文摘
Polyphenols-rich可可有许多有益的对人类健康的影响,如抗炎作用。巨噬细胞作为免疫系统的控制开关,维护支持和抗炎活动之间的平衡。我们调查了假设可可多酚提取可能影响(而非另一种巨噬细胞炎性表型M1, M2在巨噬细胞抗炎状态源于THP-1细胞。化学成分、总酚含量和抗氧化能力的可可多酚提取烤可可豆被确定。THP-1细胞被激活与脂多糖和干扰素-γ为M1和il - 4平方米开关,和特定的细胞因子被量化。细胞新陈代谢,通过线粒体氧消耗和ATP水平进行评估。在这里,我们将展示,可可多酚提取物的体外炎症减少M1巨噬细胞反应,表现出显著降低促炎细胞因子的分泌。此外,治疗M1的巨噬细胞与可可多酚影响巨噬细胞通过促进氧化代谢通路,从而导致显著增加O2消费由线粒体复合物以及更高的ATP生产通过氧化磷酸化。总之,可可多酚提取物抑制炎症介导和M1表型的影响巨噬细胞的新陈代谢促进氧化途径和M2巨噬细胞极化的活跃。
1。介绍
Monocyte-derived巨噬细胞在炎症起到至关重要的作用,宿主防御和组织修复1,2]。巨噬细胞有重要的致病作用在许多慢性疾病,如哮喘、炎症性肠病、动脉粥样硬化,风湿性关节炎,和纤维化(2- - - - - -4]。许多研究都试图模拟体外单核细胞向巨噬细胞分化的过程中,通过文化的单核细胞有或没有添加不同的细胞因子5]。巨噬细胞的表型和功能的灵活性是一个关键属性(6- - - - - -9]。体内,人类巨噬细胞可分为两类根据他们的激活状态。古典M1表型和另一种M2表型特征的基础上,对不同刺激的反应。在过去的几年里,已经取得了相当大的进展对表观遗传机制的描述,转录和转录后的因素调节巨噬细胞极化(10]。带动了M1激活细胞因子干扰素(IFN)γ通常的激活的toll样受体)脂多糖(LPS),而M2激活触发白介素- 4 (IL) (6]。现在知道其他介质,除了il - 4,以及IL-13可以推动M2极化(11,12]。然而,M1和M2表型是多种功能的两个极限状态,构成复杂的巨噬细胞的灵活性(13- - - - - -15]。M1巨噬细胞的特点是高生产的促炎细胞因子(包括肿瘤坏死因子(TNF)α,il - 1β、il - 6和il - 12)和活性氮和氧物种(RNS (ROS),促进辅助T - (h) 1细胞表达干扰素-γ响应和拥有强大tumoricide和杀微生物剂活动(15]。另一方面,M2巨噬细胞免疫调节功能,一个高效的吞噬活性和特点是高水平的扫气分子,通过鸟氨酸和多胺的生产精氨酸酶途径和甘露糖和半乳糖受体的表达9]。
发病的病理状态是经常与动态变化相关巨噬细胞刺激;事实上,M1巨噬细胞参与发起和维持炎症而M2巨噬细胞与决议或慢性炎症7,16]。体外和体内分化表型是可逆的17- - - - - -19]。调制巨噬细胞功能的脱靶效应等各种治疗因子STAT3 / STAT6抑制剂,imidazoquinolines、过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR),γ受体激动剂,CD40 [6]。
食品生物活性化合物,如茶多酚,最近得到了考虑他们的抗炎作用,这可能会影响巨噬细胞表型支持另一种M2抗炎状态。这是表明,石榴多酚剂量依赖性衰减J774巨噬细胞M1促炎反应激活。A1 macrophage-like细胞系(20.]。这是由显著减少促炎细胞因子分泌干扰素刺激——反应γ有限合伙人和il - 10的显著增加分泌促进M2抗炎的分化表型(20.]。
各种体外炎症反应的差别研究认为对这些可可多酚。可可,一个产品的豆子中提取出来的Theobroma可可植物,富含单体的多酚抗氧化剂,主要表儿茶酸和儿茶素,和各种聚合物来自这些单体,确定为原花青素(21]。可可有强大的抗氧化能力,与其他产品相比22),与总黄酮含量(23]。除了其强大的抗氧化特性,可可多酚被证明具有显著的抗炎作用[24]。体外,黄酮类化合物在可可减少炎性细胞因子(TNF -的生产α、il - 6和il - 1β)、活性氧和RNS LPS-stimulated巨噬细胞(25]。在一个健康的意大利南部人口,定期摄入黑巧克力是血清c反应蛋白水平成负相关26,27]。此外,可可治疗被证明是有效的在预防心血管疾病和调制的血压在动物和人类研究[20.- - - - - -30.]。在炎症条件下的影响方面,他们仍需进一步探索31日]。在动物模型的疾病,如炎症性肠病、关节炎、结肠炎、可可多酚减少炎症反应和氧化应激(32,33]。在这种背景下,可可可以调节免疫系统,特别是系统和肠道免疫反应和炎症先天反应(34]。
关于可可类黄酮调节免疫功能的机制,已经建议他们减少氧化还原敏感的核因子kappa-light-chain-enhancer激活B细胞(NF-kB)激活和,因此,许多基因的表达参与了细胞因子分泌(24,35,36]。他们也可以直接与基因表达因素和细胞信号参与细胞因子分泌,如激活蛋白1 (AP-1) [37)和信号传感器和转录激活4 (STAT4) [38]。还需要进一步的研究来阐明可可和redox-sensitive信号通路之间的交互涉及到许多基因的表达,因此,在几个细胞功能,如免疫反应。
与巨噬细胞相关的分子识别机制和灵活性和极化将macrophage-centered诊断和治疗策略提供依据。尽管先前的研究表明,可可多酚具有抗炎作用,我们所知,可可多酚的研究集中在直接影响巨噬细胞炎性表型上从未执行。
在这项研究中,我们调查了假设可可多酚提取物可能通过代谢影响巨噬细胞极化切换促进M2抗炎状态。
2。材料和方法
2.1。可可多酚提取
在本地可可豆,商用,是来自加纳,非洲西部。多酚提取进行了如前所述[26与一些修改如下所示)。去除油脂,可可豆(3 g)与石英砂磨成粉末,然后在10毫升的己烷漩涡,离心5分钟在800×g和4°C。己烷提取重复了三次。随后,脱脂可可粒溶解在10毫升的甲醇/水解决方案,70:30 (v / v),多酚提取三个离心800×g和4°C 5分钟。可可多酚提取过滤和蒸发直到干在旋转蒸发器。最后,样品溶解在甲醇/水/醋酸溶液,70:28日:2 (v / v / v)。
2.2。测定酚类化合物,在可可多酚提取物总抗氧化能力
酚醛可可提取测量的内容修改Folin-Ciocalteu方法利用没食子酸标准(39]。稀释1:40 (v / v)水溶液提取(20μ与Folin-Ciocalteu混合试剂(100 l)μl)和孵化了Na2有限公司31.89米2小时。吸光度测量在765 nm的多功能微型板块读者(无限米200 Pro TECAN、意大利)在样品一式三份分配96孔细胞培养板(他一一Bio-One,德国)。没食子酸的结果表示为毫克当量(GAE) / l。
可可提取物总抗氧化能力测定使用Trolox等效抗氧化能力(问题)试验40]。简单地说,10μ与200年l可可多酚提取的混合μl (abt+解决方案在96孔细胞培养板和吸光度被记录在734 nm 90秒的多功能微型板块读者(无限米200 Pro, TECAN、意大利)。问题从Trolox值计算标准曲线(60 - 300μ米)。
2.3。rp / PDA /女士可可多酚提取的分析
可可多酚萃取物,rp / PDA / MS分析之前,被过滤到0.45μm Acrodisc过滤器(笼罩在生命科学,安阿伯市,美国)。
高效液相色谱分析,进行2μl的注入量,进行了如前所述[40]。特别是,包含水流动相(Sigma-Aldrich) /甲酸(Riedel-de一点儿,汉诺威,德国)(99.9:0.1,(v / v))(溶剂)和乙腈(Sigma-Aldrich) /甲酸(99.9:0.1,(v / v))(溶剂B),逐步梯度剖面如下:0分钟,5% B;30分钟,30% B;35分钟,100% B;和36分钟,0%流量为0.7毫升/分钟。一个SPD-M20A紫外检测器和一个lcms - 2020了。获得的数据是一个光电二极管阵列(PDA)探测器在190 - 400海里。时间常数为0.64 s和采样频率1.5625赫兹。收购女士进行了使用ESI接口(日本岛津公司),在负模式由LCMS解决方案版本。3.30软件(日本岛津公司)。200年μl整个LC的流量直接接口,和总流交换浪费(500μ(200 l)和接口μl)通过流分配器。应急服务国际公司条件:质量光谱范围,m / z100 - 1200;即使时间,1 s;扫描速度,1154年阿姆河/ s;喷洒气体(N2)流,1.5升/分钟;ESI温度、300°C;加热块,300°C;DL(反溶剂线)温度,250°C;DL电压,34 V;+ 4.5 kV探头电压;Qarray电压1.0 V;和检测,1.05 kV。
2.4。细胞培养和分化
写明ATCC的THP1细胞系收购和培育RPMI 1640中(Lonza、比利时)补充10%胎牛血清(的边后卫;Lonza、比利时),1毫米谷酰胺(Sigma-Aldrich、米兰、意大利),100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)5%的股份有限公司2在37°C给最终的浓度大约2×105细胞/毫升。THP-1细胞72小时分化成巨噬细胞(M0)通过刺激100 ng / ml佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA、Sigma-Aldrich、米兰、意大利)。后巨噬细胞分化、细胞培养24小时与有限合伙人(1μg / ml) +正-γ20 ng / ml生成M1-macrophages,或与il - 4 (20 ng / ml)生成M2-macrophages [41),在没有或可可多酚提取的存在在不同浓度表示为μGAE数据表明。
2.5。细胞生存能力
M1-polarized细胞被播种在浓度为80000细胞/多层板和孵化24小时没有(控制)和在可可多酚提取物(0.1 -100μΜGAE)。先后、细胞培养基是丢弃,每个洗了200年μl汉克的平衡盐溶液(hbs + Gibco沃尔瑟姆,妈,美国)。麻省理工的解决方案(0.5毫克/毫升,100μl Sigma-Aldrich、米兰、意大利)被添加到每个细胞,和板在37°C + 5%孵化有限公司2大约3个小时,直到MTT甲瓒晶体中可见文化液体。然后MTT解决办法是删除,二甲亚砜(DMSO、Sigma-Aldrich、米兰、意大利)(70μ信用证)被添加到每个对溶解甲瓒晶体。光密度(OD)以565海里使用多功能标(无限米200 Pro, TECAN、意大利)。生存能力计算的比率的均值OD获得每个条件的控制没有可可多酚提取条件。
2.6。细胞因子的分泌
cell-released肿瘤坏死因子的水平α、il - 6、il - 1β在收获、il - 12、il - 10测定上清液通过使用ELISA Ready-Set-Go工具包(eBioscience、圣地亚哥、钙、美国),遵循制造商的指示。使用微型板块读者无限的光密度测定米200 Pro, TECAN(意大利)。
2.7。评估线粒体呼吸活动
线粒体的耗氧量测量与Clark-type氧电极polarographically温控器气密室(Hansatech仪器,诺福克,英国)42,43]。测量substrate-supported呼吸进行了完整的指数增长的细胞。培养基是改变了化验前1天。细胞使胰蛋白酶化、离心机和resuspended在2×106细胞/毫升0.137 M氯化钠,氯化钾5毫米,0.7毫米Na2HPO4,25毫米Tris-HCl, pH值7.4。整除的细胞悬液用于计数和蛋白质的决心。细胞被转移到极谱室。呼吸率的测量通过外源性底物,全部拆开后的完整细胞的内源呼吸30μ二硝基酚(DNP)、洋地黄皂苷(30μ克/ 106细胞)补充道。2分钟后,加入呼吸底物如下:丙酮酸苹果酸(5毫米)/(2.5毫米)对于复杂的我,琥珀酸(5毫米)对于复杂II +复杂三世,抑制剂的存在复杂的我,和鱼藤酮(200海里)和复杂III的抑制剂抗霉素A(13海里)。大量的氧气消耗都是归一化细胞蛋白质含量。
2.8。ATP测定
基底条件下细胞ATP水平是衡量一个光度计(无限米200 Pro, TECAN,意大利)与ATP lite工具包(珀金埃尔默,沃尔瑟姆,MA)通过luciferin-luciferase反应系统,根据制造商的指示。从THP-1细胞巨噬细胞分化M0、M1、M2极化细胞收集从培养皿0.05%胰蛋白酶、0.02% EDTA,颗粒状在500×g离心,在磷酸盐(PBS)洗,pH值7.4。对于每一个试验,60000多井细胞板被使用。ATP评估内容在严格的糖酵解条件下,M0、M1、M2和孵化5小时37°C在鱼藤酮的存在(1更易/ l)的抗霉素A(1更易/ l) (44]。ATP校准曲线使用已知的ATP浓度的解决方案。一个整除的细胞溶解产物用于量化蛋白质含量。
2.9。统计分析
为了评估剂量反应的影响,我们采用了单向重复测量方差分析,而处理和未经处理的M0之间的差异,M1, M2细胞被双向分析重复测量方差分析(双因素重复)。Student-Newman-Keuls方法被用来作为所有成对多重比较的过程。结果给出了平均数±标准差。的值被选为统计上的显著差异的标准。
3所示。结果
3.1。可可多酚提取特征:总酚含量、抗氧化能力和化学成分
总酚含量和可可多酚提取物的抗氧化能力测定Folin-Ciocalteu和问题分析,分别。表中给出的结果1表明,总酚含量的值,表示为毫克没食子酸当量(GAE) / l,反映了抗氧化活性,表示为毫米Trolox等效(TE) / g新鲜质量,可可提取物。
通过HPLC-PDA-MS定性分析,化学成分的可可多酚提取决心(图1、表2)。我们可以看到从报告的色谱图1,样品分析包含23个生物活性分子。酚酸、flavan-3-ols alcaloids,花青色素代表样本的一类生物活性分子存在于我们的兴趣。
3.2。可可多酚增加生存能力和减弱巨噬细胞炎症反应
测试可可多酚类物质对细胞的生存能力和炎症反应的影响,THP-1巨噬细胞与CPE的浓度增加,孵化表示为μΜGAE (0.1 -100μΜGAE),早期接触M1激活诱导的正-γ和有限合伙人。
提出了图2(一个)、可可提取高达100μΜGAE浓度未显示毒性对分化细胞。事实上,在暴露于更高浓度的可可提取物5μΜ多达100μΜGAE 24小时,细胞生存能力显著增加。特别是,可可提取物,享年100岁μΜGAE相比增加了大约30%的细胞生存能力来控制(图2(一个))。
(一)
(b)
(c)
后来,调查可可多酚提取物对炎症反应的影响,生产的促炎细胞因子,il - 1β(图2 (b))和il - 6(图2 (c)),量化在M1炎性巨噬细胞剂量依赖性的方式。浓度范围从5μΜ多达100μΜGAE被选中,因为它有显著提高细胞生存能力(图2(一个))。结果显示在图2 (b)和2 (c)表明,可可提取物减毒巨噬细胞M1促炎反应激活(在100年减少约30%μΜGAE)的促炎细胞因子。
3.3。可可提取影响巨噬细胞M1, M2表型开关
调查可可多酚提取的影响(CPE)替代M2巨噬细胞表型,促炎和抗炎细胞因子的分泌是确定和控制基础水平相比未处理的细胞。CPE显著降低巨噬细胞M1激活反应通过减少促炎细胞因子的分泌TNF -α(图3(一个))和白介素(图3 (b))M1表型高达20%和30%,分别比未经处理的细胞。此外,CPE增加了抗炎的释放il - 10 47%(图3 (c)在M1巨噬细胞)。可可提取物不施加任何影响细胞因子分泌M0和M2巨噬细胞。总的来说,这些结果表明,可可提取物不仅可以减少炎症细胞M1也促进巨噬细胞极化对M2替代表型。
(一)
(b)
(c)
3.4。可可多酚提取物对M1 / M2的影响通过代谢表型开关
巨噬细胞代谢均通过测量细胞ATP水平(图4)和耗氧量的线粒体复合物(图5)分化THP-1 (M0)和偏振M1和M2细胞。结果呈现在图4代表了ATP水平严格糖分解的条件下,在线粒体呼吸链抑制剂的存在所述材料和方法。
(一)
(b)
(一)
(b)
结果呈现在图4(一)表明,ATP水平没有降低M1巨噬细胞,在鱼藤酮和抗霉素a。另一方面,M0和M2细胞,他们在线粒体的存在显著降低抑制剂。在图4 (b)可可多酚提取的影响对ATP水平估计M0、M1、M2。结果呈现在图4 (b)表明,可可多酚提取物治疗后,巨噬细胞内的ATP含量降低了M1,鱼藤酮和抗霉素M0、M1几乎在同一水平。然而,可可提取物没有影响ATP水平M0和M2巨噬细胞相比,未经处理的细胞。
然后,耗氧量进行测量评估线粒体功能在巨噬细胞表型。复杂的活动我(图5(一个))、鱼藤酮敏感和复合体II + III(图5 (b)),抗霉素敏感,表示为nmol O2/ mg总蛋白质,低比M2细胞M1巨噬细胞。孵化的可可多酚提取物诱导的耗氧量显著增加M1的线粒体复合物(数字5(一个)和5 (b)),因此,建议更多的氧化代谢表型平方米。可可对M0和M2巨噬细胞治疗没有效果。
4所示。讨论
这项研究展示了小说发现可可和其多酚类物质的抗炎作用,体外THP-1-derived巨噬细胞模型。第一次我们展示,可可提取物显著抑制促炎细胞因子的分泌TNF -α、il - 6、il - 1β在INF白介素-γ/ LPS-stimulated巨噬细胞相同的比例,增加细胞活力(约30%),而控制。更有趣的是,然而,这一发现与可可polyphenol-induced生产M1巨噬细胞炎症的抗炎细胞因子il - 10的水平所观察到的类似M2状态。因此,可可治疗后,M1巨噬细胞表现出相同的水平的il - 12、il - 10在M2表型。总之,可可治疗后,巨噬细胞M1与M2细胞对细胞因子的生产,这表明可可可以促进转向另一种M2巨噬细胞表型。我们的研究结果还表明,可可提取影响巨噬细胞新陈代谢,增加ATP生产通过氧化磷酸化和O2消费在M1巨噬细胞线粒体呼吸复合物。ATP生产氧化磷酸化被阻塞的NADH脱氢酶或复杂的我,这是第一个蛋白质在电子传递链,鱼藤酮和细胞色素c还原酶水平的或复杂的三世,代表第二个质子的泵通过抗霉素a复合物有助于产生电化学梯度跨线粒体膜用于ATP的合成氧化磷酸化。在M1巨噬细胞,在鱼藤酮和抗霉素A, ATP水平并不改变,所以M1表型主要由其他人(糖酵解代谢作为确认16]。另一方面,ATP水平减少M2细胞中线粒体抑制剂的存在一个重要的方式,因此,这表明一个整除细胞ATP的氧化磷酸化产生的,因此,M2表型展品氧化代谢。一旦确定了M1和M2糖酵解/氧化代谢,M1巨噬细胞产生更多的ATP通过氧化磷酸化后,可可多酚治疗。减少糖酵解ATP的M1细胞表明这种表型获得更多的氧化代谢的可可多酚,类似于M2表型。然而,可可提取物并不影响ATP水平M0和M2巨噬细胞。
耗氧量测量,在巨噬细胞表型表现评估线粒体功能,特别是活动复杂的我,鱼藤酮敏感,和复合体II +三世,抗霉素敏感,表明,M1巨噬细胞耗氧量降低线粒体呼吸链。因此,M1细胞显示较低的呼吸能力和高水平的糖酵解ATP。相反,线粒体复合体I和II + III消耗更多的氧气在M2巨噬细胞,表明这些细胞有良好的呼吸能力。的可可、耗氧量,复杂的我在M1和M2细胞相似。可可治疗对M0和M2巨噬细胞没有影响。这表明,可可黄酮类化合物,由于其抗氧化活性,主要在复杂的层面上我,这是氧化还原敏感。因此,可可多酚提取不仅抑制炎症巨噬细胞炎性表型也改变巨噬细胞新陈代谢,促进氧化途径。
酚类化合物主要存在于可可豆提取物属于类黄酮组,强效抗氧化剂作用于炎症通路和免疫系统31日,45]。我们在这项研究中表明,可可类黄酮,现在在一起的可可提取物,在极化巨噬细胞有显著的抗炎效果,正如前面演示了对其他食物,例如,石榴汁(20.]。虽然在等离子体浓度可可类黄酮及其代谢产物是人类低(46,47),研究基于flavonoid-enriched cocoa-derived产品增强生物利用度是持续的48- - - - - -50]。在这种背景下,据报道,在健康受试者,(−)表儿茶素达到最大浓度为5.92±0.60μmol / l 2 h后消费的0.375 g可可/公斤的身体wt.黄烷醇含量高的可可饮料饮料(51]。此外,它必须考虑的循环和巨噬细胞不区分来自动物模型的数据组织和/或报道积累存在剂量依赖的相关性(52,53]。因此,我们的体外结果表明体内研究设计的一个有趣的假设。可可多酚体外的抗炎作用,演示了在这项研究中,可能会由于黄酮类化合物存在于可可豆的生物利用度,但确切的机制,他们进入细胞和分子途径尚不清楚。有证据表明,某些可可类黄酮可以直接与细胞信号传导和基因表达因素相互作用,调节许多细胞因子基因的表达(54,55]。进一步的研究需要阐明可可和细胞生理学之间的交互,从而贡献知识的食品化合物对健康的影响。
5。结论
目前的工作表明,可可多酚提取物(i)是能够降低M1巨噬细胞的炎症反应,有利于抗炎细胞因子的分泌;(2)诱导极化巨噬细胞表型转换,有利于消炎或替代M2-state;(iii)和影响巨噬细胞的新陈代谢,有利于氧化途径。在这项工作中,我们演示了可可和其多酚类物质的抗炎和代谢影响极化巨噬细胞,表明极化可可对M2表型的能力。使用可可作为饮食补充剂或预防疾病,需要更多的工作来更好地评估可可多酚提取的影响主要细胞系和/或体内和识别所涉及的分子信号通路或M1 / M2代谢开关,由可可多酚提取物诱导。
缩写
| 复杂的我: | NADH脱氢酶 |
| 复杂的二世: | 琥珀酸脱氢酶 |
| 复杂的三世: | 细胞色素c还原酶 |
| CPE: | 可可多酚提取 |
| GAE: | 没食子酸当量 |
| 干扰素-γ: | 干扰素-γ |
| il - 1β: | 白介素1β |
| il - 10: | 白介素10 |
| il - 12: | 白介素12 |
| il - 6: | 白介素- 6 |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| PDA: | 光电二极管阵列 |
| PMA: | 佛波醇12-myristate 13-acetate |
| RNS: | 活性氮物种 |
| ROS: | 活性氧 |
| 问题: | Trolox等效抗氧化能力 |
| 通常: | toll样受体 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
劳拉Dugo和玛丽亚乔凡娜Belluomo同样导致了这项工作。毛罗·Maccarrone和安娜玛丽亚Sardanelli同样的资深作者。
确认
这项工作得到了当地资助2014大学的巴里(意大利)“研究和流动性”项目,墨西拿大学(意大利)。