生物转化Dioscorea Nipponica大鼠肠道菌群及薯蓣皂苷元的心脏保护作用

摘要

研究天然产物的生物转移通过肠道微氟胞拉是理解某些药物特别是天然药物的方法的重要方法。在许多情况下，活性组分由代谢激活产生。这对药物研究和发展至关重要。作为探索治疗机制的手段Dioscorea Nipponica（DN），一种用于治疗心肌缺血（MI）的药用植物，对DN肠道菌群产生的代谢物进行了鉴定，并对这些代谢物的心脏保护作用进行了评价。我们的结果表明薯蓣皂苷元是DN大鼠肠道菌群产生的主要代谢物。此外，我们的结果表明薯蓣皂苷元通过提高酶和非酶抗氧化剂水平体内通过减少氧化应激损伤。这些机制解释了DN作为抗心肌梗死药物的临床疗效。

1.导言

缺血性心脏病(IHD)是严重威胁人类健康的疾病，在西方国家发病率和死亡率都很高，在我国也是如此。据世界卫生组织估计，在未来几十年，IHD将成为全球头号死亡原因[1]．近年来，人们对开发药用植物治疗IHD的潜力越来越感兴趣。如从芍药总苷和肉桂酸、肉桂醛中提取肉桂已经评估了它们对异丙肾上腺素-（ISO-）诱导的大鼠心肌缺血的保护作用[2那3.]．特别是，值得注意的是，来自药用植物的生物活性甾体皂苷Dioscorea Nipponica（DN）已被制药行业成功开发为治疗IHD的有效草药。这些从DN发展而来的草药自20世纪70年代开始使用；这些药物包括前苏联卫生部批准的“多聚皂苷”，以及中国生产的用于治疗心肌缺血或心绞痛的薯蓣皂苷片和地奥心血康胶囊。

在以前的研究中，本报告的作者建立了一种混合微观方法，用于区分DN薯蓣属以确保采集草药时DN的真实来源[4.[后来证明DN的主要成分包括薯蓣属皂甙，但不含游离薯蓣皂苷元[5.那6.]该DN介导心脏保护作用[7.]．尽管如此，DN的活性成分和治疗机制尚未完全表征。植物组织表达的DN中的成分可以是前药;代谢物，其中，调节治疗效果。因此，进一步的研究是更好地表征其生物活性特性。预计此类工作会产生改善洞察DN的临床使用。我们最近的研究进一步表明，Diosgenin作为来自DN的主要代谢物，从实验大鼠口服接受DN的实验大鼠群中发现并定量血浆中[8.]因此，我们假设薯蓣皂苷元是一种与DN抗心肌缺血（MI）活性相关的生物活性代谢物。薯蓣皂苷元具有多种生物活性，但其大部分药理作用与心血管疾病的治疗有关，如降低血浆总胆固醇和抗血栓活性[9.].据报道黄独提取物，其类似于含有富含Diosgenin的DN提取物，通过超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（猫）活性来改善血管功能。因此，还有值得进一步探索Diosgenin的抗MI活性[10]．

最近，鉴定肠道微生物区系对植物化学物质的生物转化所涉及的代谢物被认为是确定哪些化合物在生命系统中具有活性以及更好地了解草药如何影响生物过程的潜在有效手段[11那12]．为了验证我们的假设，本后续研究的目的是，首先确定薯蓣皂苷元是否通过肠道菌群的器官特异性生物转化而成为DN的代谢物，其次，通过iso诱导的大鼠心肌缺血模型验证筛选出的薯蓣皂苷元的心脏保护作用。本研究的结果为了解DN的代谢，包括其活性成分的识别和作用方式提供了基础。本研究支持DN和薯蓣皂苷元在IHD临床治疗中的应用。

2.材料和方法

2.1。化学品和试剂

一般厌氧培养基肉汤（Gam Brooth），维生素K1和血红蛋白购自上海明顿生物科技有限公司（中国上海）。从Merck（Darmstadt，Germany）购买的分析级乙醇用于DN样品的提取。使用Milli-Q水系统（Millipore; Bedford，Ma，USA）纯化水。乙腈（RCI实验室扫描，曼谷，泰国）和甲醇（RCI实验室扫描，曼谷，泰国）被用作分析的流动阶段。将甲酸（Sigma-Aldrich，USA）加入到流动阶段进行分析。异丙肾上腺素是从西格玛（圣路易斯，美国）购买的。SOD，CAT，GPX，T-AOC和MDA的测试试剂盒都是从南京江城生物技术研究所购买的（中国南京）。其他试剂具有分析纯度。

在天津植物市场有限公司购买Protodioscin，Dioscin，Gracillin，Diosgenin，Protogracillin和Polyphyllin V的标准（纯度98％）。Pseudododioscin由国家食品和药物管制研究所（北京，中国）提供。标准的化学结构如图所示1。

2.2. DN提取物的制备

DN的根茎采自河南省灵宝市的种植基地。所有药材均经香港浸会大学中医学院陶毅博士鉴定，品质优良。香港浸会大学中医药中心存放编号DN-01的相关凭证标本。

DN样品在60°C下干燥，然后粉碎成粉末 g） 在超声波浴中提取1000 在室温下用80%乙醇1ml，持续1小时 h、 重复该操作两次。在旋转蒸发器（50°C）中减压蒸发合并提取物以去除乙醇，然后用冷冻干燥系统冷冻干燥。DN提取物（26.1 g、 收益率13.05%，W/W由此获得。将0.1g的DN提取物在10mL无菌水中稀释，过滤通过0.22 μm孔径过滤器(Millipore, GV型)。滤液用无菌管收集。这些管子被用作在体外生物转化。将干提取物和薯蓣皂苷元悬浮在1% (W/v)水溶性羧甲基纤维素给动物服用。

2.3.大鼠粪便样品的制备

新鲜的大鼠粪便立即从十个健康的男性Sprague Dawley大鼠（220-250g）收集。将样品在实验当天收集并混合在现场，并立即使用。通过将新鲜的粪便样品与高压灭菌的PBS（0.1M，pH7.2）混合来制备粪便浆料，得到10％（W/v)悬浮液。粪便悬浮液通过两层纱布过滤。过滤后的悬浮液用于接种疫苗在体外生物转化。

2.4.大鼠肠道菌群对DN提取物的体外生物转化

A 30 g-GAM肉汤溶解于1000 毫升水（70°C），在高温下过滤，用高压（0.15℃）抗菌处理 压力（MPa）和温度（121°C）为20 min，并冷却至45°C。然后将GAM肉汤溶液转移至厌氧室（37°C，厌氧条件）和1 维生素K1和6毫克 mg氯化血红素溶解在溶液中。然后对生物转化容器进行消毒，并填充30 mL GAM肉汤溶液。

血管接种3种疫苗 毫升粪便悬浮液（10%，W/v)，然后是1 添加1毫升DN提取物。体外生物转化在厌氧条件下运行48小时 h、 进行了两个不同的对照实验：（i）在缺乏DN提取物的培养基中培养肠道菌群，以监测基础代谢产生的代谢物；（ii）在没有肠道菌群的培养基中培养DN提取物，以监测由于底物前体化合物的纯化学转化而引起的变化。

然后根据文献中描述的方法制备生物转化混合物[10]简单地说，生物转化混合物是用50%乙醇提取的 mL乙酸乙酯三次。剩余的残渣用50%乙醇重新萃取三次 mL水饱和正丁醇。用水冲洗合并的正丁醇层三次。然后，将乙酸乙酯和正丁醇层混合至均匀，在真空下浓缩，然后用甲醇稀释至所需体积。所有溶液在13000℃下离心 ×g为10 注射前分钟进行超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）分析。

2.5。UPLC-MS分析

色谱分析使用安捷伦1290系列UPLC系统（安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉市），该系统配备有二元泵、自动进样器和恒温控制柱室。水权™ BEH C18柱（100 × 2.1 嗯，1.7 μM使用美国马萨诸塞州米尔福德（Milford）在40°C下进行样品分离。使用0-2的梯度程序，流动相由0.1%甲酸在水中（A）和0.1%甲酸在乙腈（B）组成 最低，20%B；2–12 最低，20-28%B；12–20 最低，28-45%B；20–35 最低，45-48%B；35-46岁 最小，48–75%B。注射的样品体积为2 μ五十、 溶剂流速设定为0.4 mL/min。对于质谱测定，UPLC系统通过多模电离源（G1978-65339）接口与超高分辨率精确质量四极杆飞行时间质谱（MS）系统（安捷伦科技G6540A）联用。MS分析条件优化如下：干燥气体（N₂)流量:8.0 L/min;干燥气体温度300°C;45 psi喷雾器;毛细管,2500 V;和碎片电压，150v。质谱记录了整个范围M/Z100–1700正模式和负模式。所有操作和数据分析均由安捷伦MassHunter工作站软件版本B.04.00控制。

2.6.ISO诱导的动物和急性心肌缺血

雄性sd大鼠，体重150-200克，购自香港中文大学实验动物服务中心。所有动物均在23±1℃的室温下饲养，光照/光照周期为12 h。随机提供标准的鼠粮和水。所有实验方案均根据动物条例(香港卫生署)，由香港浸会大学在教学及研究中使用人类及动物实验对象委员会批准。

将42只大鼠随机分为7组：（1）正常对照（0.5％W/v（2）模型组（仅ISO注射）；（3）阳性组（普萘洛尔，10 （4-6）薯蓣皂苷元治疗组。对于薯蓣皂苷元组，薯蓣皂苷元以20、40或80的速率给药 ISO注射后3天，mg/kg。剂量根据我们之前的研究确定[7.];（7）在ISO注射后3天用500mg / kg在500mg / kg的DN提取物中施用DN处理组。除了给出ISO注射的日子外，每天施用Diosgenin，DN提取物和丙唑啉。

将动物注射用ISO（1mg / kg，S.C.）注射以在第一天的8小时内诱导实验MI两次。在实验的最后一天（第4天），牺牲了动物。用乙醚麻醉大鼠后，从大鼠的股票动脉收集血液样品。在400℃下以4000rpm以400℃离心20分钟，在-80°C下保存血清。

2.7。心肌的组织学检查

在牺牲大鼠之后，将心脏除去，用冰晶生理盐水洗涤，固定在10％福尔马林中，并用甲酸（31.5％甲酸和13％柠檬酸钠）脱钙。通过标准组织学方法将心脏嵌入石蜡中进行切片[13].第（4）款 μm、 用苏木精和伊红（H&E）对左心室的Leica RM2125（德国）进行染色，并在200倍放大的条件下通过光学显微镜（Leica DMR，德国）进行检查。

2.8.生物活性分析和统计分析

根据制造商的说明，使用试剂盒测量SOD，GPX，CAT，T-AOC和MDA的活动。从实验中获得的值被表示为平均值±标准偏差（SD）。ANOVA评估差异的统计学意义，然后用LSD方法进行后HOC测试[14那15]．小于0.05的值被认为是统计学意义。

3。结果与讨论

3.1。离子源的选择

电喷雾电离是一种软电离技术。它在从大分子中产生离子方面特别有用，因为它克服了这些分子在电离时破裂的倾向。大气压化学电离(APCI)是一种在大气压下利用气相离子-分子反应进行质谱分析的电离方法。ESI是目前化学和生化分析中应用最广泛的电离技术[16那17]．但是，一些分析物（例如，薯蓣属由于结构和极性原因，皂甙配基不能与ESI产生足够强的离子；在这些情况下，APCI可用于提高离子产率。因此，在我们之前的研究中，ESI和APCI分别用于检测皂甙和皂甙配基[6.]．由于需要使用不同的离子源，每个样品需要分析两次，分析时间要长一倍。

为了解决该问题并节省时间，ESI / APCI多模电离源用于本研究中的LC-MS分析。ESI / APCI多模源是唯一的，因为它将ESI和APCI包含到单个离子源中，并且它可以通过ESI和APCI同时生成离子。多模源的主要优点包括消除在仪器上切换离子源并消除两次运行样本的需要以改善实验室生产力的时间[18]。与之前的研究相比，皂甙苷和皂甙配基在多模电离源的帮助下一次电离并鉴定。因此，我们从与大鼠肠道菌群孵育的DN提取物色谱图中发现新生成的峰8，对应于薯蓣皂苷元（图8）2（d））.

3.2.薯蓣皂苷元作为DN提取物代谢物的检测

近年来，肠道菌群对药物代谢的影响受到越来越多的关注。小肠中的厌氧菌种类繁多，不同种类产生的酶的功能也不同;这些酶也负责生物体内药物的生物转化。将试验药物，特别是植物化学物质与新鲜粪便标本孵育是研究这种生物转化的常用方法[11那12]．

在本研究中，DN提取物通过该方法进行测试；产生的代谢曲线如图所示2（d）.根据样品与标准化合物的比较，七个峰被明确鉴定为原薯蓣皂苷元（1）、原纤细蛋白（2）、假原薯蓣皂苷元（3）、薯蓣皂苷元（5）、纤细蛋白（6）、多叶林V（7）和薯蓣皂苷元（8），通过比较它们的差异，峰4被初步鉴定为假原纤细蛋白（4）M/Z数值和MS光谱与文献中的数据一致[8.].与图中确定的峰值进行比较2（a），图中新生成的峰值82（d）这一发现证实了我们的假设，即肠道细菌从DN提取物中产生薯蓣皂苷元[8.]．

３．３．薯蓣皂苷元对心肌组织学的影响

正常对照大鼠心肌的心脏组织切片的光学显微镜显示出明显的心肌膜完整性、带条纹的正常肌原纤维结构、分支外观以及与相邻肌原纤维的连续性（图1）3（a））.iso组大鼠的组织显示横纹消失，心肌细胞明显肿胀，大量炎症细胞浸润，心肌坏死(图)3 (b)).给予普萘洛尔POS组大鼠的组织切片显示出近似正常的肌原纤维结构，带有清晰的条纹和少量炎性细胞（图1）3 (c))与ISO组相比，低剂量薯蓣皂苷元治疗组显示心肌细胞肿胀减轻，横纹不清，炎性细胞浸润减少（图3 (d)）.中剂量薯蓣皂苷元处理组的组织损伤较轻，如心肌排列正常，横纹清晰，浸润性炎症细胞少(图)3 (e)).高剂量薯蓣皂甙元和DN提取物治疗组的心肌细胞组织学正常，保存完好，无明显损伤（图3（f）和3（g）)这些发现表明薯蓣皂甙元和DN提取物可以保护心肌组织免受实验治疗中可能发生的病理损伤。

3.4.薯蓣皂甙元对血清SOD、CAT、GPx、T-AOC和MDA水平的影响

人们普遍认为，异丙肾上腺素（ISO）注射液可轻易诱发大鼠急性心肌梗死；抗氧化活性是抗心肌梗死疗效的关键机制之一[2那3.那19]因此，使用ISO模型比较薯蓣皂苷元在抗氧化活性方面的治疗效果是合理的。

氧化应激在心肌梗死损伤的发病机制中起着至关重要的作用。一个原因是心肌梗死过程中通过电子传递链导致线粒体功能紊乱而产生的活性氧（ROS）₂O.₂)、超氧阴离子(O₂⁻)和羟基自由基（OH·）在缺血期间，尤其是再灌注期间产生[19-21]然而，这些潜在有害的活性氧是由外部或外源性抗氧化防御系统控制的，这些系统可以消除促氧化剂和清除自由基。最著名的内源性线粒体抗氧化酶是SOD，它将超氧化物歧化为H₂O.₂。其他内源性抗氧化酶包括过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶。外源性抗氧化剂主要来源于食品和草药。许多类型的生物活性植物化学物质，如多酚类、糖苷类和甾体，属于外源性抗氧化剂，在临床和研究领域都具有吸引力[22-25]。根据已发表的描述草药抗心肌梗死活性的报告[3.那17那18]，心肌梗死模型中与抗氧化活性相关的五项指标通常用于评估ISO诱导心肌细胞损伤的保护作用。这些指标是脂质过氧化的指标，即丙二醛（MDA）；三种酶抗氧化剂，即总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）；以及非酶和酶抗氧化剂的指标，即总抗氧化能力（T-AOC）[26-28]因此，根据广泛接受的国际规则，选择SOD、CAT、GPx、T-AOC和MDA来评估上述生物转化研究中鉴定的薯蓣皂苷元的抗MI活性。

与ISO组中的正常对照组，SOD，CAT，GPX和T-AOC水平显着下降（^## )， MDA水平显著升高(^## )(数据4(一)那4 (b)那4（c）那4（d）， 和4（e）)这意味着我们通过ISO注入进行的建模是成功的。

这五种标记物显示，服用不同剂量薯蓣皂甙元和DN提取物的组表现出不同程度的抗氧化活性（图4(一)那4 (b)那4（c）那4（d）， 和4（e）)与ISO组相比，通过薯蓣皂甙元和DN提取物处理，实验性MI大鼠的SOD、CAT、GPx、T-AOC和MDA的病理水平几乎正常化( 或者 ），除了SOD，GPX，T-AOC和低剂量Diosgenin治疗组中的MDA血清水平。这些发现表明，Diosgenin的抗MI机制不仅有效地酶抗氧化剂，而且是非酶抗氧化剂。

以20、40和80的剂量口服薯蓣皂苷元 mg/kg时，SOD、GPx和T-AOC血清水平呈剂量依赖性升高，MDA血清水平呈剂量依赖性降低。薯蓣皂甙元（78.9%和77.3%）的治疗效果在剂量为80%时达到峰值 mg/kg时，SOD水平和GPx水平均高于普萘洛尔10倍剂量组 mg/kg（57.9%和70.5%），与ISO模型组比较，这些结果表明薯蓣皂苷元具有明显的抗氧化性能体内。鉴于其已知的益处，这些抗氧化性能可能负责DN治疗MI的治疗效果。

由缺血再灌注损伤引起的氧化应激的降低显然是对与缺血相关的主要挑战的适当对策。值得注意的是，抗氧化剂不是灵丹妙药。最近的一项研究报告称，施用30毫克/千克/天β-胡萝卜素可通过增强抗氧化能力显著改善离体缺血/再灌注（I/R）大鼠心脏的心功能β-胡萝卜素剂量没有增加任何心血管方面的益处。此外，该药物可能会介导，甚至可能加剧现有的I/R病理机制[29]抗氧化剂在疾病的发生和发展中起着双刃剑的作用。

4.结论

本研究通过器官特异性生物转化分析鉴定DN代谢物，并通过异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠模型验证筛选的代谢物的心脏保护作用。本研究结果表明:首先，薯蓣皂苷元是通过肠道菌群从DN中产生的;其次，薯蓣皂苷元对心肌缺血损伤的保护作用呈剂量依赖性，其作用与DN提取物相当;第三，DN的保护作用可归因于酶和非酶抗氧化剂(SOD、CAT、GPx和T-AOC)的增加。体内这些现象有助于解释DN作为抗心肌梗死药物的临床疗效。

的利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

贾富峰和易娜堂对这项工作做出了同等贡献，进行了实验，解释了数据，并撰写了手稿。林竹和陶艺构思了这个想法并设计了这个项目。洪吉和詹纲肖对手稿进行了审查和修订。所有作者都批准了该版本的出版。

致谢

中国国家自然科学基金（81603381, 81673691）、广东自然科学基金（2014A030313766、2016A03031300）、广东省科技计划委员会（2015A020211039）、深圳科技创新委员会（JCYJ2016051809470654）以及香港浸会大学的教师研究资助（FRG2/15-16／022）。

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