联,形成于炎症/氧化应激,ECM和长寿蛋白质,造成的损失ECM组件(如笑话的水平,这代表一个细胞损伤指数(39]。

图9石斑鱼报道水平,表达μ上层清液的g / mL,软骨细胞治疗后il - 1β(10 ng·毫升⁻¹(10)和测试存在的化合物μg·毫升⁻¹)。il - 1β,负责改变细胞平衡和ECM的合成,导致失去笑料(47.7水平μg·毫升⁻¹显著升高(350)μg·毫升⁻¹在未经处理的控制。导和ERT / HP-betaCD恢复笑料的水平,保护软骨细胞的促炎细胞因子的行动。特别是,石斑鱼的ERT / HP-betaCD(349水平μg·毫升⁻¹)重叠与未经处理的控制,显示软骨细胞的结构完整性。这是由于部分HPBCD表演的影响复杂化合物的增效剂。事实上,它显示了温和的笑料恢复(198μg·毫升⁻¹)的能力与多糖形成氢键,像笑话19]。从这个结果,HP-betaCD作为治疗剂的潜在作用也出现的预防和治疗组异常积累的笑话发生代谢紊乱。

4所示。结论

炎症和氧化应激在办公自动化发展过程中扮演着重要的角色。事实上,在软骨退化,促炎细胞因子的增加,自由基,金属蛋白酶,并发生年龄积累,导致ECM组件作为笑料的释放。近年来,柑橘类黄酮类化合物被认为是药物预防OA损伤(11]。在文艺复兴的基地植物衍生品和新型健康食品消费者的兴趣,我们开发和测试一个创新的ERT / HP-betaCD包含复杂的(1:2摩尔比率)饮食类黄酮补充从事OA。结果展示ERT活动氧化/炎症和软骨退行性因素。事实上,研究类黄酮能抑制年龄形成和恢复笑料。这些ERT内在活动改善与HP-betaCD ERT是包裹时,可溶性beta-cyclodextrin还能够加强ERT溶解度,润湿性,溶解率。此外,ERT / HP-betaCD复杂的ERT抗氧化作用改善和恢复笑料。这种行为会导致体内ERT释放增加,提高其生物利用度和活动。此外,根据文献[19,20.),一种内在的活动HP-betaCD笑料的恢复也出现,表明其势函数在许多疾病的治疗和预防与笑料的失衡有关。

这种方法可能适用于获得一个临时的解决方案的ERT活跃在OA伤害和增加病人的依从性。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。