文摘
槲皮素是一种黄酮类广泛研究chemopreventive剂在不同类型的癌症。以前,我们曾报道,槲皮素对liver-induced chemopreventive影响老鼠体内肿瘤出现前的病变。这里,我们评估如果槲皮素不仅可以防止也逆转大鼠肝脏肿瘤出现前的病变。我们使用修改后的抗肝细胞模型(MRHM)来评估这种可能性。槲皮素治疗后15天使用诱导肿瘤出现前的病变。我们发现槲皮素逆转肿瘤出现前的病变的数量和他们的地区。我们的研究结果表明,槲皮素会使表皮生长因子受体的表达和调节信号通路的表皮生长因子受体的激活状态检测的upregulation受体,观察控制老鼠。此外,槲皮素影响Src-1的磷酸化状态,STAT5, sp 1。肝脏的更好地位与槲皮素治疗后也可以证实了复苏的igf - 1的表达。总之,我们表明,槲皮素逆转肿瘤出现前的病变EGFR调制和Src的激活状态,STAT5, Sp1,所以作为基底igf - 1。
1。介绍
肝细胞癌(HCC)是全球最常见的和致命的癌症之一(1]。肝细胞癌,另一种类型的癌症,建立了一个多步骤、多因子的过程;在那里,我们可以区分三个阶段,初始化,推广和发展。不同的风险因素刺激肿瘤的进展,当它检测到,实际的治疗是无效的。其中一些因素是感染乙肝或丙肝病毒,重型饮酒,非酒精性脂肪肝炎,和接触有毒物质如黄曲霉毒素B或氯乙烯,等等。即使不清楚的关系,饮食也一直显示在肝癌的发展起着重要的作用2,3]。
饮食中的抗氧化剂,如类黄酮中包含一些水果和蔬菜,有益影响肝肿瘤动物模型和诱导细胞凋亡在癌症细胞系(2,4,5]。槲皮素、类黄酮广泛研究chemopreventive剂在不同类型的癌症,被认为是一个优秀的抗氧化剂proapoptotic效应,能够抑制不同肿瘤细胞系的生长(6]。已经证明,槲皮素能够抑制代谢活动和细胞死亡的凋亡在HepG2等肝癌细胞株,HuH7, Hep3B2 [7]。也导致减少氧化应激和抗氧化活性明显降低大鼠的肝脏处理N-nitrosodiethylamine作为癌症诱导物(5]。之前我们也报道,槲皮素chemopreventive影响大鼠的肝脏这是以前使用的MRHM诱发肝癌。槲皮素可以降低细胞的数量开始通过减少lipoperoxidation癌症,还存在激活3和9,促进酶和非酶的抗氧化防御系统的启动期间hepatocarcinogenesis [8,9]。而使用chemoprotective物质会对肝细胞癌的发病率产生重大影响,它也需要发现物质有助于扭转受伤,因为这种类型的肿瘤通常是在晚期发现。
MRHM是一个良好的模型用于分析和定量的肝细胞癌的不同阶段。在这个模型中,N-diethylnitrosamine (DEN)在单剂量应用为发起者的代理。之后,2-acetylaminofluorene (2-AAF)和部分肝切除术在促进行动启动细胞的发展和他们的进展改变肝脏病灶(10,11]。此外,检测gamma-glutamyl转肽酶(GGT)是一个有用的工具,用于检测HCC-related病变。GGT不存在在成年大鼠肝细胞,但它是在改变中发现肝脏病灶引起的致癌物质,在大多数动物模型,从最初的病变引起的致癌物质,直到形成肿瘤(9]。
已经提出,槲皮素可以影响表皮生长因子受体(EGFR)的激活的超表达一些配体如amphiregulin [12),也已表明,槲皮素,剂量为10μM,减少表皮生长因子受体磷酸化的前列腺癌细胞(生物),产生一个减少的目标蛋白和波形蛋白的表达,N-cadherin,细胞周期蛋白D1 (13]。槲皮素也已被证明影响其他信号通路在不同癌症或细胞系,像JAK / STAT胆管细胞型肝癌细胞(14)或磷酸肌醇3-kinase (PI3K)和B16F10黑素瘤细胞增殖作用(MAP)蛋白激酶(15]。针对提到的槲皮素的影响在不同的分子途径,我们评估表皮生长因子受体信号通路可能参与机制的槲皮素逆转大鼠肝脏肿瘤出现前的病变。
在这里,我们表明,槲皮素逆转肝肿瘤出现前的MRHM病变,影响表皮生长因子受体的表达,并通过感应调节其他相关信号通路的磷酸化Src-1, STAT5, sp 1。最后,槲皮素诱发的复苏IGF-1B的表达,它反映肝脏的一个更好的状态的恢复。
2。材料和方法
2.1。材料
主要抗体是EGFR-t (C2C3 GeneTex) EGFR-p (S.684.2热),Src (36 d10,细胞信号),Src-p (GTX24816 GeneTex) STAT5(9310年,细胞信号),STAT5-p(9359年,细胞信号),Sp1 (GTX110593 GeneTex) Sp1-p(磷Thr739 GeneTex), IGF1 (sc - 9013,圣克鲁斯生物技术)β肌动蛋白(鼠标单克隆,CINVESTAV)。二次抗体是山羊anti-rabbit合(目录编号为62 - 6120,英杰公司)或山羊anti-mouse合(目录A9044数量、σ),WesternSure化学发光免疫印迹试剂,和Li-COR C-DiGit污点扫描仪(Li-COR生物科学、芬兰)。
2.2。动物和治疗
三组七费舍尔344雄性老鼠被用来执行这项研究。所有的实验都是根据机构的动物保健和使用委员会的指导方针。雄性老鼠,180 - 200克的重量,单位提供的生产和实验动物实验室(UPEAL),在CINVESTAV,墨西哥城,墨西哥。所有的老鼠都保持在控制温度条件下与12小时光/暗周期。获得食物和水被随意。两组老鼠MRHM主题,和一个额外的组被用作控制。在最后一组,只有车辆管理,并参与集团(NT)命名。
在两组MRHM,腹腔内单剂量200毫克/公斤diethylnitrosamine(穴)管理为了启动致癌过程。之后,连续三次胃内的剂量20毫克/公斤的启动子代理2-acetylaminofluorene (2-AAF)管理在天七,八,九的实验。最后,启动后十天,增殖刺激是通过部分肝切除术包括诱导肝脏的75%。从十五天,直到牺牲,在剂量的槲皮素10毫克/公斤每两天的一个管理组(英国《金融时报》+ Q集团)。在第二组,只有槲皮素的车辆,羧甲基纤维素(CMC)为0.5%,得到了(英尺)。三组动物的牺牲在窝管理局(图后三十天1)。
牺牲后,肝脏被移除和每一个分组两部分。其中一个是冻结,cryosections 20μ厚度是获得,和切割都被冻结,直到GGT进行检测。另一部分与液氮低温贮藏蛋白质作进一步分析。
2.3。组织化学的Gamma-Glutamyl转肽酶(GGT)
20片μ厚度在幻灯片上胶固定在乙醇−20°C 10分钟。然后,三羟甲基氨基甲烷缓冲液的解决方案(pH值7,包含伽马glutamyl-4-methoxy-2 naphthylamide (GMNA) glycyl-glycine,和快速的蓝色)是补充道。片被孵化。孵化后,红色由100毫米硫酸铜溶液(CuSO4)的酶活性明显(所有化学物质来自西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州)。使用多色相机耦合到一个奥林巴斯SZ045显微镜、图像的彩色肝脏被抓获。
2.4。免疫印迹
从每个老鼠的三组,总蛋白质从冷冻肝脏样本获得100毫克的组织。组织机械均质在1毫升的寒冷里帕缓冲与蛋白酶抑制剂PhosSTOP补充完整(罗氏生命科学,)。提取离心机在3500 rpm,在4°C,持续15分钟。上层清液被转移到一个新的地铁和离心机在4°C 12000×g 10分钟。上层清液又恢复了,总蛋白由布拉德福德的修改方法量化。蛋白质在Laemmli缓冲2 x煮5分钟,立即放在冰。60μg(每个样本的sds - page分离浓缩的丙烯酰胺凝胶在6%和15%之间(根据蛋白质的分析)。后,蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。非特异性结合被TBS-T包含10%的脱脂奶粉在室温下2 h。膜被孵化在4°C一夜之间,与相应的主要抗体。主要抗体EGFR-t, EGFR-p Src, Src-p, STAT5, STAT5-p, Sp1, Sp1-p IGF1和β肌动蛋白。三个洗后,膜被孵化与二次抗体山羊anti-rabbit合和山羊anti-mouse合在室温下2 h。膜是新洗的,三次,和感兴趣的蛋白质的可视化和分析使用WesternSure化学发光免疫印迹试剂和C-DiGit污点扫描仪(Li-COR。两个)。
2.5。统计分析
GGT-positive疫源地的数量和他们的区域被使用量化分析软件分析软成像系统GmbH是一家。乐队获得的强度与免疫印迹分析量化软件包括C-DiGit污点扫描仪。数据收集和统计分析,生成相应的图表,使用GraphPad棱镜4软件。数据被表示为均值±SE。
3所示。结果
3.1。槲皮素逆转的数量和面积的焦点与肿瘤出现前的病变有关
我们使用修改后的抗肝细胞模型(MRHM),以诱导肿瘤出现前的老鼠的肝脏病变(英国《金融时报》集团)和评价能力的槲皮素逆转病变(英国《金融时报》+ Q集团)。简单,损伤诱导的单剂量窝老鼠管理,之前描述的特点,启动致癌过程。窝政府七天后,老鼠治疗期间与启动子代理2-AAF四天,和部分肝切除术后10天做了窝。从15到30天,一个剂量的槲皮素(Q)管理的老鼠在英国《金融时报》+ Q组每两天或只对车辆在CMC组。所有的老鼠,在实验和对照组牺牲启动(图后三十天1)。GGT的肿瘤标记物的表达模式分析评价槲皮素在肿瘤出现前的化学预防损伤的影响。Gamma-glutamyl转肽酶(GGT)是一种酶蛋白高表达在大多数肝肿瘤模型,考虑一个早期的肿瘤标志物。这种酶的活性是评价肝切片,和焦点的数量及其测定领域。预计,这种酶的活性可以发现在老鼠的肝脏在英国《金融时报》集团(图2(一个)英尺),但不是在对照组(图没有任何治疗2(一个)NT)。英国《金融时报》和英国《金融时报》+ Q集团目前肿瘤出现前的病变如GGT enzyme-positive染色,但肿瘤出现前的病变没有分配一个特定的分布;他们在整个叶随机分布。观察到的数量差异和区域的病变;英国《金融时报》集团是最积极的马克与更多和GGT(图2(一个))。一般来说,苏木精和伊红染色(数据未显示),观察肝细胞改变,嗜碱性的,半透明的水泡核和核仁显著,如预期。后,用槲皮素治疗诱导癌变前的病变,产生减少病灶GGT阳性(图的数量2(一个)英国《金融时报》+ Q)。焦点的数量的定量阳性GGT表明有58%的减少肿瘤出现前的病变(图的数量2 (b))。减少81%的肿瘤出现前的病变区域的观察;这个数量和面积减少肿瘤出现前的病变是统计学意义(图2 (c))。这个结果表明,槲皮素不仅可防止病变的发展如前所报道也逆转。
(一)
(b)
(c)
3.2。减少表皮生长因子受体的表达时观察到癌变前的病变被槲皮素逆转
因为一些信号通路被激活通过EGFR蛋白槲皮素,我们分析如果表皮生长因子受体参与观察槲皮素降级的影响肿瘤出现前的病变。免疫印迹分析表明总表皮生长因子受体是过表达对控制值2.2倍时大鼠的肝组织preneoplasic损伤诱导(图3(一个)英尺),但这是减少一半的槲皮素时控制值被用来逆转病变。(图3(一个)英国《金融时报》+ Q)。表皮生长因子受体的激活状态,这种受体的磷酸化形式被免疫印迹(图评估3 (b))。表皮生长因子受体的激活率如图所示的磷酸化EGFR与总表皮生长因子受体与肿瘤出现前的老鼠的肝脏病变类似于观察老鼠的肝脏病变(图3 (b),英国《金融时报》和NT);这一比率增加3.0倍显示表皮生长因子受体的激活与槲皮素治疗时使用(图3 (b)英国《金融时报》+ Q)。
(一)
(b)
3.3。降级的癌变前的病变槲皮素与STAT5信号通路的激活
表皮生长因子受体诱导表达的几个分子的磷酸化通过一些信号通路的激活;Src是一种蛋白质被表皮生长因子受体激活,增加肝脏中槲皮素是用来恢复肿瘤出现前的病变。激活的增加2.3倍+ Q集团在英国《金融时报》在英国《金融时报》集团,这是统计学意义,可以观察到光密度分析。Src (Src-t)的激活是类似在NT和英国《金融时报》集团(图4(一))。总之,Src的活动期间提高病变的逆转,槲皮素时使用。
(一)
(b)
(c)
(d)
一些由表皮生长因子受体信号通路激活的评价让我们观察STAT5的激活状态的增加。STAT5磷酸化以类似的方式在大鼠的肝脏NT和英国《金融时报》集团。但一个重要的激活增加STAT5 (STAT5-p)中观察到的组肿瘤出现前的病变治疗减少了槲皮素(NT组的4.4倍)。更高的激活状态STAT5 + Q集团在英国《金融时报》对观察英国《金融时报》集团也显著(图4 (b))。因此,我们可以认为槲皮素诱发STAT5的磷酸化,增加其活动。
激活Sp1和STAT5之前已经报道过了。然后,Sp1的激活状态也评估在研究老鼠的肝脏。分析组的槲皮素用于治疗恢复肿瘤出现前的病变显示增加激活Sp1which被测密度术量化。观察到的是增加1.4倍以上对英国《金融时报》集团(图4 (c))。没有显著差异的激活状态Sp1在NT集团和英国《金融时报》集团之间。在这种方式,激活Sp1和STAT5槲皮素时使用。
目标基因igf - 1是肝脏的功能状态的指标也是评价。正如我们所料,诱导肿瘤出现前的病变通过MRHM igf - 1表达的减少导致了74%(图4 (d)英国《金融时报》)。当我们分析了老鼠的肝脏中表达+ Q集团在英国《金融时报》的表达IGF是恢复,从26%到83%的控制值(图4 (d)英国《金融时报》+ Q集团)。最后的结果是一个反映肝脏的功能状态三组。
4所示。讨论
槲皮素的能力逆转肿瘤出现前的病变在肝脏MRHM测试。这个模型已经被我们(9)和其他作者为了观察肝癌的三个不同的发展阶段:起始,推广和发展11,16,17]。评价肿瘤出现前的病变的存在是通过GGT的活动。分析了这种酶在不同的阶段,并表示一直从开始到发展模型中化学致癌作用,导致肿瘤出现前的细胞的识别(18,19]。GGT酶是一个焦点标记常用,也视为一种肿瘤标志物。我们发现管理的槲皮素逆转肿瘤出现前的病变在这个模型中,由较低数量的明显改变肝脏病灶(GGT)阳性,但主要影响面积的减少。在英国《金融时报》和英国《金融时报》+ Q组,我们观察到病变GGT染色;然而,很明显,在英国《金融时报》集团多个病变观察和英国《金融时报》+ Q集团对GGT下降剧烈影响。量化的GGT, 0.01毫米2是一个低端测量抛弃污渍与肿瘤出现前的病变(韧性细胞)优惠圆形。一些报告表明,槲皮素具有不同的抗肿瘤的活动在不同的肿瘤或癌前病变。和它的活动发生在不同信号通路的调控β连环蛋白/ Tcf或活化蛋白激酶(AMPK)在结肠癌细胞[20.,21),NF -κ在人类肝癌细胞(B和AP-1 /物22),或EGFR / PI3K / Akt通路在前列腺癌(13)和表皮生长因子受体在肝细胞(12]。信号通路中维护在癌症的发展。所以如果槲皮素能调节几个途径发展期间,它将导致一个可逆损伤效应。
我们观察到明显减少的数量改变肝脏病灶区域,而伴随着减少表达EGFR磷酸化表皮生长因子受体的数量较低。但由于磷酸化表皮生长因子受体的比例的增加,我们评估Src的激活,我们发现磷酸化Src更高的组织与槲皮素治疗。最后结果同意先前的报道表明,表皮生长因子受体可能发生的transactivation GPCR配体和一些细胞因子。这些能引起磷酸化缺乏表皮生长因子受体的配体,因此,Src的激活或者杰纳斯酪氨酸激酶1 (Jak1) [23]。此外,Src可以激活不同的统计数据。统计数据可以激活JAK激酶,生长因子受体(EGFR),或Src家庭成员24]。在这里,我们表明,STAT5磷酸化在老鼠的肝脏与槲皮素治疗逆转肿瘤出现前的病变。激活的STAT5 Src之前已经报道过(24]。甚至更多的,在鼠肝细胞在初级文化,已经证明,EGF诱导STAT5显然通过Src-dependent机制的激活(25]。此外,Src诱导蛋白的表达,如MMP2、通过ERK / Sp1通路(26]。和STAT5信号相互作用和Sp1也已证明,主要在细胞周期蛋白的表达D2 (27]。在这里,我们发现Sp1在老鼠的肝脏更活跃与槲皮素治疗。STAT5,重要的是要强调Src和Sp1磷酸化在老鼠的肝脏与槲皮素治疗。但没有明显差异在Src的磷酸化,STAT5, Sp1,诱导肿瘤出现前的病变的组织和控制。因此,我们可以推断出降级槲皮素肿瘤出现前的病变的发生,直接影响信号通路负责病变的发展,如表皮生长因子受体,和另外的激活信号通路的分子被认为是作为一个肿瘤抑制,像STAT528]。STAT5活动作为一个肿瘤抑制活性氧的控制主要是通过彪马的表达,荡妇,NOX4 [28]。我们也分析了igf - 1的表达,并减少与肿瘤出现前的老鼠的肝脏病变。这是预期的,因为以前,它已经表明,降低igf - 1的表达与不同肝脏疾病的进展(29日]。具体来说,在肝癌血清igf - 1水平下降,与不良预后相关(30.,31日),但最高水平的患者IGF以前抗血管新生治疗疾病控制与更好的率(31日]。我们的研究结果表明,槲皮素治疗休养igf - 1几乎控制值。即使没有达到这一水平在对照组,igf - 1的表达的增加伴随着较低的数量和区域肿瘤病变。这使我们得出结论,最后反映出更好地控制老鼠的肝脏肿瘤出现前的病变的治疗与槲皮素。
5。结论
总之,我们表明,除了已知的槲皮素效应作为保护剂,槲皮素治疗逆转肿瘤出现前的病变也很有用。这种影响不仅是观察减少核扩散,但我们也不能丢弃肿瘤起源细胞被删除的可能性。因此,EGFR的表达以及调制的激活状态参与的减少肿瘤出现前的病变。Src的激活状态,STAT5, Sp1的基底igf - 1恢复在减少参与的数量和大小肿瘤出现前的病变引起的槲皮素。
缩写
| 肝细胞癌: | 肝细胞癌 |
| MRHM: | 修改后的抗肝细胞模型 |
| 窝: | N-Diethylnitrosamine |
| 2-AAF: | 2-Acetylaminofluorene |
| GGT: | Gamma-glutamyl转肽酶 |
| 表皮生长因子受体: | 表皮生长因子受体 |
| PI3K: | 磷酸肌醇3-kinase |
| 地图: | 增殖作用 |
| NT: | 参与集团 |
| Jak1: | Janus酪氨酸激酶1。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作从CONACYT贡献提供资助和项目178558和SVT的格兰特CINVESTAV和项目Catedra CONACYT 2014 - 2499。作者感谢赛米亚Fattel庄园的技术支持。