文摘
越来越多的证据正在暗示膳食成分之间的关系,微生物群,对过敏性疾病的易感性,尤其是食物过敏。可可,抗氧化剂茶多酚的来源,影响肠道微生物群,能够促进宽容在口服敏化模型。考虑到这些事实,本研究的目的是建立一个口头的影响致敏模型,单独和一起cocoa-enriched饮食,肠道微生物群。刘易斯老鼠口服敏化和美联储与标准或10%的可可饮食。通过宏基因组研究粪便微生物群进行了分析。肠道IgA浓度也决定。口腔敏感产生一些肠道菌群的变化,但在那些可可饮食喂养的大鼠出现重大修改。减少细菌壁厚菌门和变形菌门的门和一个更高比例的细菌属于Tenericutes和蓝藻门被观察到。总之,可可饮食能够修改微生物群在口头敏感细菌模式动物。可可抑制特定抗体的合成和肠道IgA,这些变化在微生物群模式中,特别是变形菌门的门,可能是部分负责的耐受性影响可可。
1。介绍
除了它的营养作用,吸入的食物影响肠道组织和越来越多的证据关于饮食之间的相互作用,免疫系统和微生物群。食物摄入量决定微生物群的构成和内脏相关淋巴组织(GALT)的功能。最后这两个因素也密切相关,所以大量的饮食改变细菌组成,从而影响免疫内稳态,反之亦然(1]。成人呼吸道肠道微生物群,包含超过100万亿个细菌和150倍的基因数量相对于宿主基因组(2,3肠道免疫系统),提供了一些好处。因此,肠道细菌至关重要的免疫系统的调节和屏障功能(3)和发挥重要作用的发展先天和后天的反应,促进B细胞和T细胞的扩张派尔集合淋巴结补丁和肠系膜淋巴结(4]。肠道免疫系统典型产生抗体属于免疫球蛋白(IgA)同形像。IgA是体内最丰富的免疫球蛋白,被认为是第一道防线在防止肠道吸收的病原体5]。
最普遍的疾病与免疫系统功能缺陷是过敏性疾病。在西方国家,过敏性疾病的发病率,包括食物过敏,越来越多,已成为一个主要公共卫生问题(3]。过敏反应通常发生在抗原递呈细胞抗原呈现给T辅助淋巴细胞(Th),一旦激活,增殖并把主要变成Th2效应细胞,分泌的细胞因子特征模式(6]。如今,改变微生物群与高易过敏是公认的7,8]。因此,卫生假说表明微生物暴露之后,更大的变应性疾病的患病率9]。据报道,无菌鼠接受增加口服过敏敏化的发展,这是过敏疾病的第一步(10]。因此,微生物群对口服耐受的诱导是重要的保护从食物过敏11]。特别是,政府的主要人类细菌,脆弱拟杆菌(12),的混合物梭状芽胞杆菌压力(13)可以增加调节性T细胞(Treg)的发展,因此,抑制口腔过敏的发展。
如前所述,食品微生物群和肠道免疫系统的影响。在这个公认的动作类黄酮的生物活性成分,一种多酚,,除了他们的抗氧化性能,调节细菌生长和成分和影响toll样受体(TLR)激活炎症和免疫反应激活(14]。低聚物的聚合多酚可以到达结肠(15],发表的数据在人类和体外和体内动物模型表明他们的角色在改变微生物群组成(了16,17])。此外,一些黄酮类化合物显示其抗过敏药潜力(了18]),这一事实可能与影响肠道微生物群的构成(19]。一种食物相对丰富的类黄酮是可可,还含有碳水化合物,蛋白质,脂肪,纤维,矿物质和methylxanthines。一些研究已经出版,讨论可可对肠道微生物群的影响。喂养6周的10%的可可饮食Wistar鼠的比例下降拟杆菌,葡萄球菌属,histolyticum梭状芽胞杆菌子群(20.]。另一项研究中,三个不同的大量的可可多酚有相同的老鼠在4周描述的年龄相关性的抑制增长葡萄球菌,链球菌,histolyticum梭状芽胞杆菌,和perfringens梭状芽胞杆菌,这部分归因于他们的多酚含量21]。
最近我们展示了耐受性影响10%的可可饮食对大鼠口服致敏模型(22]。这些结果让我们确定一个可可饮食可能施加的影响,至少部分,通过影响微生物群组成的大鼠口服致敏模型(22,23]。考虑到所有这些事实,本研究的目的是建立一个口头的影响致敏模型,单独和一起cocoa-enriched饮食,肠道微生物群。
2。材料和方法
2.1。动物和饮食
女性刘易斯老鼠从Janvier (Saint-Berthevin Cedex,法国),住在笼子里温度和湿度控制在12 h light-12 h黑暗周期在制药和食品科学学院的动物设施。在当前的研究中使用的程序是动物实验伦理委员会批准的巴塞罗那大学的(CEEA /乌兰巴托ref。5988)。
3个老鼠被随机分成三组(每个)根据饮食和口腔敏化过程:参考(RF)组(标准饮食和没有口腔敏感),在卵白蛋白(OVA)集团(标准饮食和口腔卵子敏化)和卵巢/ C组(10%可可饮食和口腔卵子敏化)。动物的饮食期间持续了四个星期可以免费获得食物和水。ain - 93米(从哈伦Teklad,麦迪逊,威斯康辛州,美国)公式作为标准的饮食和10%的可可饮食是通过修改标准配方,调整数量的碳水化合物,蛋白质,脂肪,纤维按照10%的可可粉(从Idilia SL的食物,以前Nutrexpa SL,巴塞罗那,西班牙)如前所述[22]。饮食等能量和营养素和微量营养素的比例是相同的。可可总多酚的饮食含有40.18毫克/克(表示为儿茶素)据Folin-Ciocalteu方法决定的。
2.2。口腔敏感
大鼠口服敏化诱导(如前所述22]。总之,从致敏大鼠组收到口头50毫克的卵子(V级;与30 Sigma-Aldrich,马德里,西班牙)μ克的霍乱毒素(CT;Sigma-Aldrich)作为辅助1毫升蒸馏水的口腔填喂法、三次每周三个星期(天0、2、4、7、9、11、14、16、18和21)。然而,RF组1毫升的相同的频率的车辆管理。这个过程能够产生特定的合成anti-OVA抗体(22,23]。
2.3。样品采集和处理
粪便样本之前收集口腔敏感和每周之后(天0、7、14、21、28)和加工以获得粪便匀浆(如前所述)(24]。短暂、粪便样本和干重和磷酸盐(PBS, pH值7.2)添加到获得最后一个20毫克/毫升的浓度。立即,混合均质与Polytron®(Kinematica、苜蓿、瑞士)和离心机,和上层清液冻结在−20°C到总IgA量化。此外,新鲜的粪便样本天23,一方面,称重,干5在37°C, h,重又为了确定的百分比湿度作为粪便一致性的指标,另一方面,用于粪便pH测定用表面电极(Crison仪器、SA、巴塞罗那,西班牙)。
2.4。肠道IgA的量化
从粪便匀浆IgA是量化使用夹心酶联immunoabsorbent试验(ELISA)与一组老鼠IgA ELISA定量技术(e110 - 102)从Bethyl实验室(美国蒙哥马利,TX)。简单地说,96 -孔板(Nunc MaxiSorp®,威斯巴登,德国)被涂上一层2μg / mL的捕获抗体碳酸盐缓冲(pH值9.6)。阻塞后,标准和样本孵化。最后,一个适当的稀释peroxidase-conjugated检测抗体的添加,洗涤后,一个o-phenylenediaminedihydrochloride-H2O2(OPD-H2O2)(Sigma-Aldrich)解决方案是补充道。在微型板块光度计吸光度测定。数据被插入Multiskan提升v2.6软件(热费希尔科学SLU,巴塞罗那,西班牙)的浓度标准。
2.5。粪便宏基因组分析
每组三个代表粪便的DNA样本28天的实验设计提取使用FastDNA®旋转工具(美国俄亥俄州议员生物医学、梭伦)根据制造商的指示。离子16 s™宏基因组工具包(生活技术,马德里,西班牙)是用于宏基因组研究由Bioarray基因诊断(Bioarray,阿利坎特,西班牙)。
在确认所有DNA样本有很好的的浓度水平,纯洁,和完整性,与平台进行了大规模sequentiation QIIME v1.8.0和USEARCH v.7.0.1090。为了指定分类,组合成不同序列有97%相似操作分类单元(辣子鸡)使用数据基地绿色煤电v13_8 UCLUST方法。
2.6。统计分析
统计分析是使用IBM的社会科学统计软件包对程序执行(SPSS 22.0版,芝加哥,美国)。时被认为是具有统计学意义的差异。
为了确定平等方差的正态分布,列文和Kolmogorov-Smirnov测试,分别。单向方差分析和Bonferroni事后测试结果进行平等的方差和正态分布。的非参数Mann-WhitneyU执行测试数据,没有平等的方差和/或正态分布。
二元皮尔逊相关性被用来确定一个协会之间存在肠道IgA浓度和相对丰富,绝对丰度,或检测到细菌物种的数量。
3所示。结果
3.1。可可对粪便的pH值和湿度的影响在口头敏感的老鼠
粪便pH值和湿度测定研究(图23天1)。RF组粪便pH值平均为7.52,未发现差异由于口腔敏感或可可饮食(图1(一))。相比之下,口头致敏组显示更高的粪便湿度(图1 (b)),表现出更多的水比RF组内容,而无显著差异对卵巢/ C组被发现。
(一)
(b)
3.2。可可对肠道IgA的影响集中在口头敏感的老鼠
粪便IgA测定显示,美联储动物标准的饮食,他们是否收到口头敏化,增加了IgA浓度在研究过程中。然而,这个时间增加从第七天由于抑制10%的可可饮食(图2)。
3.3。可可在口头致敏大鼠肠道Metagenome效果
3.3.1。定量宏基因组研究
如图3(一个)从总微生物群在参考老鼠,发现61%的细菌属于厚壁菌门门,33%,6%,变形菌门,拟杆菌门和Tenericutes不到1%,放线菌,蓝细菌,Verrucomicrobia, TM7类群。从这些门,没有发现显著差异在卵巢组对RF组。然而,这些敏感cocoa-enriched饮食喂养的大鼠(卵子/ C组)显示属于Tenericutes更高比例的细菌和蓝藻门相比,射频和卵巢组织。
(一)
(b)
绝对的细菌丰度的研究还揭示了重大变化的动物卵巢/ C组(图3 (b))。口头致敏组美联储可可饮食较低数量的细菌总数与RF组相比,这可能归因于减少壁厚菌门和变形菌门的数量。然而,一个更高比例的Tenericutes RF和卵巢组织观察。
此外,深入的分析揭示了重要的相对丰度的变化在每个门(表1)。口腔敏感细菌的比例下降属于美联储Erysipelotrichales秩序(硬壁菌门菌门)的动物与一个标准或可可饮食。此外,可可饮食降低细菌的比例从属于Alphaproteobacteria RF32秩序类(变形菌门门)。然而,这种饮食偏爱叶绿体类(蓝藻门)的存在,特别是Streptophyta秩序,和柔膜细菌类的比例增加,特别是RF39秩序。
表2显示了变化在家庭,发现属,物种水平。卵子敏化标准和可可饮食减少未知物种的相对多度的细菌性的秩序,metallolevans梭状芽胞杆菌,和Allobaculumsp。此外,动物的卵子/ C组的比例较低瘤胃球菌属flavefaciens一个物种,属于Erysipelotrichaceae家庭,Holdemaniasp, RF32秩序的一个特定的物种,而射频和/或卵巢组织。另一方面,三种Prevotellaceae家庭的比例,一个物种的Streptophyta秩序,这种乳酸菌,Anaerostipessp, Mogibacteriaceae和Erysipelotrichaceae家庭的一个物种,和柔膜细菌类的物种有较高比例的cocoa-fed动物(卵子/ C组)对RF和/或卵巢组织。
3.3.2。定性的宏基因组研究
宏基因组分析也为我们提供了定性信息肠道细菌的模式。物种的数量在每组三只老鼠的至少两个数。总共发现了90种RF组卵巢组织和86年84种物种的卵子/ C组。不同物种的数量划分为不同的类群如图4(一)。对于所有的动物来说,最高细菌丰富被发现在厚壁菌门,拟杆菌,变形菌门的门。
(一)
(b)
为了建立细菌物种之间的差异在每组中,一维恩图绘制(图4 (b))。所有的粪便中发现的物种,74人出现在三个研究小组。然而,由于口腔敏感,发现了一些修改可可饮食,或两者兼而有之。在参考条件,八个不同的物种是独特的RF组,这意味着这些物种消失由于口腔敏感(卵子,卵子/ C组)。四个属于厚壁菌门的门,三个变形菌门的门,和一个Verrucomicrobia门(表3)。三种壁厚菌门的门被包含在葡萄球菌属(如美国equorum),而另一个对应metallolevans梭状芽胞杆菌。关于变形菌门门,三个物种消失由于口腔致敏过程属于Alphaproteobacteria类(红螺菌目顺序),Deltaproteobacteria类(Spirobacillales顺序)或Gammaproteobacteria类(Vibrionales顺序)。此外,Akkermansia muciniphila,从Verrucomicrobia门,不是口头致敏组。
在卵巢组织,四个新物种被发现对RF动物。其中三只吃普通食物的同类致敏动物和可可后饮食也是一个礼物。从这些新物种,属于厚壁菌门两个门,一个Tenericutes门,和一个放线菌门。厚壁菌门的门的物种包括在内芽孢杆菌和Christensenella属,包括Tenericutes门Anaeroplasma属(表3),放线菌门物种还发现卵巢/ C组双歧杆菌pseudolongum(表4)。
关于敏感组可可饮食的情况下,九个不同物种被发现对RF和卵巢组织(表3)。两个物种属于拟杆菌门,其中的一个普氏菌copri。蓝藻门,一个物种从Streptophyta指令。至于厚壁菌门的门,三个物种从梭菌的指令被检测到,属于Dehalobacteriaceae, Lachnospiraceae Veillonellaceae家庭。此外,两个新物种出现变形菌门的门(Ralstoniasp.和脱磷孤菌属sp),和一个新的TM7细菌中也发现卵巢/ C组。
值得注意的是,两个卵巢组织中发现的细菌种类不但是在场在射频和卵子/ C组,表明可可饮食未能消除这些物种由于口腔敏感。这些细菌属于拟杆菌门,拟杆菌均匀化和普氏菌特别是sp.(表4)。此外,六个物种出现在射频和卵巢组织消失与可可饮食:属于厚壁菌门的五门,尤其是梭状芽胞杆菌(例如,梭状芽胞杆菌perfringens, Blautia有的时候,和Epulopisciumsp。)和Erysipelotrichi (Coprobacillussp)类和一个变形菌门的门,特别脱磷孤菌属sp。(表4)。
3.4。肠道IgA和微生物群协会
为了确定微生物群与肠道IgA, IgA值之间的线性回归分析和数据从相对和绝对丰富的细菌和每个门的发现物种的数量。如表所示5总值的,虽然没有明显的相关性被发现在任何上述变量,肠道IgA水平之间有很强的正相关关系,变形菌门门相对丰富。除此之外,被认为没有显著相关性之间的相对丰度,绝对丰度,或发现物种的数量从每个门和肠道IgA的浓度。
4所示。讨论
可可组件是在健康的条件下,能够产生一些修改在人类和大鼠肠道菌群如前所展示了通过使用鱼技术(20.,25]。目前的研究中,通过宏基因组方法,能够更深入地研究建立的影响可可饮食和口腔敏感大鼠的肠道微生物群作用过程。在这项研究中我们描述微生物群的变化出现在口头致敏动物喂一个标准和可可饮食(图5),这意味着这些变化必须是由于口腔敏感;此外,我们发现微生物群改变只在口头致敏动物美联储标准饮食意味着可可饮食预防卵巢引起的影响和CT等;最后我们观察到微生物群的修改只有在动物喂食可可,这表明这些主要是由于可可饮食。
口腔敏感没有引起任何显著变化在门级。这些结果不匹配的研究证明改变微生物群由于食物过敏,如细菌丰度的增加壁厚菌门的门,减少在那些属于拟杆菌,变形菌门,放线菌门(26,27]。虽然没有明显的修改在门水平观察在我们的敏化模型中,壁厚菌门的门,卵子+ CT政府在饮食减少细菌的相对丰度属于Erysipelotrichales秩序,这是符合Il4raF709口腔致敏后的转基因小鼠获得的数据(28]。更深层次的分析显示,口服敏感的相对丰度降低Erysipelotrichaceae家庭和Allobaculum属。必须指出Erysipelotrichi类,尤其是Allobaculum属,已经与一个更好的在结肠黏液层(29日),这表明他们的减少反映了由口腔黏液层敏化的变更不可避免的可可饮食。另一方面,一些定性的微生物群组成的变化出现敏感:新的细菌殖民受损粘膜(四个新物种)和一些别人无法抗拒新环境(十个物种消失),这也表明较低的多样性,这是根据发生在儿童湿疹(30.]。关于细菌物种,没有发现在口头敏感的动物,没有Akkermansia muciniphila,从Verrucomicrobia门,是特别感兴趣的。这革兰氏阴性厌氧细菌在宿主免疫反应中发挥作用和恢复黏液层厚度和粘液,分泌重要蛋白粘液(31日],减少许多疾病,如肠道疾病、炎症性疾病,肥胖和2型糖尿病32]。答:muciniphila最近已被建议作为一个新的功能与益生菌微生物属性(33)及其在口头没有致敏动物在这里找到肯定它的保护作用。
另一方面,改变肠道环境引起的口腔致敏过程标准和cocoa-fed动物导致的新殖民双歧杆菌pseudolongum,它属于主要越少双歧杆菌在婴儿,代表的2%左右双歧杆菌属数(34]。它被描述b . pseudolongum增加不同的两种生命起源以前的饮食喂养的大鼠(35]。因此,我们建议敏化过程可能影响老鼠的饮食组件biodisponibility和导致显著差异在肠道环境,选择性地增强了这个特殊的细菌的增长。此外,我们的研究结果与没有这些细菌在18-week-old健康Wistar鼠和其他两个dysbiotic条件下动物丰度:锻炼和肥胖36]。
考虑的影响可可饮食对口头敏感动物,大量的修改被认为对动物饲料标准在健康和敏化条件。可可饮食致敏模型降低了细菌总数与健康老鼠美联储可可含有2%多酚(21]。具体来说,可可饮食倾向于减少的绝对丰度厚壁菌门和变形菌门的门,而更多Tenericutes被观察到。此外高相对丰富的Tenericutes和蓝藻细菌种虫害。关于蓝藻的增加,这是伴随而来的是一些细菌属于Streptophyta顺序可可喂养的老鼠,但不是在吃普通食物的同类老鼠。据我们所知,这种细菌在肠道菌群的作用仍有待阐明,并且必须进行进一步的研究来建立这些特定的细菌之间的关系和可可公差的影响。另一方面,增加Tenericutes门,部分由于细菌属于RF39订单(柔膜细菌类),连同一个物种的外观属于TM7门,可能是一种适应的纤维内容可可饮食因为两门与粗纤维消化率在猪37]。此外,细菌从Tenericutes门可以提供一些有利影响肠道的完整性因为低项发现这些细菌在肠道炎症引起的葡聚糖硫酸钠(38]。
虽然可可饮食没有影响的绝对丰度拟杆菌门,从这个门增加一些家庭。因此,口头敏化可口的饮食喂养的老鼠的相对丰度增加普氏菌属和拟杆菌均匀化。这些结果可能是可可多酚含量的因为它们发现高架在人每天消费红酒多酚(39),而普氏菌在人们消费plant-rich饮食(更常见40]。此外,b .均匀化能够分泌抗菌蛋白质对抗压力相同的物种(41),这可以解释为什么可可饮食减少其他细菌性的细菌。关于普氏菌属,p . copri,与改善小鼠的糖耐量(40),出现在口头致敏大鼠美联储可可。这可能部分解释对糖耐量的影响类似可可饮食对糖尿病脂肪Zucker老鼠(42]。
可可饮食也影响了细菌模式壁厚菌门的门。可可饮食这些细菌的绝对数量减少,不仅伴随的增加也减少在某些特定家庭的细菌。在动物喂食可可有更高比例的这种乳酸菌人类有益的细菌,当口服药物诱导促炎Th1细胞因子的表达但不抗炎Th2的(43]。这种效果,这是符合Th2反应的衰减可可(44),可能有助于预防的敏感观察和证明口服治疗这种l .模型的气道过敏(45]。另一方面,可可饮食的数量减少瘤胃球菌属flavefaciens和Erysipelotrichaceae家族的一些细菌,尽管一个未知的物种从后者家庭显著增加。r . flavefaciens细菌能降解植物细胞壁多糖(46),但他们发现减少在牛瘤胃特定浓缩单宁饮食之后,这再次表明,可可组件可以修改肠道中的细菌生长模式(47]。
另一方面,如前所述在同一口腔敏化过程,可可饮食能够诱发口腔宽容和抑制特定的合成anti-OVA抗体(22]。这些影响是伴随着细胞的增加γδ细胞和CD103 + CD8 +细胞从cocoa-fed动物肠系膜淋巴结(22),细胞与监管相关函数。此外,由于肠道微生物群加强Treg发育和功能(48),变化影响肠道微生物群的可可还可以导致口腔宽容Treg细胞(图中5)。
最后,我们发现,两组吃普通食物的同类老鼠产生越来越多的肠道IgA在研究期间。另一方面,口腔敏感增加粪便含水量符合结果通过使用CT作为佐剂(口语49]。可可饮食部分避免粪便湿度的增加也减少了时间增加肠道IgA。最后效果是符合先前的结果在健康的条件下(50也证实了那些来自肠道灌洗和血清在同一大鼠口服敏化过程(22]。值得注意的是肠道IgA变形菌门和门之间的关系,即变形菌门的相对丰度越多,IgA的水平就越高。这些结果同意建议的变形菌门细菌门是主要的诱发IgA的B细胞(51]。B细胞负责共生的细菌生产IgA的规定(52),所以变形菌门的相对丰度可以激活B细胞IgA生产,证明更高水平的这些粘膜抗体。先前的研究相关的影响10%的可可饮食与基因表达减少IgA修改多个基因参与的B细胞的分化和成熟53,54]。从这个意义上讲,il - 6基因表达降低的可可饮食(53),这可能反映了降低il - 6分泌树突细胞,因此部分解释了可能的树突细胞参与这一过程。总之,我们的研究结果使我们能够建议口服宽容可以实现IgA水平较低,虽然这抗体与这种反应迟钝(有关55]。
5。结论
这项研究表明可可饮食,通过抗氧化剂茶多酚的含量、纤维、或其他生物活性的化合物,如可可碱、能够在口头修改微生物群细菌模式敏感动物。可可抑制特定抗体的合成和肠道IgA的生产,这些微生物群组成的变化,特别是变形菌门的门,可能是部分负责可可耐受性的影响。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者要感谢小的Massot-Cladera和桑德拉Martin-Pelaez为他们出色的协助分析宏基因组数据。他们也感谢Idilia食品SL提供可可粉。本研究从西班牙财政资金支持的经济和竞争力(agl2011 - 24279)。Mariona Camps-Bossacoma接受者的巴塞罗那大学的博士奖学金(APIF2014)。巴塞罗那大学的出版费用已经支付。