文摘

内皮功能障碍是关键球员发展和血管事件的进展。氧化应激参与内皮损伤。Rosmarinic酸(RA)是一种天然多酚抗氧化、抗凋亡、抗炎作用。本研究探讨RA的保护作用内皮功能障碍引起的过氧化氢(H₂O₂)。endothelium-denuded主动脉环相比,内皮显著缓解减少vasoconstrictive反应PE和氯化钾诱导的H₂O₂。H₂O₂预处理明显受伤的vasodilative反应ACh endothelium-intact主动脉环浓度的方式。RA个人预处理对PE vasoconstrictive反应没有明显的影响和氯化钾,而其cotreatment明显减轻endothelium-dependent松弛损伤和氧化应激引起的H₂O₂。RA AMPK和差别cotreatment扭转了对这些引起的以挪士磷酸化H₂O₂在HAEC细胞。AMPK的预处理与抑制剂(C)复合,以挪士(L-NAME)摧毁了RA的有利影响。所有这些结果表明RA减毒的内皮功能障碍引起的氧化应激激活AMPK /以挪士通路。

1。介绍

血管内皮在维持血管结构和功能中扮演关键角色(1]。在生理状态,内皮释放放松和收缩因素包括一氧化氮(NO)、内皮,内皮素,导致血管的局部调节语气和凝固(2]。

内皮细胞也分泌活性氧(ROS),尤其是过氧化氢(H₂O₂),如快速扩散信号招募白细胞损伤部位和内皮NADPH氧化酶是活性氧的主要来源3]。而过量的活性氧会导致氧化应激导致血管功能障碍在心血管事件(4)、糖尿病(5)、中风(6),动脉粥样硬化(7),等等,越来越清楚的是,氧化应激导致macrovascular并发症的发展(8]。事实上,最近的研究表明,内皮功能障碍的机制主要是由于endothelium-derived没有的生物利用度降低氧化应激(9]。ROS的存在不仅降低了生物利用度的(10),但也导致以挪士解偶联这将导致更多的活性氧的形成11]。

积累证据从长椅上睡觉支持酚类抗氧化剂和自由基清除的特性的药理活性氧化stress-mediated血管疾病。白藜芦醇(等(例?)12),姜黄素(13),和黄烷醇(−)表儿茶素14]显示广泛的保护对内皮细胞的影响在活的有机体内和在体外。Rosmarinic酸是一种最有效的抗氧化剂之间的简单酚类化合物(15]。Rosmarinic酸(α-O-caffeoyl-3 4-dihydroxyphenyl乳酸;RA)是一种天然酚类抗氧化剂中包含一些家庭唇形科植物用于传统医学和植物疗法等白苏子(l)布瑞特。丹参知母。迷迭香属officinalisl,和薰衣草花angustifolia轧机。RA具有许多生物活性,包括抗氧化、收敛、消炎、抗菌,抗血管新生,抗病毒,治疗风湿病的、抗过敏药、抗抑郁药,治疗糖尿病药和抗肿瘤效果16]。Sotnikova等人证明了RA改进苯肾上腺素的反应性主动脉环,防止upregulation il - 1β肿瘤坏死因子-α,并在糖尿病大鼠内皮素途径在活的有机体内(8),而影响endothelium-dependent血管舒张不调查。在这里,我们建立了一个与过氧化氢氧化损伤(H₂O₂)的保护作用研究RA endothelium-dependent血管舒张由乙酰胆碱(ACh)和底层机制。我们的研究结果表明,RA的保护活动AMPK-eNOS介导的信号通路。

2。材料和方法

2.1。化学物质

Rosmarinic酸、乙酰胆碱(ACh)、复合C, 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1 -β-D-ribofuranoside(爱卡)apocynin, diphenyliodonium从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国);去氧肾上腺素(PE)l-N-nitro精氨酸甲酯(L-NAME)从阿拉丁购买实业有限公司(上海,中国)。其他试剂的纯度分析。

2.2。动物

Three-month-aged雄性Wistar鼠(200 - 250 g)得到的动物中心山东绿叶制药有限公司(烟台,中国)。老鼠维持在12 h光/暗周期和免费的食物和水。所有实验程序批准的机构动物保健和使用委员会国家医药研究所的教育和研究。

2.3。制备大鼠主动脉环

胸主动脉被隔离和放置在4°C修改Krebs-Henseleit (k - h)解决方案(mM:氯化钠,118;氯化钾,4.7;KH₂阿宝₄1.2;MgSO₄1.2;NaHCO₃25.0;CaCl₂2.5;葡萄糖,10.0。pH值7.4,(17])。多余的结缔组织仔细清洗和主动脉是切成段约3毫米长。在一些实验中,主动脉内皮被纸夹。主动脉瓣环的张力与线性测力传感器,记录和播放的k - h的解决方案是95%₂和5%的公司₂混合和维持在37°C。所有的船只都平衡1 h和2.0 g的基本张力调整前的实验。平衡期间,k - h的解决方案是更换每15分钟。一开始的实验中,主动脉环被暴露于80毫米氯化钾3次直到稳定的响应。完整的内皮功能被放松达到85%以上由ACh (10μ米)诱导的婚约主动脉环与体育(1μM)。内皮放松时被认为是有效去除引起ACh不到10%。

2.4。内皮功能障碍引起的H₂O₂和RA治疗大鼠主动脉环

10分钟后与新k - H平衡解决方案,主动脉环使用不同浓度的H₂O₂(2.5,5.0,和10.0毫米)10分钟。冲刷后H₂O₂与80毫米,主动脉环去极化的氯化钾2次。回到基线张力后,20分钟的戒指被允许平衡,然后收缩诱导与体育(1μ米),直到一个稳定的高原在紧张。然后,每个环被暴露在增加浓度的ACh (10⁻³,10⁻²,10⁻¹1、5、10、50μ米)产生剂量依赖性放松反应。在RA干预实验中,主动脉环与不同浓度(50.0孵化μ25米,μ12.5米,μRA的M) 10分钟前暴露在5毫米H₂O₂。之后,第二个血管舒张反应ACh得到评估PE-induced收缩后内皮的完整性。为了调查的角色AMPK H₂O₂全身的内皮功能障碍,主动脉环分别为10分钟AMPK抑制剂预处理(C)复合,AMPK活化剂(爱卡)在H₂O₂(5毫米)。

2.5。测量H₂O₂导致Vasocontraction损伤介导的平滑肌细胞

为了排除vasocontraction损伤介导的平滑肌细胞损伤,PE的血管收缩反应性调查后5毫米H₂O₂治疗endothelial-intact (EC +)或endothelial-denuded (EC−)主动脉环。

2.6。检测啊₂⁻由电视台减少化验

电视台进行还原试验如前面描述的方法(18]。短暂,主动脉环与k - h的解决方案包含100.0孵化μM电视台1 h后的实验。随后,盐酸(0.5毫米)被添加到停止反应。然后,主动脉环与PBS缓冲洗3次;后切碎的离心机,享年20000岁20分钟的40 mg / L diethylenetriaminepentaacetic的混合酸,氢氧化钠溶解成0.1米,0.1% SDS,吡啶的颗粒悬浮在0.5毫升,连同被加热在80°C 1.5 h为了提取甲瓒。混合物在10000年经历了第二次离心分离10分钟。光密度(OD)为540 nm。

2.7。细胞培养和治疗

HAEC(人类主动脉内皮细胞)从细胞库购买,上海生命科学研究院、中国科学院、上海、和杜尔贝科修改鹰的培养基培养(GIBCO)补充谷酰胺、盐酸吡哆醇,110 mg / L丙酮酸钠,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素和两性霉素在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。细胞培养的六个或更少的文章第一次增长到融合之前暴露于H₂O₂10分钟(5毫米),刺激RA (50μ包含H M)₂O₂(5毫米)10分钟,澄清的活动AMPK phosphor-eNOS的表达。因此,细胞治疗化合物C与H (AMPK的抑制剂)₂O₂在RA的存在和10分钟。

2.8。免疫印迹分析

细胞裂解后,蛋白质样品(25μg / lane)解决了电泳10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶,然后转移到硝化纤维膜。膜是在阻止缓冲区孵化,然后孵化有以下主要抗体:anti-AMPK(1: 1000年,细胞信号技术,妈,美国),anti-phospho-AMPK (Thr172)(1: 1000年,细胞信号技术),anti-phospho内皮一氧化氮合酶(以挪士,Ser1177)和anti-endothelial一氧化氮合酶(1:1000年,细胞信号技术)。此后,膜清洗和孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体。(1:2000年,细胞信号技术)。

2.9。统计分析

结果表示为均值±SD为分离实验和统计分析是由成对的学生的t以及或单向方差分析多个因素分析SPSS 18.0软件。时被认为是具有统计学意义的差异 。

3所示。结果

3.1。过氧化氢接触体育和KCl-Induced收缩的影响

累积的H₂O₂10.0毫米显示没有明显影响基底endothelium-intact紧张局势和endothelium-denuded主动脉环(数据没有显示)。收缩反应PE或氯化钾没有影响到H₂O₂达到10.0毫米endothelium-intact主动脉环。然而,5.0毫米H₂O₂预处理导致显著下降的最大收缩引起的PE或氯化钾endothelium-denuded主动脉环(数字1(一)和1 (b)),这表明,H₂O₂引起更严重的损伤血管平滑肌endothelium-denuded主动脉环和内皮的存在减轻这种伤害。

一个典型模型的浓度响应曲线ACh-induced endothelium-dependent放松在H受损₂O₂全身的胸主动脉与控制(数字1 (c)和1 (d))(控制:pD₂= 7.00±0.05,E_马克斯= 90%;2.5毫米H₂O₂:pD₂= 5.88±0.12,E_马克斯= 73%;5毫米H₂O₂:pD₂= 4.52±0.22,E_马克斯= 47%)。

3.2。RA对H₂O₂全身Endothelium-Dependent血管舒张障碍大鼠主动脉环

风湿性关节炎的累积浓度为50μ米没有影响收缩反应氯化钾或PE(数字2(一个)和2 (b)),空调采暖(图的放松反应2 (c))在大鼠主动脉环,而它大大减轻损伤引起的血管舒张反应的ACh H₂O₂剂量依赖性的方式(图2 (c))( )。由于氧化应激介导的内皮损伤和NADPH氧化酶是内源性活性氧的主要来源,O₂^•−代在主动脉环被电视台减少检查。5毫米H₂O₂治疗显著提升的生成减少电视台(甲瓒)隔离大鼠主动脉环,而50μM RA几乎完全废除的影响H₂O₂(图2 (d))。

3.3。以挪士激活参与了RA的保护对内皮功能障碍引起的H₂O₂

鉴于没有是最强有力的血管舒张和胞内氧化状态的调制器,它是由以挪士在内皮19),我们探索的影响以挪士激活在RA的保护内皮功能障碍引起的H₂O₂。预处理与NOS抑制剂单独L-NAME明显降低引起的血管舒张ACh(图3(一个)(图),而增加了电视台减少3 (b))在大鼠主动脉环。L-NAME进一步增加了血管舒张障碍(图3(一个)),而这增加了电视台减少(图3 (b))引起的大鼠主动脉环H₂O₂。此外,废除了L-NAME治疗RA对损伤的保护endothelial-dependent放松受伤的H₂O₂(图3(一个))。和电视台减少RA诱导的减少也逆转了L-NAME在H₂O₂治疗主动脉环(图3 (b))。

3.4。AMPK活化参与了RA的保护对内皮功能障碍引起的H₂O₂

AMPK是至关重要的细胞能量传感器感官细胞内AMP / ATP比率的变化。它也是一个细胞内压力传感器是由氧化应激和其他压力,导致细胞ATP水平下降。AMPK的关键调节器是一种以挪士内皮和参与氧化应激诱导的内皮功能障碍导致NADPH氧化酶upregulation [20.]。在这里,我们调查的角色AMPK在RA的保护内皮功能障碍引起的H₂O₂。如图4(一)与控制相比,应对ACh是类似于爱卡,RA-treated组( )。同样,激活AMPK的爱卡减少降低了电视台。然而,RA的有益作用在endothelium-dependent血管舒张大鼠部分减毒的复合C,一个良好的AMPK抑制剂,AMPK活性降低,增强电视台减少10点μM(图4 (b))。此外,当复合C与H相结合₂O₂减少,加剧了电视台。从力学上看,我们发现AMPK活性和增加了保护RA的内皮功能障碍(图4 (b))。

3.5。RA治疗改善内皮功能障碍HAEC通过AMPK /以挪士途径

为了进一步确定AMPK的关系和以挪士在RA的效果,AMPK-eNOS信号通路激活了的磷酸化在人类主动脉内皮细胞(HAEC)在体外。如图5,总AMPK和以挪士的表达水平保持不变。和50μM RA单一治疗没有明显的影响AMPK和以挪士磷酸化,在5毫米H₂O₂治疗显著下调AMPK的磷酸化和以挪士Thr172 Ser1177,分别为( ),在HAEC细胞。与RA cotreatment显著逆转AMPK的减少和以挪士磷酸化由H₂O₂。AMPK的抑制剂、复合C cotreatment,废除了RA upregulation AMPK和以挪士磷酸化在H₂O₂对待HAEC细胞。然而,AMPK受体激动剂显示患风湿性关节炎的协同效应。结果表明,AMPK磷酸化在RA的保护效应中扮演关键角色₂O₂在HAEC全身的伤害。

4所示。讨论

内皮功能障碍导致的氧化应激是启动的关键因素在几乎所有的血管事件。Niethammer等人发现,细胞外的H₂O₂生成的双重氧化酶(Duox)达到50μ米20分钟受伤后伤口边缘附近的斑马鱼幼体,建造了一个浓度梯度,介导白细胞的快速招聘到伤口7]。虽然氧化破裂来源于中性粒细胞激活的炎症将会产生更多的活性氧,没有准确的浓度数据的H₂O₂报道。在这里,我们研究了H的量效关系₂O₂在内皮细胞和血管平滑肌的功能。为了排除H的直接反应₂O₂与PE或靠,主动脉环在新鲜的k - H 10分钟解决方案和孵化后与氯化钾redepolarized H₂O₂脉冲治疗10分钟。结果表明,血管平滑肌反应PE或氯化钾endothelium-denuded主动脉环更容易H₂O₂(在5.0和10.0毫米)比endothelium-intact主动脉环(图1),这表明,内皮保护的存在引起的氧化损伤的血管平滑肌高浓度的H₂O₂。此外,2.5毫米H₂O₂预处理导致vasodilative反应的显著下降,这表明,内皮细胞更敏感的H₂O₂血管平滑肌细胞。

Sotnikova等人的以前的工作证明,RA显著改善了endothelium-dependent在糖尿病大鼠主动脉血管舒张,这可能是由它的抗氧化和抗炎特性(8]。本研究证明了RA的障碍改善endothelial-dependent血管舒张引起的H₂O₂在正常大鼠主动脉(图2)。NADPH氧化酶是活性氧的主要来源的内皮细胞和血管平滑细胞(21]。此外,事实证明,endothelial-dependent放松是有效改善Nox2删除后,这其中牵扯到的内皮功能障碍可能与Nox2超表达(22]。H₂O₂全身放松endothelial-dependent障碍与产量的增加超氧化物阴离子(O₂^•−)。事实证明,H₂O₂可以激活NADPH氧化酶在剂量和时间的方式呼吸率(23),氧化损伤内皮产生过多的活性氧是内皮损伤的关键中介在动脉粥样硬化和糖尿病24]。我们的工作也证明了脉冲治疗H₂O₂大大增加了电视台减少大鼠主动脉和RA cotreatment显著逆转的影响₂O₂,这表明抗氧化活动参与了RA的保护对内皮功能的影响。

endothelium-dependent血管舒张障碍被认为是导致生物利用度下降的一氧化氮(NO),一个重要endothelium-derived放松的因素。超氧化物源自NADPH氧化酶能迅速反应,没有形成稳定的过氧亚硝基阴离子(ONOO⁻),这将导致没有生物利用度的下降。没有信号功能障碍的其他原因可能在于以挪士表达和激活障碍。在我们的实验中,L-NAME部分减少引起以挪士的磷酸化和风湿性关节炎的保护作用的内皮功能障碍引起的H₂O₂虽然加剧了活性氧形成H₂O₂治疗大鼠主动脉。这些结果表明RA的影响可能与NO合成有关。

近年来,AMPK能增强血管的功能演示了通过激活以挪士(25]。除了调节能量代谢,AMPK发挥抗炎和抗氧化活动(26,27]。先前的研究表明,AMPK活化改善内皮功能(28]。在这里,我们发现,AMPK兴奋剂爱卡单一治疗拥有类似的保护作用对内皮功能障碍和氧化应激引起的H₂O₂在大鼠主动脉以及风湿性关节炎,风湿性关节炎和爱卡没有进一步的有益影响。AMPK的cotreatment抑制剂化合物C废除RA的影响,这也进一步证明了RA的AMPK激活发挥了关键作用的影响。胡锦涛et al。的工作表明,H₂O₂诱导的双向调制以挪士Akt, AMPK在时间和剂量依赖性的方式29日]。我们还发现了一种蛋白激酶抑制剂LY294002 cotreatment显著废除RA的保护从endothelium-dependent血管舒张障碍(图年代在网上https://doi.org/10.1155/2017/7091904H引起的)₂O₂。在差别和RA明显恢复了磷酸化对这些Ser473 Akt蛋白(图。它表明,一种蛋白激酶信号通路参与了RA的保护作用,而AMPK的交互和Akt在RA的影响需要进一步的调查。

总之,本研究表明RA显著提高H₂O₂全身的内皮功能障碍和AMPK-eNOS通路的激活参与了RA的效果。然而,RA的调制效应是否依赖于其直接激活AMPK-eNOS通路或调制在氧化状态仍然澄清目前的工作。它需要进一步的调查来确定风湿性关节炎的潜在机制的保护内皮功能。

缩写

类风湿性关节炎:	Rosmarinic酸
k - h:	Krebs-Henseleit
爱卡:	5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1 -β-D-ribofuranoside
体育:	苯肾上腺素
哦:	乙酰胆碱
EC +:	Endothelium-intact主动脉环
EC−:	Endothelium-denuded主动脉环
L-NAME:	NG-nitro-L-arginine甲基酯
以挪士:	内皮细胞一氧化氮合酶
我/ R:	缺血和再灌注
HAEC:	人主动脉内皮细胞。

的利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

作者的贡献

回族周、傅Baocai振华Wang和李记设计并进行了研究。回族,波许,香泉Mi,李刚,呈君妈,和谢所收集的数据并进行了分析。回族,波许,李刚,波许,呈君妈,李建欣谢,振华Wang和李记解释数据。回族周,振华王,霁李写的手稿。回族周和傅Baocai贡献同样这项工作。

确认

这部分工作是支持由中国国家自然科学基金(21372190,21372190),山东省泰山学者计划(tshw201502046)的“个性化Medicines-Molecular基于签名的药物发现和开发”战略重点研究项目的中国科学院(XDA12040320),和烟台Shuangbai项目。

补充材料