文摘

精油从NR(正常根)和人力资源获得药用植物(多毛的根部)益母草sibiricus根被用于这项研究。精油成分,并用gc - ms检测。总共八十五个组件被确定。七十个组件被确定为NR精油。NR精油的主要成分β-selinene (9.9%)、selina-4 7-diene (9.7%),(E)- - - - - -β石竹烯(7.3%)、myli-4 ene(6.4%)、(15)和guaia-1 (10), 11-diene (5.9%)。六十七年人力资源精油,组件被确定的主要成分(E)- - - - - -β石竹烯(22.6%),和germacrene D (19.8%)。精油是检测细胞毒性作用,抗菌,抗炎,抗氧化活动。精油显示活动对年级第四神经胶质瘤细胞系(IC₅₀= 400μg / mL),抗菌(MIC和MFC 2500到125的值μg / mL)和抗炎(il - 1的水平下降β、il - 6、TNF -α和干扰素-γ在LPS-stimulated细胞)。abt的精油表现出温和的抗氧化活性(EC₅₀= 98 - 88μg / mL)测定。这是第一份研究精油的成分及其抗菌,抗氧化,抗增殖和抗炎活动。结果表明,精油的形式l . sibiricus根可用于未来替代合成抗菌药物与潜在的应用在食品和医药行业。

1。介绍

数千年来,植物进行了巨大的经济价值,而不是只有在食品供应中扮演重要角色,但也作为治疗药物(1]。兴趣最近作为药用的植物生长在应用程序代理几个副作用以来发现与合成药物有关。植物已知的治疗能力和有助于减少各种炎症和癌症的风险,是最重要的全球药物的来源;世界上大约50%的药物产生的自然起源(2]。据世界卫生组织统计,大约80%的人依靠草药药物等传统的补救措施,发现在许多现代药用配方。许多天然药物植物提取物或油显示抗菌,抗氧化,抗癌,抗炎可能在几个动物模型和生物测定系统和影响人类疾病(3- - - - - -6]。

一个特别有趣的化合物是植物的精油来自各个部分。虽然精油只代表一小部分植物的成分,不过他们带来芳香植物的特征用于食品、化妆品和制药行业(7]。精油的抗氧化活性是另一个极大的兴趣,因为他们的生物属性可能保存食物的毒性氧化剂(8]。此外,他们的自由基清除能力可能发挥重要作用在某些疾病的预防等脑功能障碍、癌症、心脏病、和免疫系统下降9,10]。

一种植物,显示了一个广泛的生物活性益母草sibiricus现代药理研究表明,l活性成分的各个部分益母草sibiricus具有广泛的药理活性,对子宫的影响,以及赋予更一般的护心、抗氧化、抗癌、镇痛,抗炎、神经保护、抗菌效果11- - - - - -14]。先前的研究已经证明了的抗癌和抗氧化活动这种植物的各个部分15]。最有趣的结果提取的益母草sibiricus得到体外文化转换和正常的根16]。文献数据显示转换的根可以鼓励有价值的次生代谢产物的生产17]。因此,本研究进行了评价抗菌,抗炎,抗氧化,抗增殖活动和识别化学调剖的精油l . sibiricus正常和毛茸茸的根源。

2。材料和方法

2.1。植物材料的l . sibiricus根

在这项研究中,正常(NR)和多毛的根(人力资源)l . sibiricus进行了测试。毛状根获得了感染的有没有体外射的l . sibiricus与农杆菌属rhizogenes菌株A4。建立毛状根(人力资源)的文化已经被Sitarek前面描述的et al。15]。

2.2。精油的分离和分析

NR的精油和人力资源根(约50 g的)被hydrodistillation获得,使用clevenger-type装置5 h。化学分析的精油成分,并用gc - ms进行了方法根据Makowczyńska et al。18]。设备细节如下:跟踪GC超支撑材和女士DSQ II探测器和MS-FID分配器,与列Rtx-1女士(Restek), 60米×0.25毫米身份证。和膜厚度0.25μm;温度程序,50 - 310°C 2°C /分钟;喷射器temp。280°C;FID temp。300°C;载气氦和电离电压70电动汽车;离子源温度。200°C。化合物的识别是基于比较的RIs和MS谱与存储在计算机图书馆和文献数据(19,20.]。从支撑材计算百分比响应不使用修正因素。结果显示在表中1。

2.3。细胞培养

正常的人类星形胶质细胞(NHA)生长在AGM介质根据制造商的协议。细胞被播种密度细胞每25厘米²瓶。在这种情况下,这条线的细胞周期大约是12小时。神经胶质瘤细胞在四年级来自肿瘤病人。条件和进一步程序中描述的一项研究通过Sitarek et al。15]。

2.4。MTT试验

MTT比色细胞生存能力分析。简单地说,NHA(正常的人类星形胶质细胞)和神经胶质瘤细胞在四年级(细胞)在四级培养板治疗后24小时由每个浓度(0 - 3200μ克/毫升)的人力资源和NR的精油l . sibiricus根。进一步程序中描述的一项研究通过Sitarek et al。15]。

2.5。抗菌性

2.5.1。微生物菌株和生长条件

细菌菌株粪肠球菌(ATCC29212),金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923),铜绿假单胞菌写明ATCC 27853,大肠杆菌写明ATCC 25922孵化在37°C Mueller-Hinton介质(Biokar诊断、博韦、法国)。的酵母酿酒酵母写明ATCC 2601和白色念珠菌写明ATCC 10231人生长在Sabouraud葡萄糖琼脂(Difco)。

2.5.2。采用方法

精油的最低抑制浓度(麦克风)测定使用双重的串行汤采用试验(21]。细菌,样品溶解在DMSO溶液稀释在500至0.48μg / mL Mueller-Hinton肉汤中,酵母,样本稀释在5000 - 4.88μg / mL Sabouraud媒介。DMSO的抗菌活性是评价。万古霉素、诺氟沙星和两性霉素B被用作控制。样品的最低浓度,抑制微生物的生长的孵化24小时后37°C采用MIC值;这些都是在μ克/毫升。微生物的增长在620海里使用吸光度测量标(热科学Multiskan FC)。为每个测试微生物化验进行了一式三份。

2.5.3。最低杀菌浓度(MBC)或最低抑菌浓度(MFC)

麦克风的决心后,MBC或MFC为每个组井被发现。铂环量的肉汤收集的井没有任何增长,这是在无菌接种Mueller-Hilton介质肉汤为细菌和酵母Sabouraud媒介裸奔;这些媒体在37°C被孵化24小时。孵化后,没有明显增长的最低浓度观察记录MBC(细菌)或MFC(酵母)。

2.6。抗炎活性

水平的il - 1β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在上层清液由ELISA测定。星形胶质细胞细胞(NHA)亚文化6-well板块(5×10⁵细胞/毫升)和孵化与NR和人力资源植物精油(15、30和60μ克/毫升)或DMSO(车辆)24小时和孵化有限合伙人(1μg / mL) 24 h。治疗后,浮在表面的游离是收集,il - 1β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α使用ELISA试剂盒测定,按照制造商的说明(美国试剂盒)。吸光度是决定使用一个微型板块读者。结果代表三个独立实验的平均数±标准差。

2.7。反向Transcriptase-PCR分析

从星状细胞总RNA分离根据制造商的指示使用总RNA孤立系统(Blirt、波兰)。互补脱氧核糖核酸是由反转录系统(授权生物技术、波兰),和10μL的cDNA产品是用作模板的PCR反应。简而言之,PCR扩增由35周期(94°C, 1分钟;55 - 65°C, 1分钟;72°C, 2分钟)商业寡核苷酸引物对人类il - 1集β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。这些引物集93年收益率PCR产品,262年,74年,296年、75年和406年英国石油公司对il - 1β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α,分别。最后PCR产品在1.5%琼脂糖凝胶电泳。进一步程序中描述的一项研究通过Sitarek et al。15]。

2.8。抗氧化活性

2.8.1发布。对DPPH自由基清除实验的评价

2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH(2)自由基清除活性评估根据布洛瓦(22)做了一些调整。短暂,一系列的稀释NR和人力资源的精油。这后,1.5毫升的浓度是0.2和1.5毫升的更易与L methanolic DPPH的解决方案。30分钟的潜伏期后25 C, 520海里的吸光度(DPPH的最大吸光度)spectrophotometrically记录。一个空白的阅读是使用电池包含解决方案没有测试材料,和吸光度测定。每种解决方案的自由基清除活性是按照百分比计算抑制根据以下方程:%抑制=

精油的抗氧化活性是表示为EC₅₀,定义为所需的测试材料的浓度导致初始DPPH浓度降低50%。底部钻具组合作为一个标准。所有测量进行了一式三份。

2.8.2。abt激进的阳离子清除试验

样本的容量来清除abt (2, 20-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)激进的阳离子决心根据再保险et al。23)做了一些调整。abt自由基阳离子通过混合7更易生成L abt的pH值7.4(5更易与L不₂阿宝₄5更易与L Na₂HPO₄,154更易与L / L氯化钠)与2.5更易与过硫酸钾(最终浓度)。混合物被存储在黑暗中在室温16小时。这后,混合物与水稀释的价值使用分光光度计单元。样本,解决甲醇的精油被允许与新鲜反应abt解决方案;吸光度是然后测量六分钟后最初的混合。底部钻具组合作为一个标准。表示为EC的清除自由基的能力₅₀(μg / mL),确定使用相同的方程用于DPPH方法。所有测量进行了一式三份。

2.9。统计分析

并给出了结果的均值±标准差至少三个独立的实验。统计差异由单向方差分析。结果与被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。精油的化学成分的NR和人力资源l . sibiricus根

在这项研究中,我们演示了定性和定量的精油成分NR和人力资源l . sibiricu年代。精油NR和人力资源获得收益的0.06%和0.04%,分别。八十五组件的NR和人力资源根精油被确定(表1)。NR和人力资源主要包括精油含有一种复杂的混合物的倍半萜烯碳氢化合物(60.2%和64.8%,分别地。),含氧倍半萜烯(6.8%和13.4%,分别地。)和单萜烃(6.0%和1.5%,resp)。我们有一个小的部分含氧单萜(2.1%和1.9%)(表1)。七十NR精油、组件被确定。NR精油的主要成分β-selinene (9.9%)、selina-4 7-diene (9.7%),(E)- - - - - -β石竹烯(7.3%)、myli-4 ene(6.4%)、(15)和guaia-1 (10), 11-diene (5.9%)。六十七年人力资源基本根油,组件被确定。人力资源精油的主要成分(E)- - - - - -β石竹烯(22.6%)、germacrene D (19.8%),α-copaene (5%)。

3.2。麻省理工在正常的人类生存星形胶质细胞和神经胶质瘤细胞治疗后的精油l . sibiricusNR和人力资源

首先,测试与有限合伙人在治疗后细胞的可行性,NR和人力资源的精油l . sibiricus根,MTT试验进行NHA和神经胶质瘤细胞在四年级(数字1(一)和1 (b))。有限合伙人并不影响细胞的生存能力在测试浓度(1μg / mL)后24 h(数据未显示)。我们的研究结果表明,精油的生存能力是相似的。的集成电路₅₀价值被认为是1600年的浓度μg / mL NR和HR精油造成细胞生存能力下降了50%相对于消极的控制,包括细胞培养和DMSO没有精油(图1(一))。此外,NR和TR油被发现对IV级神经胶质瘤细胞有细胞毒性影响集成电路₅₀400的浓度μ克/毫升。测试了NR和人力资源的根精油l . sibiricus并不影响IC NHA细胞的生存能力₅₀浓度为第四等级的神经胶质瘤细胞(图1 (b))。

3.3。抗菌活性

精油的抗菌活动NR和人力资源l . sibiricus麦克风的根被确定定量评估和MBC / MFC,表中给出2。麦克风和MBC / MFC的油分值NR和人力资源l . sibiricus根在125到2500的范围μg / mL为中等收入国家,500年到5000年μg / mL MBC / mfc电池测试菌株。抗菌活性的NR和HR油l . sibiricus根对所有菌株与中等收入国家的价值观在125 - 250μ观察克/毫升,但最高的价值铜绿假单胞菌(125μg / mL)。l . sibiricus油被发现有大量的抗真菌活性酿酒酵母和白念珠菌1250年和2500年的MIC值μg / mL,根据采用微量测定,对MFC的值2500和5000μ克/毫升(表2)。没有观察到显著差异在NR和HR的精油l . sibiricus的根源。

3.4。抗氧化活性

NR和人力资源精油的抗氧化活动l . sibiricus根被自由基(DPPH和abt)评估清除化验。没有观察到显著差异在NR和HR精油。abt的分析,电子商务₅₀值测定μ对NR石油和g / mLμ分别g / mL人力资源石油。反过来,电子商务₅₀值是μ对NR石油和g / mLμ在DPPH测定g / mL人力资源石油。这两个测试油显示类似的抗氧化效果,但更好的观察活动abt的方法。表中给出的结果3。

3.5。人力资源和NR精油的效果l . sibiricus根对il - 1β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α水平

研究了NR的影响,人力资源的精油l . sibiricus根在LPS-stimulated il - 1的生产β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在NHA细胞。我们的研究结果表明,NR和人力资源根油LPS-stimulated水平降低il - 1β、il - 6、TNF -α和干扰素-γ而控制(图2)。观察这一效应在不同浓度(15、30和60μg / mL) NR和人力资源精油和依赖于剂量。没有观察到的差异和il - 4水平- 2对NR或人力资源控制精油,而且没有观察到显著差异之间的两个精油。

3.6。NR和人力资源根油的影响l . sibiricusil - 1β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在mRNA表达

基于前面的结果,最优浓度对精油被选为rt - pcr分析,以确定NR和人力资源的油l . sibiricus根可以调节il - 1β2、il - 4、il - 6干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α信使rna表达。NHA细胞孵化与LPS然后在60的存在μg / mL NR和人力资源根油。如图3,il - 1的表达β、白介素、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α基因被发现低于LPS-stimulated细胞为精油。没有发现变化表达式或il - 4 - 2。

4所示。讨论

自古以来被使用天然植物产品,和他们的使用正在增加。有些精油已知各种健康利益属性和作为替代治疗许多传染性疾病的预防和治疗:抗菌、抗真菌、抗炎、抗癌、抗氧化活动使他们特别适合这个角色。众所周知,精油的功效取决于许多环境和遗传因素。已经证明的主要因素负责不同的精油化学成分包括气候条件、地理来源、收集,蒸馏条件下,正确的农业实践,部分植物中提炼石油(24,25]。精油及其组件的一个重要特征是它们的疏水性,使他们分区细菌细胞膜和线粒体脂质,扰乱结构和渲染他们更多的渗透,导致泄漏的离子和其他单元格内容26]。抗菌、抗癌、抗炎和抗氧化性能的精油已经被许多其他研究人员评估(27,28),他们的研究结果支持目前调查的结果。本研究调查了精油的化学资料来源于正常,多毛的根源益母草sibiricus和评估他们的抗菌,抗炎,抗氧化,抗增殖活动。

精油是孤立的l . sibiricus根据一项研究[草或树叶29日]。这项研究是第一个确定的精油成分l . sibiricus正常和毛茸茸的根源。Dambolena et al。29日)报告β石竹烯和α蛇麻烯是三个主要的两个组分,占总油75 - 80%(叶子和草)β-cubebene第三。反过来,阿尔梅达等人发现germacrene D是最主要的化合物在叶油。在其他属的物种益母草,l .对虾倍半萜烯(45.4%)β氧化石竹烯及其精油的主要成分是孤立的从草本[30.]。

在目前的研究中,β石竹烯(总额的22.6%)和germacrene D(19.8%)被发现在人力资源精油的主要成分,在人力资源出现在较高的浓度比NR (7.3%, 1.2%, resp)精油。此外,NR精油透露其他化合物的分析包括selina-4 7-diene, selina-4, 11-diene,和guaia-1 (10), 11-diene中没有检测到HR精油。的另一个主要组件在NR精油β-selinene和myli-4 ene (15)。此外,β-selinene出现在九倍浓度更高,myli-4 (15) ene 6倍高,NR精油比石油人力资源。尽管不同的内容,关于生物活性没有发现显著差异。

尽管许多工人检查了精油的抗氧化活性DPPH和abt试验在一系列物种(31日,32),都已经讨论了精油的抗氧化活性NR和人力资源l . sibiricus根。我们的研究显示这两种油DPPH实验(EC的低反应性₅₀= 500μg / mL和EC₅₀= 489μg / mL) abt试验(EC和温和的反应性₅₀= 92μg / mL和EC₅₀= 88μg / mL),这可能是与高浓度的倍半萜烯碳氢化合物在NR和TR精油(60.2%和64.8%,resp)。我们的研究结果是一致的与安德拉德et al .,这表明低精油的抗氧化活性Siparuna guianensis高含量的结果(59.4%)的单萜和倍半萜烯碳氢化合物(33]。DPPH测试是基于使用一个非常拥挤的激进;然而,使用低拥挤等激进的abt可以更合适32]:abt化验出更好的结果表达的抗氧化性质,因为它是敏感的,需要一个反应时间短,可用于水和有机溶剂系统(32]。DPPH的结果之间的差异和abt测试可能归因于参与反应的机理:abt激进的反应涉及电子转移和以更快的速度发生与DPPH自由基相比,其数量的变色是由于氢捐赠能力测试的化合物(31日,32]。

精油显示针对第四年级神经胶质瘤细胞系的效果显著,与集成电路₅₀值400μ克/毫升。小说方面,我们的发现是,他们证明了NR和HR精油l . sibiricus根有细胞毒性的影响。Legault,皮切特显示β石竹烯具有抗癌活性与细胞系MCF-7 [34]。这种化合物被确定在人力资源和NR精油。反过来,de Oliveira等人发现油有抗癌的作用在各种癌症细胞系,germacrene D作为精油的主要成分之一(35]。然而,先前的研究表明,精油的抗癌活性可能是因为所有的萜烯油的协同效应;或者可能有其他活性化合物负责精油的抗癌活性,在未来研究值得关注。MTT测定发现,NR和HR精油l . sibiricus根用于本研究并不影响NHA细胞的生存能力当应用于浓度范围0 - 800μ克/毫升。

众所周知,许多植物精油的抗菌活性(4,36,37),作为一个化学防御各种病原体。本研究探讨了抗菌活动对所有测试菌株,这可能归因于倍半萜烯的存在等(E)- - - - - -β石竹烯或germacrene D测试油。众所周知,β石竹烯和germacrene D具有强大抗菌活性(36]。Dahham等人发现β石竹烯选择性抗菌活性和更明显的抗真菌活性(38]。熊等人注意的石油益母草多糖类化合物具有抗菌活性对革兰氏阳性细菌,但不反对革兰氏阴性细菌(36]。相比之下,我们的研究结果显示,对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗菌活性。如果一个纯化合物的MBC麦克风不超过四倍的价值,它可以被视为杀菌;因此这些精油似乎提供了潜在的作为杀菌剂(39]。然而,很难与其他研究比较我们的数据,因为变量影响结果所使用的精油成分和抗菌测试方法。此外,活动的评价标准的植物精油是失踪,因此不同作者的结果相差很大。由于精油的抗菌活性高,他们可能有价值的作为食品防腐剂。据我们所知,这是第一个报告确认精油的抗菌性能来源于l . sibiricus根。

我们的下一步研究评估的精油的抗炎活性l . sibiricus根NHA细胞。这种影响已被证明的ELISA检测LPS-induced生产支持和抗炎细胞因子如TNF -α、白介素- 2、il - 4、il - 1β,正γ用精油和治疗。此外,研究了基因的表达,如肿瘤坏死因子-α、白介素- 2、il - 4、il - 1β,正γ在mRNA水平。炎症是许多人类疾病的一个重要方面,它可以减少治疗的兴趣。神经胶质细胞星形胶质细胞和小胶质细胞等是重要的免疫细胞在大脑中(40]。小胶质细胞的激活居民小噬细胞启动等潜在的细胞毒性物质的释放活性氧中间体,一氧化氮,蛋白酶(41]。这些组件被认为有助于进步损害在神经退行性疾病;因此,活化的小胶质细胞的减少他们的水平可以改善神经退行性疾病的症状(42,43]。许多细胞因子和炎症因子、神经递质和神经肽已知影响大脑细胞的il - 6的监管。此外,il - 1β和肿瘤坏死因子-α曾被观察到在培养皮层神经元和星形胶质细胞产生il - 6,后者涉及NF吗κB和PKC途径(44]。有限合伙人通常被用作inflammogen激活细胞在体内和体外细胞模型(45]。通常LPS诱导il - 6在星形胶质细胞和小胶质细胞,肿瘤坏死因子-α只在星形胶质细胞产生il - 6;它没有这样做在小胶质细胞(46]。种特异的影响可能存在,因为,在人类细胞体外,有限合伙人影响小胶质细胞更大程度比星形胶质细胞对肿瘤坏死因子-的生产α,il - 1β和il - 6;然而,il - 1β是一种潜在的刺激星形胶质细胞il - 6生产(47]。因此,正常的人类星形胶质细胞激活的抑制和减少职业——抗炎介质的释放代表一个有前途的神经退行性疾病的预防策略。我们的研究是第一个报告,NR和HR精油l . sibiricus根抑制肿瘤坏死因子-α、白介素- 2、il - 4和il - 1β生产引起LPS刺激剂量依赖性的方式。此外,精油抑制TNF的表达——被发现α、白介素、干扰素-γ,il - 1β在LPS-activated NHA细胞基因。我们怀疑这是由于精油中所确定的主要化合物,也就是说,倍半萜烯等(E)- - - - - -β石竹烯和germacrene D;然而,文献表明,这可能是由于石油的组分的协同效应。同样,Baylac和拉辛注意,倍半萜烯等β石竹烯展出活动体外5-lipoxygenase试验在炎症过程中(48]。

5。结论

我们的发现细节的精油的成分正常,毛茸茸的根(NR和人力资源)l . sibiricus并指出他们的承诺作为医药、抗菌、抗氧化、抗炎和抗增殖活动。我们的研究结果清楚地表明,这些精油对四年级是活跃的神经胶质瘤细胞,抑制食品致病菌的生长,abt测试中温和的抗氧化活性,抑制LPS-stimulated NHA激活通过抑制pro -抗炎介质。这里给出的结果可以被认为是第一个生物信息NR和HR精油的性质l . sibiricus的根源。因此,这种植物可以用于安全地延长食品的货架期和在植物疗法可能是一个有趣的候选人。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作由罗兹医科大学的财务支持,波兰(503/3 - 012 - 01/503 - 31 - 001)。