文摘

天然产物抗氧化活动广泛应用于预防和治疗各种氧化应激相关疾病,包括缺血性心脏病。但是,这些治疗的细胞和分子机制仍需要说明。在这项研究中,我们为特征的心血管效应Hongjingtian注入(HJT),一种广泛使用的植物药物治疗冠心病。H / R-induced深刻的高度氧化应激被HJT镇压。HJT也变弱氧化损伤通过促进细胞活力,细胞内ATP含量和线粒体的耗氧量。验证实验表明,H / R-induced HJT抑制细胞凋亡,调节凋亡蛋白bcl - 2的表达和caspase3分开。有趣的是,HJT显著监管autophagy-related蛋白LC3的表达,Beclin, mTOR ERK和AKT。我们提供的证据表明,涉及一种蛋白激酶的激活机制/ Beclin-1 AKT、ERK / mTOR在心肌细胞自噬通路。组织学和生理学评估显示,HJT明显减少心脏的梗死面积,改善心脏功能,增加了大鼠模型中的表达LC3B心肌梗塞。从获得的数据,我们建议HJT减少心肌氧化损伤通过调节自噬和凋亡的平衡,减少氧化应激。

1。介绍

近年来,越来越多的人意识到的重要性,氧化应激致病性的各种慢性疾病,以及发展新的治疗方法(1]。作为一种重要的资源替代和补充疗法,天然产品包含各种各样的生物活性化合物与抗氧化能力2,3]。然而,精确的作用机制抗氧化天然产品了解甚少。Hongjingtian注入(HJT)植物药提取物的生产红景天wallichianavar。cholaensis有着悠久的历史,在中国使用的预防和管理各种血管疾病,如心绞痛和冠心病4]。现代分析技术确定HJT的主要组件包括阿魏酸,百脉,红景天甙,它的衍生品5]。最近的生物和药理的调查还显示,HJT能扩张冠状动脉,降低心脏后负荷在狗6]。的提取红景天的l,another medicinal plant in Eastern Europe which contains similar chemical constituents of HJT, are regarded to stimulate the nervous system; enhance physical and mental performance; and treat fatigue, psychological stress, and depression [7]。最近的报告表明,红景天甙的根的活性成分红景天的l,possessed a range of pharmacological properties, including antihypoxia, anti-inflammation, antioxidative, anticancer, antiaging, and neuroprotective effects [8- - - - - -12),尤其是红景天甙治疗作用的心血管效应已在实验室良好的文档记录(13]。尽管HJT产生多种生物活性,如促进抗氧化酶的活动(14),增加耐缺氧(11),一个不清楚药理作用机制,已成为临床应用中面临的一个常见问题。

自噬是一个守恒细胞退化系统涉及亚细胞的膜来隔离细胞质融合的重排和细胞器交付到溶酶体,降解和回收损坏或不必要的胞质内容(15]。因此,自噬激活通常是通过starvation-induced信号和扮演着一个重要的角色在细胞反应营养不足16]。最近,据报道,自噬是一个重要的监管机构的许多心血管疾病如心肌缺血/再灌注损伤(17- - - - - -19]。此外,它已被证明,自噬和凋亡之间有一个相声心脏病(20.];例如,活性氧不仅引发细胞凋亡也对自噬(至关重要21,22]。

在这项研究中,我们研究了HJT的心血管效应对氧化应激在H /受伤R-induced心肌细胞和心肌ischemia-injured老鼠和假设HJT的保护机制可能与抗氧化系统的增强有关。我们验证HJT增强自噬促进心肌细胞的生存从氧化应激损伤体外和体内,以及抑制细胞凋亡的细胞受到H / R损伤。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和Hypoxia-Reoxygenation模型

H9c2心肌细胞从细胞获得银行的上海生命科学研究院,在4.5 g / l葡萄糖DMEM培养(康宁Cellgro)补充10%胎牛(GIBCO), 100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。H9c2心肌细胞被播种在6-well盘子,96孔板,或其他类型的盘子和孵化24 h在37°C的氛围中5%的股份有限公司2。hypoxia-reoxygenation (H / R)模型,H9c2心肌细胞与PBS缓冲液冲洗一次,然后刷新glucose-free DMEM (GIBCO) (pre-eliminated氧95% N2)。细胞被立即放入一个密封的腔加载与含有5%的混合气体有限公司2和95% N2。H9c2心肌细胞培养在37°C 1 h, 2 h,前6小时、12小时或24小时再灌注不同的实验目标。再灌注,心肌细胞H9c2刷新了glucose-containing DMEM补充胎儿牛,继续孵化37°C的氛围中5%的股份有限公司22 h。细胞被分为三组:控制、H / R)和H / R + HJT。控制细胞总是在孵化glucose-containing DMEM补充胎儿牛在37°C的氛围中5%的股份有限公司2。的H / R + HJT HJT注入不同浓度(稀释75、100和200倍)溶解在glucose-free DMEM和添加到细胞在缺氧的发生。

2.2。清除DPPH自由基、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)测定

的清除DPPH自由基和MDA的含量和活性氧测定根据指令的商业分析工具。DPPH自由基被HJT注入与回收不同浓度(稀释1600、800400、200、100、50岁,25岁和12.5倍)。MDA测定工具包(Beyotime生物技术研究所)是用于检测H9c2心肌细胞的MDA含量。细胞内活性氧的水平是由活性氧测定工具包(Beyotime生物技术研究所)和荧光显微镜观察到。与ImageJ细胞荧光分析。H9c2心肌细胞的活性氧测定被保存在一个室1 h而MDA测定24 h。

2.3。细胞生存能力、ATP和线粒体氧消耗率试验

细胞生存能力、ATP的水平和H9c2心肌细胞的线粒体耗氧率测量根据指令的商业分析工具。细胞生存能力评估3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)试验后指定的治疗。ATP含量是评估CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析工具包(Promega)。细胞呼吸测量使用液相氧测量系统(英国Hansatech)和线粒体呼吸是量化的耗氧率。

2.4。通过流式细胞仪检测细胞的凋亡

细胞凋亡是由膜联蛋白V-FITC /π凋亡分析工具。双重染色FITC-Annexin V和π是按照制造商的指示。短暂,指定治疗后(24小时缺氧复氧/ 2 h),细胞被收获,在冰冷的PBS洗两次。然后,膜联蛋白V-FITC和propidium碘(PI)被添加到每个样本在黑暗中15分钟37°C。分析了细胞荧光流式细胞分析仪(BD Accuri C6)。

2.5。免疫印迹分析

蛋白质样品制备和免疫印迹分析使用标准程序进行。总之,1×106H9c2心肌细胞被播种在6-well盘子。最后指定的治疗,H9c2心肌细胞与预冷PBS缓冲,轻轻冲洗两次与裂解缓冲细胞溶解免疫印迹和IP在冰上提取蛋白质。BCA试验被用来测量蛋白质含量。蛋白质是由sds - page凝胶电泳分离和转移到PVDF膜。膜被5% BSA在室温下2 h。与TBST洗后,细胞膜是孵化主要抗体在一夜之间在4°C,然后用一个适当的膜是孵化HRP-conjugated二级抗体室温1 h。抗原抗体复合物被检测到有ultra-sensitive-enhanced化学发光(ECL)衬底(表达载体)然后由GelDoc XR可视化系统(生物RAD)。GAPDH和β肌动蛋白被用作内部标准。

2.6。共焦显微镜和透射电子显微镜(TEM)

指定的治疗后(12 h缺氧/ 2 h再氧化),H9c2心肌细胞都含有1μM MitoTracker绿色(分子探针)和LysoTracker红色(分子探针)37°C为30分钟。细胞荧光共焦显微镜观察。细胞样品(治疗的1 h缺氧/ 2 h再氧化)处理了TEM分析按照例行程序。在心肌细胞自噬小体和双膜的使用h - 7650透射电镜观察。

2.7。动物和实验协议

男性Sprague-Dawley老鼠(220 - 240 g)从北京购买重要河流实验动物技术有限公司为心肌缺血(MI)模型,大鼠被腹腔注射戊巴比妥麻醉(50毫克/公斤)。心脏电生理学是动态监控使用心电图机在制模周期。心包是打开后暴露心脏左胸。4:0丝绸四周缝合结扎冠状动脉左前降枝从它的起源(小伙子)3 - 4毫米。然后,心回到了胸部和胸部被关闭切口。sham-operated老鼠做过同样的手术,但是没有小伙子结扎。成功的MI老鼠被随机分为三组( 在每组)治疗:模型中,低剂量HJT (low-HJT;0.2 ml / 100克),高剂量HJT (high-HJT;0.4毫升/ 100克)。两个尾静脉注射的治疗有每天一次连续七天而虚假的和模型组收到了一个等价的盐水。

2.8。超声心动图和血流动力学测量

M-mode和脉冲波多普勒超声心动图的二尖瓣流入进行使用Vevo 2100成像系统(Vevo,加拿大)和多功能测谎仪(mp - 150, biopac)。左心室(LV)射血分数(EF %),部分缩短(FS, %), LV卷(LV卷;年代,μl)和平均峰值速度(峰值韦尔,mm / s)测量心脏功能的指标。

2.9。梗死面积测量和免疫组织化学分析

在实验的最后,老鼠被腹腔注射戊巴比妥麻醉(50毫克/公斤)和老鼠的心脏很快被删除。心在生理盐水清洗和平均切成五块。片在37°C 1% TTC孵化解决方案5分钟。TTC染色的组织鲜红而梗塞面积仍是灰白色。片用数码相机拍摄。片总面积的梗死面积比计算图像+软件。

免疫组织化学检测其他心收获。进行免疫组织化学检测自噬后心肌缺血的标志。心在10%福尔马林固定,石蜡包埋。心肌组织石蜡包埋切片,孵化与LC3B蛋白的单克隆抗体。阳性染色(褐黄色)是在光学显微镜下识别。

2.10。统计分析

所有的值表示为±SD的手段。单向方差分析是用来分析各组之间的差异。统计分析了使用GraphPad棱镜。 小于0.05的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。HJT注入降低了H / R-Induced H9c2心肌细胞氧化应激

清除的1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)自由基被认为是评价的标准测定抗氧化活性的天然产品(23]。验证HJT的抗氧化活性,DPPH自由基清除试验应用与不同浓度确定HJT样本。结果表明,HJT表现出满足IC与清除氧自由基的影响500.35毫克/毫升(图1(一)HJT的固体含量为46.47毫克/毫升)。

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图1
HJT抑制氧化应激在H9c2心肌细胞H / R。(a)清除DPPH自由基的HJT不同浓度。(b) HJT注入对MDA的含量的影响(c)荧光显微镜与H H9c2心肌细胞染色2DCFDA接触1 h缺氧和1 h后再氧化有或没有HJT治疗,酒吧,规模50μm。# # 与对照组没有H / R, 与H / R单独治疗组。

我们进一步评估HJT的心血管效应与H / R损伤心肌细胞。丙二醛(MDA)的生物氧化应激测量评估氧化损伤(24]。如图1 (b),H / R治疗增加细胞内MDA含量H9c2心肌细胞与对照组相比,和HJT治疗逆转的变化。此外,线粒体氧化应激往往是由于增加细胞内活性氧(ROS)的形成。ER应激引起的活性氧经常引发自噬和凋亡增效剂(25]。因此,H / R-induced活性氧的积累是通过荧光显微镜来衡量的。正如所料,H / R治疗诱导高水平H9c2心肌细胞的活性氧和HJT作为活性氧清除剂降低H / R-induced ROS生产。

3.2。HJT增加细胞活力和ATP水平和调节线粒体氧消耗H / R-Induced H9c2心肌细胞

线粒体是细胞功能的电力生产工厂在心脏能量代谢和发挥重要作用的过程中H / R-induced心肌细胞凋亡[26]。缺氧会导致一系列的线粒体的结构和功能的变化,包括受损ATP合成,增加线粒体质子漏,尤其是ROS生成的破裂是决定(27]。我们的实验表明,这些细胞被有效保护HJT不同浓度从H / R损伤(图2(一个))。作为一个特定参数的线粒体功能,心肌细胞暴露于氧化应激细胞内ATP含量测定。缺氧细胞暴露在12 h后紧接着1 h再氧化,ATP的含量明显下降,而HJT治疗导致ATP含量的恢复(图2 (b))。HJT对线粒体功能的影响进一步研究通过测量在H9c2心肌细胞(细胞呼吸28]。如图2 (c)、基底呼吸H / R-treated心肌细胞与对照组相比显著下降。预培养的HJT减耗氧量显著的减少(6.09±0.61,3.87±0.61,5.69±0.49 nmol O2控制/ ml / min, H / R,和HJT-treated细胞,职责)。这些结果表明,HJT促进细胞存活和加强线粒体的功能。

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图2
HJT减少细胞死亡和加强线粒体的功能。(a - b)细胞生存能力(h (a), 24 h / 2 h R)和ATP水平((b), 12 h h / 1 h R) MTT比色是化验和CTG化验。(c) HJT注入对线粒体耗氧率的影响。曲线代表的耗氧量记录Clark-type氧电极,和H / R-injured细胞preincubated HJT。结果从三个独立的实验。# ,# # 与对照组没有H / R, , 与H / R单独治疗组。
3.3。HJT减毒H / R-Induced H9c2心肌细胞的凋亡

证据表明,抗氧化剂抑制心肌细胞H / R-induced氧化损伤和细胞凋亡,这已经成为一种新的治疗策略在H / R损伤的治疗29日]。因此,我们首先研究了H9c2心肌细胞的凋亡率与HJT通过流式细胞术治疗后。暴露H9C2心肌细胞H / R导致细胞凋亡率增加,而治疗HJT降低细胞凋亡率(图3(一个))。

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图3
HJT抑制细胞凋亡。(一)H / R-induced细胞凋亡率被流式细胞术量化。(b) apoptosis-related蛋白质免疫印迹分析:bcl - 2,伯灵顿,裂解细胞中半胱天冬酶3组。

根据上一步的结果,apoptosis-related蛋白质被选作进一步调查。细胞凋亡是由apoptosis-regulating蛋白质,分为两大类:proapoptotic蛋白质(如伯灵顿)和凋亡蛋白质(例如,bcl - 2)。此外,半胱天冬酶家族充当发起者和凋亡的执行者;例如,caspase-3是细胞凋亡的重要标志之一30.]。如图3 (b)H / R导致降低裂解半胱天冬酶3 bcl - 2表达和/伯灵顿比率。HJT治疗增加了水平的叶的半胱天冬酶3和bcl - 2 /伯灵顿比率。这些数据表明,另一个途径可能参与细胞凋亡受HJT。

3.4。HJT促进自噬在H / R-Induced H9c2心肌细胞

据报道,一些通路调节自噬和凋亡机械,虽然自噬可以配合细胞凋亡(31日]。自噬作为细胞生存机制延迟凋亡细胞死亡后DNA损伤(32]。因此,我们决定HJT能否诱导自噬在H9c2心肌细胞暴露于H / R。我们测量的蛋白质含量LC3-I、LC3-II Beclin, mTOR, AKT, ERK评估HJT是否能够激活autophagy-related H9c2心肌细胞信号通路。如图4(一)的表情LC3-II Beclin,自噬的两个标记蛋白质,减少在H / R-induced组。相反,HJT治疗可以增加LC3-II的表达式和Beclin与H / R损伤心肌细胞。PI3K / AKT和MEK / ERK是两个主要途径,可以激活自噬。根据西方墨点法的结果,很明显,H / R-induced增加HJT phos-ERK和phos-AKT表达被抑制的治疗。此外,mTOR的蛋白质含量增加H / R组和减少HJT组(图4 (b))。以上这些数据建议HJT可以促进自噬在H / R-induced H9c2心肌细胞。

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图4
HJT促进自噬流量在H / R-induced H9c2心肌细胞。(a) autophagy-related蛋白质免疫印迹分析:LC3-I, LC3-II, Beclin, P-ERK,兵,P-AKT和AKT。H9c2 24 h和心肌细胞受到缺氧复氧2 h。(b)蛋白表达水平的mTOR决心通过免疫印迹分析。(c)和缺氧治疗后12 h后跟2 h再氧化,H9c2心肌细胞都含有MitoTracker绿色(1μ米)和LysoTracker红色(1μ米)。共焦显微镜捕捉到的图像,酒吧,5μm。(d)心肌细胞在不同的电子显微图组(50000×)。黑匣子表明自噬小体;比例尺,0.2μm。

更直接的证据来验证上述假设,线粒体和溶酶体与荧光可视化MitoTracker绿色和红色LysoTracker [33],和TEM也执行[34]。在控制细胞,线粒体和溶酶体的荧光标签的可视化,而荧光增加H / R和HJT细胞组(图4 (c))。此外,TEM检测证实自噬小体的积累与double-membraned结构H / R-induced H9c2心肌细胞,和变化进一步提升HJT治疗组(图4 (d))。

3.5。HJT减少心肌损伤和心肌梗死大鼠心脏功能的改善

验证HJT可以逆转心肌梗死引起的心脏功能的损害,老鼠接受了7天,冠状动脉结扎和随后超声心动图和血流动力学测量进一步执行。如数据所示5(一个),5 (b),5 (c),5 (d),5 (e),HJT升级EF %的价值,FS %和峰值或者在MI的心和LV卷的价值大大下降。没有虚假的组观察梗塞面积虽然明显梗死区域观察模型组大TTC证明了负染色区域(图5 (f))。低收入和高剂量HJT治疗组与模型组相比明显减少梗塞区(21.84±2.58,17.56±2.45,15.78±2.51在模型中,低剂量、高剂量的HJT,职责)。自噬的LC3B是一个重要的标志,这是根据以前的报告(35]。MI心显示LC3B阳性细胞的重要积累,由HJT进一步提升(图6)。总的来说,这些数据表明HJT治疗降低梗塞大小和提高细胞生存能力和心脏表现促进自噬的MI损伤大鼠模型。

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保护HJT对实验性心肌缺血大鼠的影响。(一)超声心动图在不同群体的形象代表。(中)评价左心室的射血分数(EF %) (b),部分缩短(FS %) (c),平均峰值速度(峰值韦尔)(d), (e)和左心室收缩卷。(f)代表图像的老鼠心脏切片和量化的心脏梗塞大小在不同的组( )。# # 而虚假的集团 , 而小伙子独自结扎治疗组。

图6
的表达LC3B化验了免疫组织化学染色分析细胞自噬,酒吧,规模50μm。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们描述一个抗氧化损伤能力的HJT调控自噬和凋亡的平衡。我们的研究结果支持途径其中一种蛋白激酶和ERK可能参与HJT-induced Beclin-1 mTOR-dependent自噬。因此,我们的研究结果强调监管平衡HJT自噬和凋亡的心肌氧化损伤。自噬和凋亡是两个自我毁灭的过程,负责各种细胞内稳态的功能。cytoprotective自噬的功能被广泛接受在调节细胞凋亡的负面调制在许多情况下,尤其是心血管疾病(31日]。心肌细胞自噬对维持细胞功能和生存至关重要;缺乏自噬可能导致心脏肥大,左心室扩张和收缩功能障碍。因此,自噬激活对心肌细胞的保护作用,减少氧化损伤程度(36]。在这项研究中,我们发现HJT H9c2保护心肌细胞H / R-induced氧化应激损伤通过改善H9c2心肌细胞自噬和抑制细胞凋亡。心肌细胞自噬也观察到心肌梗死模型HJT治疗后心脏功能的改善。自噬引起HJT可能导致调节线粒体的耗氧量,增加ATP水平,减少细胞内ROS水平和MDA含量。

自噬迅速由营养饥饿、生长因子,或氧化损伤;协调复杂的调节细胞凋亡和自噬的机制尚未完全了解。本地化的哺乳动物自噬基因Beclin-1是重要的自噬蛋白质pre-autophagosomal结构,根据互动类III-type磷酸肌醇3-kinase (PI3KC3)。PI3K-Akt-mTOR信号通路的激活可以通过抑制自噬促进坏死细胞死亡(37]。在我们的研究中,我们发现H / R导致P-AKT / AKT比率的增加和减少Beclin-1,和HJT治疗的比率下降P-AKT / AKT和改进Beclin-1水平。所有HJT-treated组显示上升趋势LC3-II相比H / R组。此外,bcl - 2结合Beclin-1和抑制自噬38];它在我们的结果没有被观察到。这些数据表明,Beclin-1 / AKT通路可能扮演重要的角色在HJT-induced心肌氧化损伤后自噬。

mTOR调节器的自噬是一个巨大的消极影响。它可以由PI3K / AKT激活和MEK / ERK (39,40),然后负调节的活动autophagy-initiation通过磷酸化激酶ULK1复杂(41]。我们的结果进一步证实了磷酸化ERK和mTOR蛋白质含量增加后H / R和HJT治疗的比例下调P-ERK / ERK和mTOR表达式。有剂量依赖性降低趋势P-ERK / ERK比率比H / R组从世行乐队。考虑我们的组织学证据和TEM结果,我们可以得到一个结论:HJT可以促进自噬。这些发现可能表明mTOR coregulated AKT和ERK途径也参与HJT-induced心肌氧化损伤后自噬。

5。结论

总之,我们的研究表明,HJT调节的可行性,ATP水平,心肌细胞线粒体氧消耗和改善心肌梗死大鼠心脏功能,促进自噬和抑制细胞凋亡。我们提供的证据表明,涉及一种蛋白激酶的激活机制/ Beclin-1 AKT、ERK / mTOR在心肌细胞自噬通路。工作提供了新的机械的见解HJT疗法和地方心肌细胞自噬是一个关键因素,改善心肌梗死后的心脏功能。

缩写

HJT: Hongjingtian注入
H / R: 缺氧/复氧
小姐: 心肌缺血。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

凌Shujing张和张本文是相等的贡献者。

确认

这项工作是支持的资助来自中国浙江省自然科学基金(没有。LR16H280001),中央大学的基础研究基金(2017号。2017 fza7011 fza7015)和吉林省的技术项目(20170203005 yy)。