文摘
雷帕霉素(MTOR)的机械的目标蛋白是哺乳动物细胞的关键信号调节器,广泛参与细胞生物学。MTOR信号在角化细胞的功能尚不清楚。在这项研究中,我们发现MTOR信号和自噬反应在人类角化细胞细胞系HaCaT和人类表皮角化细胞MTOR对待。此外,我们发现MTOR的影响共同致癌压力角化细胞暴露在紫外线B (UVB)和UVA辐射。因此,角化细胞MTOR雷帕霉素敏感,everolimus,托林1,pp242,但MTOR下游信号的规定是不同的。接下来,HaCaT细胞自噬诱导只观察雷帕霉素治疗。此外,我们发现MTOR信号不敏感UVB但对UVA辐射敏感。UVB治疗也没有影响抑制MTOR MTOR的信号。最后,由雷帕霉素抑制MTOR everolimus或pp242并不影响生物事件的系列角化细胞暴露在UVB,毕普和活跃的差别,包括对这些激活组蛋白H2A、物和caspase-3和PARP的乳沟。我们的研究表明,在角化细胞抑制MTOR不能总是诱导自噬,MTOR通路并没有发挥核心作用的UVB引发细胞反应。
1。介绍
雷帕霉素(MTOR)的机械的目标蛋白是哺乳动物细胞的关键信号调节器。两种类型的MTOR包含复合物在哺乳动物细胞中,发现了MTOR复杂1 (MTORC1)和复杂2 (MTORC2),雷帕霉素不同敏感和显示不同的上游和下游信号(1]。目前,MTORC1信号被发现广泛参与细胞生物学,包括自噬(2),高分子生物合成(3),细胞周期(4,增长5),和新陈代谢6]。
明显的放松管制MTOR信号被发现发生在人类疾病,包括癌症,糖尿病,肥胖,神经退化。因此,有很多正在进行的药物目标这一途径的努力(5]。此外,抑制MTOR路径的延长寿命的生物模型,提供了防止许多类型的年龄相关疾病(7]。重要的是,古典MTOR抑制剂雷帕霉素被发现禁止皮肤鳞状细胞癌的发展与免疫抑制移植患者人群(8]。
MTOR信号间的串扰和其他细胞过程已被确认由于MTOR功能越来越浓的兴趣。例如,MTORC1影响上游和下游内质网(ER)压力信号,而后者也可以促进或对抗MTORC1的输出信号(9]。此外,新兴的证据显示,抑制MTOR信号介导的细胞凋亡在各种条件下的感应;例如,胸腺素α1执行这种效果在乳腺癌[10]。据报道,抑制MTOR的药物治疗,如pf - 04691502 (11],NVP-BEZ235 [12],AZD8055 [13),能促进细胞凋亡,尽管这些抑制剂影响MTOR活动通过MTOR的间接监管而不是中介PI3K信号。事实上,一些直接MTOR也有报告称,诱导细胞凋亡,例如,pp242 [14],temsirolimus [15],everolimus [16]。此外,据报道,抑制MTOR活动可以减弱DNA损伤和细胞凋亡17]。MTOR的多个目标信号通路中,自噬过程中扮演着重要角色在维持细胞内稳态。与此同时,自噬可能调解调节MTOR信号引起的生物效应。
角化细胞是最重要的结构在哺乳动物的表皮细胞类型,构成第一身体障碍对各种压力和入侵18]。MTOR信号在角化细胞的作用尚未完全阐明,尽管它被报道参与角化细胞生物学和病理学。紫外线B (UVB)接触,一个常见的皮肤(压力源19),参与各种皮肤疾病,如晒伤(20.],photocarcinogenesis [21,光老化22),和杀菌作用23]。重要的是,据报道,UVB辐射增加MTOR的级联磷酸化底物4 e - bp1及其分离从eIF-4E通过p38途径在小鼠表皮细胞行(24]。此外,UVB增强的另一个MTOR的磷酸化底物p70 S6激酶,和这种效应被预处理抑制MTOR抑制剂(雷帕霉素),PI3K抑制剂(LY294002),和一个MEK / Erk抑制剂(PD98059) [25]。此外,雷帕霉素治疗防止增加p70 S6激酶磷酸化在UVB刺激后的早期人类角化细胞细胞系HaCaT和显著下降UVB-induced表皮增殖和细胞周期进展在小鼠模型26]。UVB造成皮肤损伤参与了许多类型的细胞DNA损伤等事件(27,细胞凋亡28),ER应激(29日),和激活的关键信号通路(如MAPK的家庭30.],AMPK [31日])。考虑MTOR之间的联系,这些细胞机械,一个有趣的问题需要澄清是否抑制MTOR通路可能影响细胞活动引发的UVB辐射。
澄清MTOR信号在角化细胞的作用,初步工作是确认MTOR信号抑制的细胞反应。尽管许多MTOR合成和利用,报告有关反应MTOR除了雷帕霉素在角化细胞非常罕见。因此,我们首先确定是否四个广泛应用MTOR、雷帕霉素、everolimus,托林1和pp242,在HaCaT人类角化细胞细胞系和初级人类表皮角化细胞(HEKs)。其次,我们确定了两个角化细胞自噬流量与这些MTOR后治疗。最后,我们发现MTOR抑制剂治疗是否会影响细胞反应的两个角化细胞暴露于UVB。因此,角化细胞MTOR雷帕霉素敏感,everolimus,托林1,pp242,但MTOR下游信号的规定是不同的。接下来,HaCaT细胞自噬诱导只观察雷帕霉素处理而不是与其他三个MTOR HaCaT细胞治疗。此外,抑制MTOR没有影响角质细胞暴露于UVB一系列生物事件。
2。材料和方法
2.1。细胞
如前所述(32],HaCaT细胞在DMEM培养(杜尔贝科修改鹰的介质)与10%胎牛血清(Gibco,英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA,美国)。人类主要表皮角化细胞(如前所述33,34)在角化细胞SFM培养介质(Gibco,英杰公司集团,卡尔斯巴德、钙、美国)。
2.2。试剂和抗体
在这项研究中,药品和试剂包括雷帕霉素,10μ10 g / mL E64d,μg / mL抑肽素,吖啶橙(AO)和二甲亚砜(DMSO)(所有从Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),托林1 (Tocris,英国布里斯托尔),pp242 (Abcam、剑桥、马、美国),everolimus(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),和fk - 506队(他克莫司)和pimecrolimus(来自圣克鲁斯、达拉斯、TX,美国)。控制细胞(细胞没有药物治疗或UVB辐射被命名为:(NT))处理0.1% DMSO溶液,用作雷帕霉素溶剂,E64d,抑肽素,托林1,pp242, everolimus, fk - 506队(他克莫司),和pimecrolimus。DMSO溶剂在我们的研究中不超过0.1% (35]。
2.3。UVB或UVA辐射
光源与灯具的UVB(飞利浦UVB宽带PL-S 9 w / 12, Roosendaal,荷兰),交付290 nm和320 nm之间紫外线,达到310海里,被用于这项研究。16厘米的距离,UVB的平均辐照度为1.50 mW /厘米2细胞暴露1,3,5,6.7,13.3,20日和33.3秒到1.5,4.5,7.5,10、20、30、50 mJ /厘米2辐照剂量。UVA(320到400海里)是来自太阳能模拟器使用短弧氙灯(上海σ高科技有限公司,上海,中国。干扰过滤器被装备保持UVA完整性在320到400纳米之间。16厘米的距离,UVA的平均辐照度38瓦/厘米2和细胞暴露4分23秒,10分57秒,21分钟55秒到10,25,50 J /厘米2辐照剂量。接下来,这些细胞被孵化与或不新鲜的DMEM MTOR UVB或UVA照射后直到溶解。
2.4。西方墨点法
里帕裂解缓冲(Beyotime生物技术、海门、江苏、中国)包括蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和磷酸酶抑制剂PhosSTOP(来自罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士)被用来溶解细胞。蛋白质提取后,BCA试验进行确定的上层清液总蛋白水平细胞溶解产物在每个样本。蛋白质等浓度和isovolume加载在4 - 12% NuPAGE Bis-Tris凝胶(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)或4 - 15%迷你千变万化的TG预制聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国),然后被转移到PVDF膜(Bio-Rad实验室)。顺序,膜被封锁在3 - 5%牛血清白蛋白溶液,然后孵化了初级和二级抗体的抗体。最后,化学发光成像法与ImmunStar WesternC化学发光工具包(Bio-Rad实验室)是用于可视化蛋白质乐队。某些蛋白质带的强度(如LC3A / B)量化了数量。GAPDH是用作加载控制。
2.5。细胞增殖实验
溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增殖按照制造商的指示使用酶联免疫试剂盒(罗氏应用科学11647229001号)。短暂,HaCaT细胞被播种在96孔板每口井的20000个细胞的存在与否,并培养MTOR 36小时。接下来,10μM BrdU培养基中添加,孵化是持续了3个小时。BrdU由ELISA决定的公司。根据指令,BrdU的合并是通过以下公式计算:吸光度在370 nm−吸光度在492海里。
2.6。细胞迁移试验
的口的™细胞迁移试验装备我涂(胶原蛋白)是根据制造商的协议(WI CMACC5.101,鸭嘴兽技术有限责任公司,麦迪逊,美国)。HaCaT细胞被播种密度的5×104每在一个口的96 -细胞迁移试验板与细胞播种闭锁装置。细胞培养24小时。细胞阻塞物被移除,和100年μL的新鲜培养基有或没有MTOR被更换,其次是孵化12或24小时。细胞迁移的区域隔离观察闭锁装置,和倒置显微镜下的显微图被捕。细胞迁移区复制了五个独立的实验。没有细胞迁移的地区/测量。细胞迁移参数计算使用以下公式:(−100%没有细胞迁移的地区/区域隔离塞)×100。
2.7。AO染色试验
针对自噬小体,属于酸性液泡结构泡状细胞器(AVO),标签AVO AO着色是用于监测自噬(36,37]。AVOs沾AO记录使用激光扫描共焦显微镜(FV1000、奥林巴斯公司、日本)。染色细胞的细胞核和细胞质AO可视化在深度和轻微的绿色荧光,而这些细胞的AVOs显然是标记为红色荧光(AO G:海里,纳米;AO R:海里,海里)。在每一个细胞,一个更高的红色荧光强度意味着更高的自噬水平。因此,在某种程度上,红色荧光的强度可能会测量反映AVOs的体积比例。自噬水平在不同处理样品测量的平均红/绿荧光比率每个细胞。红色和绿色荧光细胞的强度是衡量一个软件使用数量。的意思是红/绿荧光比率不同的治疗细胞测定至少三个不同的实验,和显著的组间差异进行分析统计36- - - - - -38]。
2.8。LC3B-GFP Puncta分析
自噬过程形象化,LC3B-GFP转基因添加和转染到HaCaT细胞蛋白表达通过普莱默电子自噬传感器LC3B-GFP BacMam 2.0系统(P36235,英杰公司集团,卡尔斯巴德、钙、美国)根据制造商的指示。在这项研究中,可视化前,所有的细胞都孵化与LC3B-GFP至少24小时提高转染效率。在转染细胞的强度LC3B-GFP puncta荧光监控和成像与激光扫描共焦显微镜(GFP扫描:海里,海里),和LC3B-GFP puncta转染细胞决定使用ImageJ软件(http://imagej.nih.gov/ij/)。
2.9。细胞毒性测试
确定MTOR的细胞毒性,UVB,或者一起治疗,细胞计数Kit-8 (CCK-8) (Beyotime生物技术、海门、江苏、中国)使用根据制造商的指示39,40]。细胞收获到24-well盘子,然后MTOR的细胞治疗,UVB,或者两者都表示时间。接下来,50μL CCK-8试剂添加到500年μL培养基,细胞培养2小时37°C。使用微型板块分光光度计测量吸光度是450海里。
2.10。膜联蛋白V-EGFP细胞凋亡检测
凋亡细胞被膜联蛋白识别V-EGFP凋亡检测设备(Beyotime生物技术)如前所述34]。凋亡细胞的比例决定从三个独立的实验。
2.11。统计分析
个人实验至少进行三次,也获得了类似的调查结果进行统计分析。单变量方差分析的数据进行了分析。差异与被确定具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。角化细胞治疗与MTOR雷帕霉素敏感,Everolimus,托林1,pp242
检测的灵敏度HaCaT细胞MTOR抑制剂治疗,细胞治疗与不同剂量的雷帕霉素(10、20和40 nM), everolimus(50, 100,和200海里),托林1(0.5,1和2μ0.5米)或pp242(1和2μ米)12小时(数字1(一),1 (c),1 (e),1 (g))。接下来,细胞治疗与雷帕霉素(20 nM), everolimus(100海里),托林1 (1μ米),或pp242 (1μ米)4、12或24小时(数字1 (b),1 (d),1 (f),1 (h))。我们发现MTOR蛋白的磷酸化水平,MTORC1和MTORC2的核心组件,降低自身磷酸化位点,Ser2481,确定监测内在MTOR特定催化活性(41]。结果证实在HEKs(图1(我))。这些数据表明,HaCaT细胞敏感这四个MTOR的治疗。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)HEKs
(j)
(k)
此外,BrdU合并和细胞迁移试验被用来评估影响核糖体生物起源和成长HaCaT MTOR的细胞。我们发现,除了雷帕霉素、everolimus托林1,pp242表现出不同程度的抑制作用在使用BrdU公司DNA合成试验。托林(图1显示最重要的影响1 (j))。使用细胞迁移试验时,我们观察到治疗的四个MTOR 12小时抑制细胞迁移。然而,影响获救在细胞24小时使用雷帕霉素治疗,everolimus,或托林1,抑制迁移消失在pp242治疗细胞(图1 (k))。这些数据表明,抑制MTOR活动导致HaCaT细胞增殖和迁移的抑制。
3.2。MTOR对自噬的影响变化
自噬的调节过程的一个重要MTOR通路的生物功能。检测自噬通量,多种方法被用于这项研究。首先,microtubule-associated蛋白1轻链3 (LC3,最广泛使用的自噬的分子标记42])我LC3-II转换确定存在与否的溶酶体抑制剂e - 64 d和抑肽素,这是通常用于自噬流量分析由于他们封锁LC3-II退化的自溶酶体(38]。我们发现一个明显的增加的比率的加载控制GAPDH LC3-II雷帕霉素治疗HaCaT细胞相比,在未经处理的e - 64 d和抑肽素,表明新生儿内生LC3-II(图的积累2(一个))。尽管如此,也没有观察到类似的结果在细胞治疗托林1中,pp242和everolimus(数字2 (d),3(一个),3 (d))。HEKs化验是复制,所有四个MTOR包括雷帕霉素没有增加的比率LC3-II / GAPDH E64d和抑肽素治疗相比,可E64d和抑肽素孵化12小时后,指示MTOR的低灵敏度的自噬调控主要角质细胞(补充图(一)在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/5930639)。接下来,GFP-LC3B puncta形成检测监控与MTOR自噬在细胞治疗。我们观察到有小点的增加GFP-LC3B的e - 64 d和抑肽素与其缺乏相比,表明基底自噬流量。雷帕霉素治疗的点状的GFP-LC3B增加细胞的价格相比控制e - 64 d和抑肽素的存在,但不是在细胞治疗托林1,pp242和everolimus(数字2 (b),2 (e),3 (b),3 (e))。最后,AO彩色液泡测量分析自噬小体的形成(36,37]。结果,我们发现,红/绿荧光比率每个细胞在雷帕霉素治疗细胞相比,增加了控制的e - 64 d和抑肽素。也没有观察到类似的结果在细胞治疗与其他MTOR(数字2 (c),2 (f),3 (c),3 (f))。总的来说,这些数据表明,只有雷帕霉素表现出诱导自噬的影响在四个MTOR测试在我们的研究中,虽然至关重要的自噬调制器,MTOR信号,在角化细胞被抑制。治疗剂量的雷帕霉素、everolimus托林1,pp242选择根据先前的研究的34,43- - - - - -45),已验证在上面工作呈现在图1。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。MTOR通路HaCaT细胞MTOR雷帕霉素敏感,Everolimus,托林1,pp242
虽然减少MTOR磷酸化是一种分子标记这些MTOR, MTOR的目标信号和基质可能由于不同的调药的效果的影响不同。因此,我们发现下游信号传导介质的磷酸化MTOR除了MTOR蛋白质本身。在MTORC1下游信号,p70 S6激酶和4 e - bp1直接基质46),unc-51-like激酶1 (ULK1)是由MTORC1磷酸化改性47]。MTOR信号激活或灭活的时候,这些蛋白质提出相应的磷酸化的蛋白水平或状态的变化。我们发现MTOR的磷酸化水平Ser2448和Ser2481雷帕霉素治疗,减少托林1,pp242, everolimus,表明角质细胞对所有四个MTOR(敏感数据4(一)- - - - - -4 (d))。然而,有不同的改造模式MTOR的下游信号。一方面,4 e - bp1 S6核糖体蛋白的磷酸化水平,衬底的p70 S6激酶,在所有细胞减少四MTOR对待。值得注意的是,托林1和pp242下调4 e - bp1表达式在蛋白质水平(数字4 (c)和4 (d))。另一方面,减少ULK1磷酸化是细胞中观察到治疗托林1和pp242,但不是在细胞与雷帕霉素或everolimus治疗。MTORC2的核心分子,有趣的是,mTOR的Rapamycin-insensitive伴侣蛋白(Rictor) [48),在细胞治疗这些MTOR脱去磷酸,但是底物磷酸化水平的血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1 (SGK1) [49)没有影响。有趣的是,MTORC2目标一种蛋白激酶的磷酸化是细胞中减少处理通润1或pp242但不与雷帕霉素或everolimus细胞治疗。
(一)
(b)
(c)
(d)
这些数据表明,不同MTOR抑制剂治疗导致了截然不同的反应MTOR下游信号的角化细胞如ULK1和4 e - bp1信号。
3.4。MTOR并不影响UVB-Induced细胞反应,包括DNA损伤,ER响应和物信号通路
验证在UVB MTOR信号损伤的作用,我们发现MTOR信号HaCaT细胞暴露于UVB这些MTOR的存在与否。有趣的是,我们并没有观察MTOR磷酸化的增加,和下游目标MTORC1和MTORC2包括p70 S6激酶,S6核糖体蛋白,4 e - bp1, ULK1, SGK1, Akt在UVB挑战HaCaT细胞后12小时50 mJ /厘米2剂量的接触没有MTOR(数字4(一)- - - - - -4 (d))。试验结果验证的HaCaT细胞从2到12小时后50 mJ /厘米2UVB照射(补充图(b))。这些数据表明,MTOR活动没有激活后从2到12个小时50 mJ /厘米2UVB照射。UVB剂量试验表明,低水平的UVB照射(1.5,4.5,和7.5 mJ /厘米2激活MTOR活动),这表明MTOR的失活活动50 mJ /厘米2UVB治疗细胞没有工件在实验(补充图(c))。
此外,在这些MTOR的存在,UVB治疗并不影响抑制MTOR磷酸化及其下游信号。
我们之前的研究表明,一些UVB细胞相关事件,如细胞凋亡(34)和物激活(数据未显示),更重要的在50 mJ /厘米2UVB治疗HaCaT细胞。此外,激活细胞凋亡达到峰值后在12小时50 mJ /厘米2UVB照射。因此,我们对待细胞MTOR 12小时观察对细胞反应的影响在UVB治疗刺激细胞。DNA损伤可以激活一系列细胞信号的响应,包括共济失调毛细血管扩张突变激酶(ATM)、共济失调毛细血管扩张和Rad3-related激酶(ATR),和组蛋白H2A H2A家庭成员。X (50,51]。我们发现组蛋白H2A的磷酸化。X是显著调节UVB治疗HaCaT细胞,但ATR和ATM的磷酸化是没有改变(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。这些数据表明组蛋白H2A的激活。X是更敏感的标记在UVB-induced角质细胞的DNA损伤。
(一)
(b)
(c)
(d)
许多类型的分子或生理障碍可以损害ER功能。此外,ER应力触发的蛋白质反应(UPR),参与监管信号包括kinase-like内质网蛋白激酶(活跃)和inositol-requiring酶1α(IRE1α)[52]。蛋白质的磷酸化ER应激发生时增加。我们发现,蛋白质含量和其活跃的磷酸化和IRE1α在UVB治疗细胞表达下调。真核起始因子2的磷酸化α(eIF2α)是一个很好的记录机制来减少压力条件下蛋白质合成(53),它可以在Ser51磷酸化的活跃(52]。我们发现eIF2的磷酸化α通过活跃的独立调节在UVB治疗机制。因此,我们的数据表明,UPR被抑制,但蛋白质合成中表达下调HaCaT细胞暴露在UVB辐射。此外,我们也确定了一些函数作为分子伴侣’的蛋白质水平来帮助蛋白质的正确折叠,包括calnexin [54],毕普[55),和蛋白质二硫化物异构酶(PDI) [56]。我们观察到,只有毕普UVB治疗细胞中表达下调。以上数据表明,ER在HaCaT干扰细胞的正常功能受到UVB损害(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。
Jun-amino-terminal激酶(物)(也称为压力激发了蛋白激酶,SAPK)激活各种刺激如紫外线损伤、炎性细胞因子、神经酰胺(57- - - - - -59]。物途径激活已经观察到在UVB挑战角化细胞(60,61年]。按照先前的报道,我们在UVB治疗观察物激活细胞(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。
重要的是,组蛋白H2A的激活。X,活跃和IRE1抑制α毕普的差别信号,对这些基因和eIF2磷酸化α物在UVB治疗HaCaT细胞还未恢复通过与雷帕霉素治疗,everolimus,托林1,或pp242,表明抑制MTOR信号不能影响UVB-induced集成细胞反应,如DNA损伤、ER功能损害,物激活。有趣的是,在使用HEKs验证研究,我们发现雷帕霉素和everolimus并不影响上述UVB引发细胞事件按照HaCaT细胞观察。通润1和pp242不能恢复活跃的抑制和IRE1α信号的差别,对这些毕普,虽然托林1有趣的是抑制组蛋白H2A的磷酸化。X和物激活(补充图(a))。HEKs的观察证实,抑制MTOR信号可能不被视为一个目标来保护UVB辐射的细胞反应。
探讨影响MTOR活动用紫外线,我们进一步发现细胞事件MTOR的存在与否HaCaT细胞接受太阳能紫外线UVA的另一个重要的光谱。首先,我们发现MTOR磷酸化后减少25到50 J /厘米2UVA照射,暗示的敏感性MTOR紫外线与的辐射(补充图(b))。此外,50 J /厘米2组蛋白H2A UVA照射导致增加。X磷酸化和物激活但没有抑制毕普的表达,活跃或IRE1α像UVB(补充图(c))。有趣的是,四个MTOR表现出对UVA引起细胞反应明显不同的影响。例如,everolimus缓解UVA诱导组蛋白H2A的磷酸化。X,但雷帕霉素加剧了这一效应(补充图(c))。这些发现表明,UVA和UVB导致不同的细胞的影响,特别是MTOR的响应信号。
3.5。MTOR并不影响凋亡相关分子标记UVB刺激
我们发现MTOR抑制剂治疗(雷帕霉素除外)导致对HaCaT细胞不同程度的细胞毒性。everolimus的影响和pp242但并不是说托林1是轻微的。UVB辐射导致HaCaT显著的细胞毒性细胞,MTOR抑制剂治疗后UVB照射导致(图的影响更大6(一))。这些发现表明,抑制MTOR信号没有救援UVB造成的细胞损伤。上述研究结果验证了在初级HEKs(补充图(a))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
进一步检测MTOR抑制剂治疗的影响,我们评估了凋亡标记caspase-3和PARP HaCaT细胞有或没有UVB的挑战。Caspase-3是细胞凋亡的重要执行器由于其关键作用在各种关键蛋白质的蛋白水解乳沟。caspase-3包含两个片段的活性形式,kDa 17和19 kDa,由其解理(62年]。保利(ADP-ribose)聚合酶(PARP)是一个重要的目标活性在细胞凋亡过程中caspase-3 [63年),和裂解PARP促进凋亡细胞的拆卸64年]。虽然MTOR表现出不同程度的细胞毒性,我们发现每个MTOR抑制剂治疗并没有引发细胞凋亡。按照先前的研究结果(65年,66年),我们发现caspase-3的乳沟和PARP UVB治疗HaCaT细胞,表明UVB引发细胞凋亡。尽管如此,我们发现UVB-induced激活caspase-3 PARP并没有禁止任何四个MTOR(图6 (b))。上述结果在HEKs(补充图进行验证(b))。此外,细胞的比率沾膜联蛋白V单膜联蛋白V和propidium碘(π)增加UVB治疗细胞四MTOR的存在与否,和我们没有观察不同细胞刺激UVB的存在与否四MTOR(数字6 (c)和6 (d))。我们的研究结果显示,MTOR信号没有参与UVB引发细胞凋亡。有趣的是,我们观察到染色的增加与膜联蛋白Vπ孤单但不孤独在通润1 HaCaT细胞(数据处理6 (c)和6 (e)),表明1μm托林1治疗增加了细胞的死亡是由于细胞膜的严重损害。然而,托林1诱导细胞死亡并没有参与细胞凋亡。因此,我们没有发现增加的乳沟caspase-3或PARP托林1细胞治疗。
此外,转录因子C / EBP同源蛋白质(切)与细胞凋亡在ER应激反应(67年,68年]。我们观察到,砍在UVB治疗(数据未受到影响5(一个)- - - - - -5 (d)),这表明ER应激介导切机制可能不是UVB-induced细胞凋亡有关。
3.6。钙调磷酸酶抑制剂他克莫司和Pimecrolimus没有诱导LC3-II积累
也被称为另一个教派西罗莫司(雷帕霉素69年)和用于结合钙调磷酸酶抑制剂他克莫司作为维护在移植免疫抑制剂选择性地阻止转录的激活细胞因子(43,70年,71年]。重要的是,雷帕霉素两种蛋白质结合,吸收FK506——(他克莫司)结合蛋白(FKBP)和FKBP-Rapamycin-associated蛋白质(MTOR的收紧,原始的提名),在调节细胞信号(72年,73年]。因此,FKBP雷帕霉素和他克莫司的共同目标。然而,目前尚不清楚他克莫司可以调节自噬流量和MTOR活动。我们发现他克莫司没有增加LC3-II积累,GFP-LC3 puncta, MTOR的磷酸化和p70 S6激酶(数字7(一)- - - - - -7 (c))。我们的数据表明,他克莫司可能不会影响角质细胞的自噬和MTOR活动,虽然它具有相同的细胞目标和雷帕霉素相似的药用功能。此外,我们发现,pimecrolimus他克莫司具有类似的结构,也没有增加LC3-II积累(图7 (d))。吸收FK506 pimecrolimus治疗剂量的选择根据这些在以前的研究74年- - - - - -76年]。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
我们的研究显示,人类角质细胞的MTOR信号与MTOR治疗敏感,如雷帕霉素,everolimus,托林1,或pp242,但只有MTOR抑制由雷帕霉素可以导致自噬诱导引起的。此外,雷帕霉素引起的抑制MTOR everolimus,或pp242并不影响生物事件的系列UVB刺激角质细胞,ER的差别,包括对这些分子伴侣蛋白毕普和ER跨膜蛋白活跃,激活DNA损伤标记的组蛋白H2A和压力激发了蛋白激酶SAPK /物,和凋亡分子caspase-3和PARP的乳沟。
MTOR介导监管规范化在哺乳动物细胞自噬机制,但目前尚不清楚抑制MTOR肯定导致自噬诱导。在这项研究中,我们第一次验证MTORC1和MTORC2信号通路对这四个MTOR很敏感。有趣的是,Rictor雷帕霉素治疗角化细胞的敏感或everolimus,虽然它已被确认是对雷帕霉素(77年]。Akcakanat et al。78年]发现雷帕霉素治疗导致Rictor脱磷酸作用时间和浓度依赖的方式,以及他们的研究结果支持我们的数据。复杂的下游通路调节MTOR信号调节自噬过程。一般认为,ULK1 (autophagy-related的同族体基因1 (ATG1)酵母)蛋白质起着至关重要的作用在自噬机械MTOR的下游信号(79年),但显然ULK1尚未澄清的作用。报告关于ULK1角质细胞是罕见的。最近,Akinduro et al。80年)报道,区分角化细胞耗尽ULK1缺乏nucleophagy,和坎普et al。81年)发现ULK1信号被紫外线诱导的DNA损伤管制。我们的结果是按照坎普等人的发现,因为我们观察到ULK1及其磷酸化后被抑制UVB刺激。我们的研究初步揭示了监管ULK1 MTOR在角化细胞的反应。首先,ULK1信号通润1和pp242敏感但对雷帕霉素和everolimus,表明ULK1信号不是无条件的,以应对由上游MTOR监管。第二,ULK1没有参与雷帕霉素诱导自噬,表明自噬诱导ULK1反应并不是必不可少的。最后,当前的研究结果表明,ULK1独立机制存在于角质细胞的自噬机制。我们的研究表明,规范人类角质细胞自噬调控有特异性。重要的是,我们的研究表明,雷帕霉素是一种更有效的MTOR抑制剂作为一个人类角质细胞的自噬的诱导物处理。事实上,羌族et al。82年)报道,雷帕霉素诱导自噬和减少UVB-induced肿瘤发生在老鼠的皮肤。这些发现证明了高可用性的雷帕霉素作为角化细胞的自噬诱导物在体外和体内。
通润1和pp242 MTOR活动的有力阻滞剂通过ATP竞争机制(83年]。通润1 (84年]和pp242 [85年)已报告诱导自噬因抑制MTOR的活动。然而,我们发现,托林1和pp242治疗没有提高HaCaT细胞自噬流量,尽管增加转换从LC3-I LC3-II在细胞治疗。值得注意的是,托林1已经被报道在小鼠皮肤外植体诱导自噬比雷帕霉素(80年),这表明我们应该继续考虑托林1作为一个自噬诱导物的可用性在活的有机体内研究。有趣的是,托林1之间的相似之处MTOR信号反应存在诱导级联pp242诱导一个和雷帕霉素诱导之间的级联everolimus诱导,但两组之间存在差异。这些研究结果表明,不同MTOR抑制剂导致不同的影响MTOR以及自噬信号通路相关。因此,应该考虑,不属预定目标的效果就像基因翻译由4 e - bp1 MTOR的不同利用自噬诱导物。事实上,一些途径被报道参与MTOR独立自噬调节,例如,肌醇信号(86年)、Ca2 + / calpain营地/ Epac / Ins (87年],JNK1 / Beclin 1 / PI3KC3 [88年],和PKC [89年]。我们先前的研究显示,海藻糖、蔗糖和棉子糖增强角质细胞中自噬通过MTOR独立方式(34]。因此,MTOR独立的重要性,应该考虑在角化细胞自噬调控。然而,上述MTOR独立信号通路相关的角化细胞自噬机制仍不清楚,和更多的调查应该执行。
紫外线辐射是常见的皮肤疾病的压力。紫外线可分为UVA、UVB和短波紫外线光谱。其中,UVB与表皮细胞photodamage密切相关,导致晒伤,光老化,DNA损伤,photocarcinogenesis [90年- - - - - -92年]。角化细胞UVB-induced皮肤损伤的主要目标,因为他们作为表皮结构中的主要组件。布里奇曼et al。93年)发现UVB辐射激活MTOR信号在小鼠表皮角化细胞和老鼠的皮肤。Syed et al。94年)报道,UVB可以增加MTOR磷酸化后1小时辐射。卡尔等人。26和你等。95年)报道,MTOR信号激活后可观察到2小时的UVB照射。有趣的是,我们的数据表明,MTOR信号可能恢复到基础水平在12小时后早期激活UVB照射。在同一观测时间点,然而,我们仍然发现了UVB引发事件的差别,比如对这些ER分子伴侣蛋白毕普和ER跨膜蛋白活跃,激活DNA损伤标记的组蛋白H2A和压力激发了蛋白激酶SAPK /物,和乳沟凋亡分子caspase-3和PARP的存在与否的四个MTOR。我们的研究结果表明,MTOR信号可能不作为触发驱动UVB-induced细胞反应。有趣的是,MTOR抑制在UVA HaCaT细胞在暴露后的早期治疗。同时考虑到人类皮肤暴露在紫外线或太阳辐射从自然,相关影响MTOR暴露途径的UVB结合UVA photodamage应该关注未来的研究。
然而,抑制MTOR信号已经观察到有anticarcinogenesis潜力的UVB治疗小鼠模型;例如,雷帕霉素或芹黄素治疗减少UVB-induced表皮增殖通过抑制MTOR激活(26,93年],AZD4547和姜黄素C3复杂抑制UVB-induced表皮增生通过抑制FGFR / MTOR信号(96年]。因此,更多的工作是需要澄清的作用MTOR信号在紫外线的网络监管的途径,尤其是在体内研究。
在这项研究中,我们只观察到的增加组蛋白H2A H2A家庭成员。X磷酸化参与划分为哺乳动物染色质重组(51),但没有发现显著变化在其他DNA损伤标记物,如ATR或自动取款机。我们推测,ATR和ATM不是关键信号组件在UVB刺激角质细胞。事实上,沃格尔和何金格报道,ATR和自动取款机没有检查点反应必不可少的UVB (97年]。另外,雷等人发现UVB-induced p21退化,扮演着一个重要的角色在细胞周期、DNA修复,不需要ATR,自动取款机,或两者兼而有之98年]。ER信号反应UVB辐射角化细胞还不清楚,因为报告是缺乏的。然而,Mera等人发现IRE1α下游蛋白质XBP1调节HaCaT细胞暴露于10和20 mJ /厘米2UVB和活跃不是磷酸化29日]。他们还发现,polyubiquitination也增加。公园和张成泽GRP78的报道,一个ER应激标志,提高HaCaT细胞暴露于200年或400年乔丹/厘米2UVB而不是50或100 mJ /厘米2(99年]。因此,我们推测,ER信号响应监管以剂量依赖的方式。尽管MTOR信号之间的相关性和ER应激已证实,我们的研究表明,MTOR治疗不救援UVB-induced ER信号损失,包括活跃和IRE1α抑制。差别和毕普对这些这些数据表明MTOR通路可能不参与ER应对UVB辐射。吴等人报道,物激活凋亡诱导所需,和(+)儿茶素预防UVB引发细胞凋亡在角化细胞抑制物磷酸化(One hundred.]。我们的数据证实,物激活是一个关键的细胞在细胞photodamage事件,因为它一直在观察细胞挑战UVA和UVB。然而,MTOR(特别是雷帕霉素、everolimus或pp242)不影响物激活在UVB或UVA角质细胞治疗。因此,我们推测MTOR信号并不复杂的细胞反应中扮演着重要的角色在角化细胞紫外线伤害。
我们的研究只发现MTOR活动抑制UVB引发事件的影响,调药的方法。MTOR的作用通路在角化细胞暴露在UVB损坏需要进一步演示了通过基因调节MTOR信号方法。总之,我们的研究表明,在角化细胞抑制MTOR不能总是诱导自噬,MTOR途径可能不是UVB引发细胞反应中起着关键作用。此外,MTOR的角色及其相关的信号,如ULK1信号的角化细胞自噬机械,需要澄清,因为角质细胞可能规范自噬调控的特异性。
缩写
| MTOR: | 机械的雷帕霉素的目标 |
| 呃: | 内质网 |
| HEKs: | 人表皮角质细胞 |
| 神经生长因子: | 神经生长因子 |
| VEGF: | 血管内皮生长因子 |
| 人乳头状瘤病毒: | 人类乳头状瘤病毒 |
| ULK1: | Unc-51-like激酶1 |
| Rictor: | Rapamycin-insensitive同伴mTOR的蛋白质 |
| LC3: | Microtubule-associated蛋白质1轻链3 |
| AO: | 吖啶橙 |
| UPR: | 展开的蛋白质反应 |
| 好处: | 蛋白激酶kinase-like内质网 |
| IRE1α: | Inositol-requiring酶1α |
| eIF2α: | 真核起始因子2α |
| 物: | Jun-amino-terminal激酶 |
| PARP: | 保利(ADP-ribose)聚合酶 |
| 切: | 转录因子C / EBP同源蛋白质 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| PI: | Propidium碘。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
陈歌徐、丽丽和徐写主要的手稿文本。歌,丽丽,Mengli张,陈许共同执行实验,准备所有数据,并进行统计分析工作。徐陈、李敏、美居,恒古监督实验设计和修订后的手稿文本。徐,美居,恒古相应的作者。所有作者回顾了手稿。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81371755和81371755),教育部的博士项目基础格兰特(20131106120046),中国医学科学江苏省特殊项目(格兰特BL2012003)和江苏省自然科学基金(批准号BK20131064)恒古。徐陈和徐歌曾经支持的青年基金和基础研究基金为中央大学(3332015026,2016 rc320005, 2016 zx320014)。
补充材料
补充Figure.1:(一)HEKs服用E64d(10μg /毫升)和胃酶抑素(10μg /毫升)单独或与雷帕霉素(20 nM), everolimus(100海里),托林1(1μM)或pp242(1μM)在E64d和抑肽素的存在。GAPDH作为加载控制。LC3-II / GAPDH的比率计算,统计治疗之间的差异和不(NT)进行了分析。(b) HaCaT细胞暴露在50 mJ /厘米2UVB,细胞细胞溶解在2、4、8和12小时后曝光。(c) HaCaT细胞接受1.5,4.5,7.5,10、20、30、50 mJ /厘米2UVB,细胞细胞溶解在8th小时后曝光。MTOR磷酸化是检测到免疫印迹(b和c)。代表数据显示从三个独立的实验。拉伯:雷帕霉素;:everolimus。NS:废话。
补充图2:(a) HEKs暴露在50 mJ /厘米2UVB和孵化20 nM雷帕霉素的存在与否,100 nM everolimusμM托林1或1μM pp242为12小时。细胞溶解产物受到免疫印迹检测MTOR,组蛋白H2A。X,活跃,IRE1αSAPK /物和磷酸化水平以及毕普的表达。(b) HaCaT细胞治疗10、25、50 J /厘米2UVA,细胞细胞溶解1小时后曝光。MTOR表达式和磷酸化被免疫印迹检测。(c) HaCaT细胞暴露在50 J /厘米2存在与否的UVA和孵化20 nM雷帕霉素,100 nM everolimusμM托林1或1μM pp242为12小时。细胞溶解产物受到免疫印迹检测MTOR,组蛋白H2A。X,活跃,IRE1αSAPK /物和磷酸化水平以及毕普的表达。GAPDH作为加载控制。
补充图3:HEKs治疗有或没有50 mJ /厘米2UVB然后孵化20 nM雷帕霉素的存在与否,100 nM everolimusμM托林1或1μM pp242为12小时。细胞毒性测定了用细胞计数Kit-8 (a),免疫印迹分析使用初级抗体PARP PARP裂解,caspase-3和裂解caspase-3 (b)。GAPDH作为加载控制。