文摘
白藜芦醇对衰老的功效广为人知,发挥心血管保护作用在不同的实验模型。白藜芦醇的作用在调节线粒体功能和动态心脏衰老过程中仍然知之甚少。在这项研究中,白藜芦醇的影响对线粒体形态和线粒体去极化和表达式Drp1,帕金,PINK1, LC3调查H9c2细胞诱导senescent-like D-galactose治疗后心肌细胞。Drp1显著增加差别结果表明,对这些线粒体伸长。Senescent-like心肌细胞更能抵抗CCCP-induced线粒体去极化,伴随着抑制表达帕金,PINK1, LC3-II。白藜芦醇治疗显著增加Drp1表达,改善线粒体伸长,增加了线粒体易位帕金和PINK1。此外,白藜芦醇显著增强LC3-II表达和降低TOM20-labeled线粒体的内容。白藜芦醇也抑制磷酸化的帕金PINK1,这可能与它的降解能力senescent-like心肌细胞线粒体受损。这些发现表明抑制线粒体伸长Drp1-dependent的方式参与白藜芦醇对衰减的影响心肌细胞老化的发展。激活帕金和PINK1白藜芦醇治疗心血管并发症的潜在机制与衰老有关。
1。介绍
与年龄相关的损失或衰减的心肌缺血预处理(IPC)已经在动物和人类研究[1,2]。虽然衰老过程的潜在功能失调的IPC机制尚不清楚,有相当大的协议,线粒体老化过程中发挥关键作用,特定的线粒体功能缺陷与老年性心脏效率下降有关。改变中介发布和/或细胞内途径介导的线粒体可能是老年性IPC减少负责。然而,通过mitochondrial-related治疗干预机制,如ATP-sensitive钾离子通道(K三磷酸腺苷渠道)和渗透过渡孔开口(3- - - - - -5),显示了令人失望的结果在岁的心6]。
在过去的十年中,线粒体动态的角色专注于细胞器核裂变和核聚变研究在正常和病变的心,和线粒体功能障碍核裂变和核聚变是涉及心脏死亡与衰老或疾病(7- - - - - -9]。心肌细胞特别容易受到缺血由于其高能量效用和没有储备。因此,赋予的宽容IPC岁心肌细胞可能是依赖他们维持线粒体活力的能力,如聚变裂变,生源论和选择性降解。线粒体分裂的主要分子中介dynamin gtpase命名dynamin-related家族成员蛋白1 (Drp1)调节线粒体动力学。缺血性心肌细胞线粒体碎片经常观察是公认的证据增加线粒体分裂由Drp1 [10]。药物抑制Drp1 Mdivi-1化合物已经被建议减少细胞死亡后心肌梗死(11,12]。虽然很少有研究测试了这种方法,早期结果出现有前途,Drp1基本要求的心脏衰老仍然遥遥无期。线粒体分裂调查的一个主要挑战是辨别的心肌细胞衰老的影响所产生的DNA变异,新陈代谢紊乱,和过多的活性氧(活性氧)生产13,14),这导致大型、巨型或线粒体肿大(15,16]。与这些异常线粒体动力学表现出功能障碍和可能负责IPC的响应降低衰老的心。
选择性切除受损的线粒体在维持线粒体稳态中扮演着关键角色维护和正常的细胞新陈代谢的细胞。然而,缺乏线粒体分裂蛋白导致senescence-associated活动的增加β牛乳糖和线粒体伸长在衰老的心17]。细长的线粒体显示一个更大的规模,增加删除的困难,总是提出了有缺陷的裂变。虽然Drp1是否是必不可少的选择性切除受损的线粒体仍不清楚,Drp1强烈表达的心脏和大脑组织与其他组织(18]。有证据表明心脏Drp1-knockout小鼠线粒体功能障碍和抑制选择性线粒体清除(19]。Drp1-mediated线粒体分裂促进帕金易位在心肌细胞,干扰的抑制Drp1 [20.]。PTEN-inducible激酶1 (PINK1),线粒体激酶,显示外膜积累和发起帕金易位在心脏7),这意味着心脏组织中线粒体的选择性去除PINK1有关。基于这些先前的研究,我们假设的衰减异常线粒体伸长可以恢复IPC岁心里的防护功能由一个新的机制涉及Drp1和帕金。
白藜芦醇,天然多酚化合物存在于一些植物,显示显示抗氧化性能(21和延长寿命22]。白藜芦醇也下调脂质过氧化反应和移植Mn-SOD减少氧化应激在心血管疾病23]。白藜芦醇据报道,恢复IPC对岁的心脏保护作用加强心脏功能,减少缺血/ reperfusion-induced细胞凋亡(24]。作为一个潜在的活化剂sirtuin蛋白1 (SIRT1),白藜芦醇改善心脏功能通过SIRT1-mediated信号通路在岁的心25]。此外,SIRT1的抑制减弱白藜芦醇的预处理效果,证明SIRT1通路是涉及白藜芦醇预处理[26]。此外,几项研究已经报道了白藜芦醇的影响通过Drp1-parkin-PINK1信号调控线粒体形态和动力学。因此,可能Drp1-parkin-PINK1信号可以参与异常线粒体动力学在心脏衰老和白藜芦醇的保护作用。
在这项研究中,我们调查了H9c2细胞的线粒体动态变化应对D-galactose感应,特点是senescence-associated水平上升β牛乳糖和BrdU合并。D-Galactose干预产生活性氧和诱发心肌细胞钙超载,这被视为一个潜在的衰老机制的研究。我们的角色进行了探讨线粒体去极化和帕金/ PINK1易位在细长的线粒体D-galactose-induced senescent-like H9c2心肌细胞。我们所知,本研究首次提出一种新的机制的白藜芦醇,它调节Drp1防止心脏衰老疾病。的新角色所需帕金和PINK1激活消除衰老的线粒体在发现白藜芦醇的抗衰老的功能及其重要性进行了讨论。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和药物治疗
老鼠H9c2心肌细胞细胞系,从美国获得类型文化(美国写明ATCC CRL1446)集合,在杜尔贝科修改鹰的培养介质(美国俄克拉荷马州DMEM, Gibco)补充10%胎牛血清(美国俄克拉何马州的边后卫,Gibco)和1%v/v青霉素、链霉素(美国俄克拉荷马州Gibco) 37°C公司5%2湿度环境。D-Galactose(美国D-Gal≥99%,σ)溶解在DMEM和48小时。美国σ羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone (CCCP)和白藜芦醇(RSV,纯度> 98%,高效液相色谱,成都Conbon生物科技有限公司、四川、中国)溶解在二甲亚砜(DMSO,记述,美国)。
2.2。Senescence-Associatedβ牛乳糖染色
Senescence-associatedβ美国牛乳糖染色(CST)是根据制造商的协议执行。6-well短暂,细胞板用PBS,固定与固定剂溶液,在室温下15分钟和24小时孵化β牛乳糖染色溶液在干燥孵化器(缺乏有限公司2)。H9c2细胞在显微镜下观察发展的蓝色(100 x)。阳性细胞的百分比计算,计算中细胞和总在五个随机领域(标准)。
2.3。细胞生存能力和线粒体可行性
细胞生存能力是由使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium试验(MTT、分子探针、美国)。570/650 nm的吸光度由多模评估检测平台(SpectraMax范式、分子器件、美国)。线粒体可行性,线粒体可行性分析试剂(英国Abcam)根据制造商的协议。简单地说,5×104细胞/ ml被播种在96孔板。治疗后,100μl DMEM和100μl稀释剂添加到每个好了4小时的潜伏期在37°C。的荧光强度在590 nm处的激发波长550纳米。细胞生存能力和线粒体可行性计算比值DMSO组(设置为1.0),分别。
2.4。评估线粒体形态
被播种到H9c2细胞μ幻灯片8-well玻璃底板(ibidi # 80826年,德国)总数的7500。治疗后D-galactose(0、10、20和40 g / l,σ,美国)或Mdivi-1 (40μ美国M,σ),这些细胞被孵化与50 nM MitoView红(美国GeneCopoeia) 37°C为30分钟。然后,PBS的细胞被洗了三遍。每组线粒体形态被使用共焦显微镜(德国徕卡TCS SP8)配备了63 x油浸的目标。红色荧光MitoView红色代表线粒体染色。
2.5。透射电子显微镜法
H9c2心肌细胞固定在2.5%戊二醛在一夜之间在4°C和PBS洗了三遍,然后后缀在1%锇tetraoxide 1 - 2小时,在一系列分级的乙醇浓度脱水,嵌入Sparr树脂。部分50 - 70纳米的厚度是放在铜网格double-stained与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。样本检验的h - 7650透射电子显微镜(日立、日本)。
2.6。ROS和钙的测定
测量细胞ROS生产和钙离子浓度,H2DCFDA细胞活性氧检测化验设备(美国分子探针)和Fluo-4是钙指标(美国热科学)是根据制造商的协议和使用由BD FACSAria三世流式细胞分析仪(美国BD)分析。ROS和钙的决心,488 /交货使用Em 530海里。每组的强度计算通过计算10000细胞表示。
2.7。MMP的决心
衡量线粒体膜电位(MMP) JC-1线粒体膜电位测定工具包(Abcam,剑桥,英国)是根据制造商的协议。JC-1荧光图像的每个组都被用红色和绿色荧光共焦显微镜。JC-1强度的量化,H9c2细胞被播种在96 -黑版和清晰的底部。488 / Em 530 nm和550 /交货交货Em 600海里被使用,和MMP由红色变为绿色荧光的比例计算。
2.8。ATP含量测定
H9c2细胞ATP水平的测量使用发光ATP检测化验设备(英国Abcam)根据制造商的协议。ATP的内容进行了分析从三个独立的实验,检测到一个多模检测平台。
2.9。BrdU合并分析
一个BrdU掺入试验用于测量细胞增殖。被播种到H9c2细胞μ幻灯片8-well玻璃底板的总数7500。治疗后,细胞培养介质包含10μ美国M BrdU(σ)为24小时。然后,细胞被固定的70%和2 M盐酸乙醇和孵化在室温下30分钟。1% BSA用于阻塞,这些细胞被孵化与BrdU主要抗体(Abcam 1: 500年,英国)一夜之间和二次抗体(1:250)在室温下2小时。DAPI(美国英杰公司)在最后一步染色。使用共焦显微镜荧光图像检测装备63 x油浸的目标。蓝色荧光代表DAPI染色,和红色荧光代表BrdU。图像通过使用厂家的软件进行了分析。阳性细胞的百分比计算通过计算double-stained细胞和总细胞在五个随机领域(标准)。
2.10。评估线粒体呼吸
细胞耗氧率(OCR)测量来确定关键参数使用海马线粒体呼吸的生物科学XFp细胞外流量分析仪(海马生物科学、美国)包含一个XFp细胞水压力测试工具根据制造商的协议。H9c2细胞被播种到XFp细胞培养miniplate密度4000细胞/ 80μl /好,对待D-galactose (40 g / l)。的传感器盒XFp分析仪在37°C non-CO水化2孵化器的前一天,实验。校准的传感器盒装满1.5μM寡霉素(复杂V抑制剂)端口,2μ0.5 M FCCP端口B,μ米鱼藤酮/抗霉素A(抑制剂的复杂我和复杂III)端口c细胞文化中取代了180年μl /分析媒介,是由补充XF基地中葡萄糖与5.5毫米,1毫米丙酮酸和2毫米谷酰胺(调整pH值7.4)和孵化在37°C 1小时没有有限公司2。当校准完成后,校准板被替换为一种文化miniplate到校准XFp细胞外通量水压力测试分析仪。耗氧率计算评估线粒体呼吸。
2.11。免疫印迹分析
细胞被洗冰PBS和细胞溶解里帕缓冲区(20毫米Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,1毫米Na2EDTA、1毫米EGTA NP-40 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,2.5毫米焦磷酸钠,beta-glycerophosphate 1毫米,1毫米Na3签证官4,1μg / ml亮抑酶肽,细胞信号技术,美国)含有蛋白酶抑制剂(罗氏、巴塞尔、瑞士),然后存储在冰30分钟。细胞溶解产物在4°C在13000转离心10分钟,上层清液收集到一个新的和清晰的管。蛋白质浓度测定用Bio-Rad蛋白质分析工具包(Bio-Rad实验室,美国)。等量的蛋白质被煮和8% sds - page凝胶分离和转移到硝酸纤维素(微孔,德国)。三羟甲基氨基甲烷缓冲液的膜堵塞了5%脱脂牛奶saline-Tween 20 (TBST)在室温1小时,然后孵化一夜之间在4°C的主要抗体anti-Drp1(1: 500年,细胞信号技术,美国),anti-Mfn2(1: 1000年,细胞信号技术,美国),anti-Mfn1 (Abcam 1: 500年,英国),anti-OPA1 (Abcam 1: 500年,英国),anti-Bcl-2(1: 500年,细胞信号技术,美国),anti-Bax(1: 500年,细胞信号技术,美国),anti-PINK1(罗福斯1:500年,美国),anti-parkin (Abcam 1: 500年,英国),anti-LC3(1: 1000年,细胞信号技术,美国),和anti-TOM20 (Abcam 1: 500年,英国)。膜在TBST洗了三遍,孵化二级抗体(1:1000)在室温下1小时。随后,膜在TBST洗了三次,发现使用《奥德赛》扫描仪(美国Licor)。肌动蛋白(σ1:10000年,美国)被用作加载控制。
2.12。Phos-Tag化验
检测磷酸化PINK1和帕金蛋白质,8%聚丙烯酰胺凝胶含有25μ美国和光化学M phos-tag丙烯酰胺(kouichi)和50μM MnCl2使用前就做好了准备。在电泳前,样本与1毫米MnCl混合2。在电泳过程中,冷运行缓冲使用。电泳后,phos-tag丙烯酰胺凝胶与传输缓冲区包含1毫米EDTA清洗与温和搅拌10分钟,然后替换为传输缓冲区没有EDTA与温和搅拌10分钟。被转移到蛋白质硝化纤维素膜(微孔、德国)和常规免疫印迹分析。
2.13。免疫细胞化学分析
被播种到H9c2细胞μ幻灯片8-well玻璃底板的总数7500。治疗后,细胞被洗PBST(0.1%渐变20 - PBS)和固定4% PFA(15分钟,RT),然后用0.1% permeabilized Triton x - 100(10分钟,RT)。细胞与PBST洗3次,阻止了1% BSA / PBST 1小时在室温下,和孵化主要抗体(TOM20 1: 50, Abcam;帕金1:200年,Abcam;PINK1 1: 200年,罗福斯)在4°C。二次抗体用于1:250年在室温下2小时。使用共焦显微镜荧光图像检测装备63 x油浸的目标。
2.14。统计分析
6.0数据分析使用GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国),和所有的结果表示为±SEM手段。Dunnett单向方差分析的测试是用于分析3或多组之间的区别。对于双官能团分析,学生的t以及使用。值和 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。白藜芦醇减毒Drp1-Mediated线粒体在响应在H9c2 D-Galactose感应细胞伸长
我们检查了线粒体的形态H9c2细胞暴露于D-galactose 48小时(图1(一))。活细胞染色染料MitoView红色表明线粒体的形态和分布的变化在不同剂量D-galactose归纳。线粒体管状或线状的比例显著增加H9c2细胞治疗D-galactose浓度的10,20和40 g / l。与40 g / l D-galactose感应后,超过80%的线粒体高度拉长和完全连锁组织到漫长的旅行,而细胞没有D-galactose感应显示短或点状的线粒体分布在细胞质中。线粒体是相当灵活,直接与心肌细胞代谢活动的水平。因此,我们想调查机制线粒体伸长或影响线粒体动力学响应D-galactose H9c2细胞。我们评估裂变——或者fusion-regulated蛋白(Mfn1,进行Mfn2、OPA1 Drp1)表达式,发现Drp1 D-galactose感应(图后明显下调1 (b))。相比之下,D0细胞(细胞治疗0 g / l D-galactose),在D40 Drp1细胞的表达水平明显降低。相反,没有Mfn1的表达水平的变化,进行Mfn2或OPA1回应D-galactose(图1 (c))。此外,我们进一步测试是否Drp1主导线粒体伸长后D-galactose感应使用选择性cell-permeable Drp1抑制剂(Mdivi-1)。Mdivi-1治疗抑制Drp1表达和Drp1-mediated线粒体分裂和线粒体H9c2细胞伸长进一步改变,表明线粒体伸长D-galactose部分是由于缺乏引起的裂变机械引起的。差别Drp1对这些
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接下来,我们研究了白藜芦醇的影响在应对D-galactose线粒体形态。H9c2细胞治疗D-galactose 48小时后跟不同剂量白藜芦醇的12小时。有趣的是,活细胞线粒体长度和分布变化的分析表明,线粒体伸长改善了白藜芦醇在剂量依赖性的方式(图2(一个))。在细胞治疗D40和100年μ100白藜芦醇(RSV),线粒体紧紧挤在一个相对稳定的音标铅字和伸长的价格相比大幅减少D40细胞。量化的线粒体形态表明,细胞出现线粒体伸长的比例显著降低细胞内处理D40 + 50μ或100μRSV M细胞(图2 (b))。我们接下来用透射电子显微镜观察线粒体形态变化后D-galactose感应(图2 (e))。D0组,大部分线粒体提出了短期和圆形形态。大多数D40线粒体的细胞出现一样长,管状,有时分支或two-neighbored传遍整个细胞质的结构。值得注意的是,有的细长,成为高度互联呈网状线粒体(红色箭头)。因此,线粒体的结构特点伸长因此异常线粒体动力学响应D-galactose表示。后白藜芦醇(100μ米)治疗,我们观察到的细长H9c2细胞线粒体数量减少与管状或球状的结构没有显示部分。
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同时,我们评估了白藜芦醇对裂变的影响——或者fusion-regulated蛋白质D-galactose感应后,发现白藜芦醇显著调节剂量依赖性的方式(图Drp1表达式2 (c))。我们进一步分析了白藜芦醇是否有或没有D-galactose可能扮演的角色在细胞毒性和线粒体损伤。如图2 (d)、MTT、荧光染色实验表明细胞和线粒体异常不受100年的24小时μM白藜芦醇治疗。
综上所述,这些研究结果表明,为了应对D-galactose差别Drp1对这些引起显著改变线粒体的长度和分布,揭示明显伸长形态。白藜芦醇治疗后,线粒体伸长降低,从而改善D-galactose引起的异常线粒体动力学特征。
3.2。白藜芦醇减轻Senescent-Like D-Galactose感应细胞表型反应
慢性D-galactose政府造成改变,就像自然衰老动物(27]。在这里,我们研究了伴随老化参数在应对D-galactose H9c2心肌细胞。首先,我们进行了senescence-associatedβ牛乳糖(SA)β加)染色,衰老和衰老细胞的生物标志物。积极蓝染色D40组的比例增加到83.16%,只有16.16% D0组(图3(一个))。进一步证实细胞senescent-like表型D-galactose, BrdU结合试验进行评估细胞增殖。荧光图像显示有失去BrdU / DAPI双染色D40细胞相比,D0细胞。量化的细胞双染色显示,44.44% BrdU染色,表明减少心肌细胞增殖(图3 (b))。此外,我们使用荧光探针检测活性氧簇(ROS)的产生和细胞钙浓度。与D0细胞相比,ROS作品D20开头和D40细胞显著增加(图3 (c)相比,增长了1.71倍D40组D0集团)。同时,钙浓度D20开头,D40也显著增加(图3 (d)相比,增长了4.88倍D40组D0集团)。心肌细胞衰老是众所周知的显示减少ATP生产。因此,我们调查了ATP含量,结果表明D40细胞ATP含量下降了38.96%而D0细胞(图3 (e))。
(一)
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(g)
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我们也想知道这些细长的线粒体受损,以应对D-galactose归纳。因此,我们进行了线粒体膜电位(MMP)分析探讨线粒体去极化的这是否被D-galactose诱导。有趣的是,没有发现明显的变化在MMP H9c2 D-galactose引起的细胞(图3 (f))。此外,我们进一步发现线粒体呼吸耗氧率的测试。如图3 (g)H9c2细胞耗氧率没有明显变化,表明线粒体呼吸功能不是D40受损的细胞。进一步评估proapoptotic蛋白质表达,我们分析了bcl - 2、Bax的表达。没有明显的bcl - 2表达水平的变化和伯灵顿发现应对不同剂量的D-galactose(图3 (h))。
我们评估白藜芦醇的影响senescent-like D-galactose引起的表型。如图4(一)明显,白藜芦醇和剂量依赖性降低D-galactose-induced SAβ-Gal-positive染色和增加的百分比BrdU / DAPI染色(图的两倍4 (b))。此外,白藜芦醇显著降低ROS生产和钙浓度D-galactose,分别在剂量依赖性的方式(数字4 (c)和4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
集体,D-galactose诱导细胞senescent-like H9c2心肌细胞表型,包括增加衰老生物标志物的表达,减少细胞增殖,过多的活性氧产量,和钙超载。关于线粒体的功能方面,没有线粒体膜电位的变化或呼吸链被观察到。我们还表明,mitochondrial-mediated凋亡信号通路没有激活。重要的是,白藜芦醇股价下降β加活动,增加细胞增殖,减少活性氧的生产和钙超载,从而改善D-galactose-induced senescent-like H9c2心肌细胞表型。
3.3。白藜芦醇减少细长的线粒体的抗CCCP-Induced Senescent-Like心肌细胞去极化
线粒体膜电位(MMP)被认为是细胞内的一个关键传感器和/或效应监管过程,如细胞凋亡、氧化还原状态,钙稳态,线粒体融合与分裂和平衡。我们下一个探索之间的关系引起的线粒体去极化CCCP D-galactose感应后,线粒体伸长。我们发现MMP JC-1染料使用荧光显微镜和微型板块cytometry-based分析。孵化H9c2细胞挺JC-1染色前3小时的确增加了绿色荧光信号的强度(图5(一个),中间板),表明重大线粒体去极化。然而,我们并没有观察MMP的CCCP-induced崩溃在40 g / l D-galactose-treated H9c2细胞(D40,图5(一个),对面板)。使用血细胞计数,我们计算了红色FL比绿色FL,代表贡献JC-1单体和聚合。与荧光图像所示的结果一致,我们还发现红/绿FL下降比例H9c2细胞挺刺激后,显示MMP的重大损失。然而,有一个显著的衰减的能力挺触发D40细胞MMP的下降。与此同时,我们还测试了是否CCCP D40细胞上的不同效果发生由于senescent-like心肌细胞线粒体伸长。我们检查了线粒体形态的变化由疣状细胞暴露于挺anti-TOM20抗体(红色)。相比H9c2细胞没有D-galactose感应,CCCP-treated细胞包含更高比例的短和/或点状的线粒体,揭示CCCP导致线粒体碎片。挺有趣的,效果没有观察到细胞中线粒体伸长被D-galactose诱导,支持我们先前的观察,正常或nonelongated线粒体形态是所需CCCP-induced线粒体去极化在心肌细胞(图5 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
然后,我们推测线粒体伸长可能MMP-mediated通路中的一个重要的决定。确定白藜芦醇的影响线粒体伸长参与线粒体去极化,我们检查了MMP的改变,白藜芦醇治疗后H9c2细胞线粒体形态。正如所料,白藜芦醇没有直接影响D40细胞MMP的损失。挺有趣的是,在D40 +细胞,白藜芦醇显著已故MMP暗示线粒体去极化激活的脱钩(图5 (c))。评估线粒体形态的疣状与TOM20进一步验证细长的线粒体的数量,降低了白藜芦醇治疗的价格相比D40细胞(图5 (d))。
这些数据表明,线粒体的抗CCCP-induced去极化可能是因为异常伸长D-galactose-induced senescent-like心肌细胞。白藜芦醇治疗后,线粒体是更容易去极化引起的挺,这可能是由于线粒体伸长抑制。
3.4。白藜芦醇调节帕金/ PINK1信号在Senescent-Like心肌细胞线粒体去极化
首先,我们发现帕金线粒体易位的疣状anti-parkin抗体(绿色)和anti-TOM20抗体(红色)使用共焦显微镜H9c2细胞没有D-galactose归纳。孵化H9c2细胞后挺了3小时,我们观察到黄色的荧光信号强度增加合并后的图像(图6(一)第二行从左边)的价格相比细胞没有挺治疗(图6(一)从左边第一行)。黄色斑点的覆盖绿色和红色荧光(FL),表明帕金转移到线粒体。接下来,我们检查了激活的PINK1疣状anti-PINK1抗体(绿色)和一个anti-TOM20抗体(红色)。相比H9c2细胞没有CCCP治疗(图6(一),第二行从右边),黄点的数量是增加了CCCP-treated H9c2细胞,表明线粒体PINK1易位(图6(一)从右边第一行)。我们下一个访问是否CCCP-induced线粒体易位帕金和PINK1 upregulations有关。我们分析了帕金的蛋白质含量和PINK1接触后挺刺激。免疫印迹分析表明,帕金是没有改变的总蛋白表达明显(图6 (d))。帕金磷酸化是一个关键步骤的线粒体易位在回应CCCP-induced线粒体去极化。因此,我们进行了免疫印迹分析使用一个sds - page凝胶含有phos-tag调查是否帕金在H9c2磷酸化细胞受到挺。在phos-tag免疫印迹,磷酸化蛋白出现慢迁移的乐队,乐队强度显著增加显示,帕金在CCCP-treated细胞磷酸化。有趣的是,PINK1的总蛋白表达水平显著增加CCCP引起的。同时,我们观察到一个明显的慢PINK1迁移的phos-tag免疫印迹凝胶,这是潜在的反射增加PINK1磷酸化。这些结果表明,帕金和PINK1转移到线粒体的挺,建议更高的帕金和PINK1磷酸化激活扮演了一个角色。
(一)
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(c)
(d)
进一步解决的激活线粒体伸长是否会影响帕金PINK1 senescent-like心肌细胞,我们接下来研究线粒体易位的帕金和PINK1 H9c2细胞诱导的40 g / l D-galactose (D40)。在合并后的图片,我们没有观察到一个明显的黄色荧光信号与CCCP D40细胞不治疗,表明帕金没有把线粒体(图6 (b)从左边第一行)。有趣的是,CCCP-induced增加黄色荧光不是D40细胞中发现,表明显著衰减的能力挺触发线粒体易位的帕金(图6 (b)第二行从左边)。接下来,我们分析了帕金诱导的蛋白质水平的挺D40细胞。相比之下,D40细胞挺不接受治疗,总帕金表达水平并没有显著改变CCCP(图的存在6 (d))。与此同时,我们还测试了CCCP-induced激活PINK1是否表现出只有在D40细胞。如图6 (b)D-galactose治疗没有诱导的线粒体易位PINK1(从右边第二行)。我们没有观察到PINK1线粒体易位D40细胞暴露于挺在合并后的图像(从右边第一行)。免疫印迹PINK1总蛋白质含量的分析表明,其表达式没有回应CCCP治疗增加D40细胞。此外,我们测试是否引起的帕金和PINK1 CCCP的磷酸化是受D-galactose归纳。在phos-tag免疫印迹,我们没有观察到显著水平的磷酸化帕金和PINK1 CCCP D40细胞引起的。这些数据证明了CCCP-induced激活帕金和PINK1 D40细胞减少,表明线粒体去极化引起的挺可能需要激活的帕金和PINK1。
我们接下来研究了白藜芦醇的影响表达式的帕金和PINK1 D40细胞。首先,白藜芦醇没有诱导帕金D0细胞线粒体易位(图6 (c)第二行从左边)。然后,我们检查了帕金D40细胞中线粒体的易位与白藜芦醇治疗。在合并后的图片,我们观察到显著增加黄色荧光信号强度经过12个小时的白藜芦醇治疗(图6 (c)从右边第二行)。有趣的是,与黄点的数量增加CCCP的存在,表明白藜芦醇增加CCCP-induced帕金D40细胞中线粒体的易位(图6 (c)从右边第一行)。此外,白藜芦醇治疗后,帕金和PINK1总表达水平没有显著改变在D40 CCCP诱导细胞的反应。因此,我们推测帕金和PINK1磷酸化是否增加对白藜芦醇的回应。如图6 (d),磷酸化帕金和PINK1表达式被检测并显示显著增加D40白藜芦醇治疗后细胞和挺D40 +细胞,表明帕金磷酸化和PINK1磷酸化与帕金线粒体易位的白藜芦醇诱导H9c2细胞。
综上所述,帕金和PINK1镇压的CCCP-induced激活senescent-like H9c2心肌细胞,一大部分原因要归咎于细长的线粒体去极化的阻力。白藜芦醇治疗后,帕金转移到线粒体的磷酸化帕金和PINK1。
3.5。白藜芦醇调节LC3-Mediated自噬诱导Senescent-Like CCCP的心肌细胞
E3泛素连接酶,帕金是针对受损的线粒体和调节其选择性去除受损蛋白质自噬体或溶酶体降解。因此,我们检查了LC3-II / LC3-I CCCP H9c2细胞和引起的转换计算的比率LC3-II LC3-I通过免疫印迹分析。图7(一)表明CCCP (80μ米)治疗3小时LC3-II D0细胞的表达明显增加(左面板)。在D40细胞,我们观察到的增加表达LC3-II CCCP治疗后显著低于D0细胞(中间面板)。如图7 (b)LC3-I LC3-II的比例,增加了约10倍和5倍D0, D40细胞,分别在CCCP的存在。白藜芦醇治疗显著增加LC3-II的表达(图7(一)右面板),在RSV LC3-II增加的比率超过10倍+ CCCP-treated D40细胞。这个结果暗示压制帕金和LC3-II PINK1导致减少活动D-galactose-treated H9c2心肌细胞。白藜芦醇增强的能力挺上调LC3-II表达,这表明它LC3-mediated自噬的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
我们也调查了RSV是否影响了TOM20-labeled H9c2细胞线粒体CCCP对待。治疗24小时后挺,TOM20的表达显著下调在D0细胞(图7 (c)左面板)。相对表达强度进行了计算,结果在图7 (d)显示的表达TOM20 D0细胞中表达下调了约50%接受CCCP 24小时。同时,D40细胞,表达TOM20 CCCP感应(图后没有显著变化7 (c)、中间板)。有趣的是,TOM20的表达显著下调D40 CCCP的细胞治疗白藜芦醇(图7 (c)右面板),表明白藜芦醇的影响可能是参与线粒体自噬过程中被D-galactose H9c2细胞。线粒体内容确认的损失,我们使用的可视化线粒体荧光染色MitoView红和荧光强度计算。D0细胞中,线粒体的形态明显改变非常短,分散点后挺归纳。观察线粒体分布在细胞质中,尽管一些消失(图7 (e)左面板)。线粒体荧光染料染色的强度显著降低,表明线粒体的内容(图7 (f)左面板)。虽然挺D40 +细胞线粒体明显支离破碎,没有明显的线粒体内容可以检测到(数据的损失7 (e)和7 (f)、中间板)。有趣的是,白藜芦醇治疗后,线粒体含量显著减少D40 + CCCP细胞(数据7 (e)和7 (f),对面板)。
4所示。讨论
在我们的研究中,线粒体动态异常被发现和大多数线粒体成了管状或线状D-galactose归纳。线粒体形态是核裂变和核聚变的主要监管者蛋白质,表明线粒体伸长可能是核裂变和核聚变的不平衡造成的28]。免疫印迹分析表明,Drp1可能D-galactose引起的线粒体伸长的主要因素。Mdivi-1线粒体分裂抑制剂,诱导线粒体伸长通过抑制裂变机械(12]。我们的研究表明,线粒体被拉长和Drp1的表达下调,以应对Mdivi-1归纳。与Mdivi-1引起的细胞相比,D-galactose-treated细胞显示出类似的线粒体形态和Drp1表达式,表明线粒体伸长引起D-galactose部分是由于有缺陷的裂变。关于融合蛋白,40 g / l D-galactose感应没有改变Mfn1的表达式,进行Mfn2或OPA1。Neuspiel等人的研究表明,mitofusin 2(进行Mfn2)作为一个信号GTPase诱导线粒体融合和防止渗透过渡29日),这表明Mfn2-mediated线粒体融合增强心肌细胞去极化的耐力。然而,具体进行Mfn2淘汰赛产生放大显示出受损的线粒体呼吸功能(30.]。此外,独立进行Mfn2促进融合,这种蛋白质扑杀受损的线粒体中发挥了重要作用[9]。因此,进行Mfn2的角色在线粒体肿大的形成是复杂的,没有完全阐明。在我们的研究中,Drp1-mediated裂变过程中发挥了主要作用线粒体伸长,以应对D-galactose归纳。白藜芦醇线粒体H9c2细胞伸长显著下降,因此衰减D-galactose引起的线粒体动态的异常特征。
先前的研究已经评估几个参数显示D-galactose在细胞衰老的影响,如先进的糖化终端产品(年龄)、超氧化物歧化酶(SOD)和端粒13,31日- - - - - -33]。细胞衰老是一个非常复杂的过程,因为没有完全阐明,在这里,我们分析了senescent-like H9c2心肌细胞的表型反应评估senescence-associated D-galactoseβ牛乳糖活动,细胞衰老或器官衰老的生物标记(34]。细胞衰老和扩散35),我们观察到的细胞增殖减少了BrdU合并分析。此外,其他代谢紊乱指标,如细胞内钙超载,增强活性氧产量提高,并减少ATP生产的水平,发现H9c2 D-galactose引起的心肌细胞。综上所述,D-galactose感应senescence-associated的活动增加β牛乳糖和减少细胞增殖,从而诱导senescent-like H9c2心肌细胞表型。此外,H9c2细胞显示过多的活性氧产量和D-galactose引起的细胞内钙超载。老化受损心肌细胞产生和放大,表现出过多的活性氧和线粒体呼吸功能突变基因和蛋白质,这使他们更困难比小线粒体有选择地删除(6]。因此,我们进一步评估线粒体膜电位和呼吸来响应D-galactose。D-galactose感应不改变MMP和耗氧率,这意味着线粒体功能没有受损。进一步分析bcl - 2的表达和伯灵顿建议mitochondrial-mediated凋亡信号通路没有激活。进一步评估的白藜芦醇senescent-like D-galactose表明,白藜芦醇引起的表型显著降低SAβ-Gal-positive染色和增加的百分比BrdU / DAPI double-positive染色。此外,白藜芦醇显著降低ROS生产和钙浓度D-galactose,分别在剂量依赖性的方式。
线粒体伸长与异常动态显示改变小分子活化和/或细胞内途径,包括聚变和裂变的平衡和选择性切除受损的线粒体,可能导致减少IPC发展的心脏衰老。Drp1-mediated线粒体分裂被认为是一个潜在的上游效应为后续选择性切除线粒体(20.]。证据表明,减少Drp1表达式受损的线粒体,从而增加心肌细胞凋亡和抑制葡萄糖deprivation-induced自噬体形成和自噬流量。Ikeda等人应用mitochondrial-targeted Keima荧光监测自噬小体的成熟溶酶体在酸性条件下通过检测激发光谱峰值。Keima CCCP-induced阳性染色的线粒体中没有检测到心肌细胞转导Ad-shDrp1,表明线粒体自噬清除Drp1是必要的。更直接的证据表明,减少的数量差别Drp1对这些含有线粒体自噬体和自噬体响应葡萄糖剥夺被电子显微镜检测。此外,作者还调查了自噬流量Drp1-CKO老鼠。Drp1-CKO老鼠,LC3-II的活性抑制和自噬流量出现在两个物理和化学刺激心脏(19]。这个结果导致假设Drp1-mediated裂变机械可能主导受损的线粒体的分离组件。Drp1-mediated线粒体分裂了选择性消除隔离损坏的组件和招募帕金线粒体保持其完整性。抑制Drp1减少线粒体易位帕金(20.]。帕金,E3泛素连接酶,需要在这个过程中促进Drp1-dependent线粒体碎片(36]。此外,PINK1 serine-threonine激酶与帕金调节线粒体编程间隙,有关Drp1-mediated线粒体分裂(37]。普遍接受的一个信号通路参与选择性介导的线粒体清除决心帕金和PINK1蛋白(38]。线粒体外膜去极化激活的本地化PINK1,胞质帕金招聘(39,40]。调查是否Drp1-mediated senescent-like心肌细胞中线粒体伸长抑制线粒体清除选择性,挺被用来诱导线粒体去极化和帕金PINK1激活。
挺是一种传统的化合物导致线粒体去极化和诱发帕金线粒体易位。在我们的研究中,没有发现CCCP-induced线粒体去极化D-galactose H9c2细胞反应。有趣的是,线粒体保留CCCP的细长的形态存在,表明细长的线粒体表现出抗CCCP-induced线粒体去极化。此外,白藜芦醇改善异常线粒体伸长D-galactose-treated心肌细胞移植Drp1的表达。因此,白藜芦醇可能增强CCCP诱导线粒体去极化的能力。白藜芦醇治疗后,线粒体去极化的诱导的挺在D-galactose-treated H9c2心肌细胞。接下来,我们探讨了激活帕金和PINK1确定细长的线粒体的抗CCCP-induced去极化会影响帕金线粒体易位。我们的研究结果表明,帕金转移到线粒体在回应挺归纳。然而,我们没有观察到显著的帕金D-galactose-treated细胞中线粒体易位对CCCP-induced去极化。免疫染色的同时,PINK1表达式的结果分析表明,它的激活是减少,这表明缺陷帕金和PINK1线粒体易位与D-galactose-treated细胞的抗CCCP-induced线粒体去极化。 Furthermore, PINK1-mediated parkin phosphorylation and PINK1 autophosphorylation were essential for the mitochondrial translocation of parkin upon mitochondrial depolarization [41,42]。检查的磷酸化帕金和PINK1,我们应用sds - page凝胶含有phos-tag专门独立的磷酸化蛋白检测用免疫印迹分析。phos-tag凝胶显示的磷酸化水平帕金和PINK1增强应对CCCP感应。然而,磷酸化水平的增加中,并未观察到细胞诱导D-galactose,表明帕金的磷酸化PINK1减少,这表明Drp1-mediated线粒体伸长减毒帕金和PINK1的激活。此外,CCCP-induced LC3-II蛋白质upregulation和损失senescent-like心肌细胞线粒体含量抑制的可能,由于帕金的减毒激活。
突变基因编码帕金和PINK1蛋白质被首次发现在帕金森疾病的发病机理和决心参与其他几个主要的神经退行性疾病的潜在机制43,44]。降低线粒体膜电位和受损的呼吸链中发现parkin-mutant病人和PINK1-mutant患者(45,46]。不正常的线粒体缺陷清除了在神经退行性疾病的进展没有功能帕金和PINK1 [47,48]。潜在的机制阐明研究的功能交互帕金和PINK1显示线粒体功能失调的间隙49]。尽管之间的流行病学联系,帕金森疾病和心脏衰竭,帕金不可或缺的角色,PINK1正常心脏功能受到强烈攻击在过去的十年。证据表明,缺乏帕金小鼠蛋白质含量增强他们对心肌梗塞的敏感性和更大的梗塞大小(50]。减少PINK1蛋白质含量导致线粒体功能受损和氧化还原内稳态在心脏功能障碍(51]。此外,易位的帕金受损的线粒体于心不安。帕金改善心脏的过度老化和维护线粒体完整性(52]。此外,黄等人的研究表明,帕金参与缺血性预处理和短期缺氧的心脏保护增加了帕金在心肌细胞线粒体易位53]。这些研究表明,帕金线粒体完整性起着至关重要的作用在衰老的心,和有缺陷的帕金线粒体易位可能是一个可能的损失或衰减的原因心脏缺血性预处理。
白藜芦醇是一种多酚化合物,功能与年龄相关的疾病(54]。据说白藜芦醇可以改善心脏功能,没有心通过激活SIRT1蛋白质水平和改善AMPK表达式(55]。研究了白藜芦醇对线粒体的影响多年。白藜芦醇对线粒体被证明具有多个影响质量,mtDNA内容,upregulation PGC-1的生物起源的因素α,支持白藜芦醇对心肌缺血/再灌注损伤的作用通过减少活性氧生成和注射抑制mPTP药物打开(56]。与此同时,白藜芦醇可以表现出对氧化应激的保护作用调节线粒体生物起源SIRT3-dependent地激活AMPK-PGC-1之后α犯错α信号(57]。值得注意的是,我们的研究是第一个研究白藜芦醇对线粒体动力学的影响。线粒体的形态研究活细胞染色和超微结构的检测表明,白藜芦醇改善线粒体伸长通过上调Drp1表达式。因此,我们的研究提供了一种新的观点在白藜芦醇的影响线粒体动态失衡,这表明白藜芦醇具有防衰老的潜在机制可能与线粒体动力学(图8)。同时,白藜芦醇线粒体去极化的程度增加,可能通过改善线粒体伸长。几十年来,很少有研究探讨了白藜芦醇对帕金和PINK1蛋白质表达的影响和涉及到的信号通路。最近,达斯等人发现了白藜芦醇展出Sirt1-Sirt3-Foxo3-PINK1-PARKIN信号网络的潜在影响在缺血/再灌注损伤(58]。虽然他们的研究提供了前景的洞察白藜芦醇的有效机制,包括帕金和PINK1,完全理解角色的白藜芦醇的功能激活帕金和PINK1在不同病理过程仍然需要完成。幸运的是,我们的研究表明,白藜芦醇显著诱导线粒体易位帕金senescent-like H9c2心肌细胞通过调节帕金和PINK1的磷酸化。此外,白藜芦醇调节LC3-II的表达和D-galactose-induced细胞中的线粒体含量下降,这表明它LC3-mediated自噬的影响。
(一)
(b)
(c)
5。结论
总之,我们的研究H9c2心肌细胞线粒体动态障碍特点,提出细胞senescent-like表型,以应对D-galactose归纳。我们观察到线粒体伸长Drp1-mediated裂变障碍。有趣的是,D-galactose-treated心肌细胞线粒体去极化阻力,及其线粒体形态表现出伸长,以应对CCCP归纳。重要的是,天然多酚化合物白藜芦醇改善线粒体伸长通过加强Drp1表达式和增加线粒体去极化的程度,表明线粒体伸长部分涉及去极化阻力。此外,帕金和PINK1的激活,包括线粒体易位和蛋白质磷酸化,为了应对CCCP感应是senescent-like心肌细胞中发现的。最后,白藜芦醇调节线粒体易位的帕金,帕金和PINK1的磷酸化,激活和调节LC3-II活动,为进一步的研究提供一种新的药理方法Drp1以及parkin-PINK1信号机制。
缩写
| IPC: | 缺血预处理 |
| ATP: | 三磷酸腺苷 |
| KATP: | ATP-sensitive钾离子通道 |
| MMP的: | 线粒体膜电位 |
| ROS: | 活性氧 |
| Mfn1: | Mitofusin 1 |
| 进行Mfn2: | Mitofusin 2 |
| OPA1: | 视神经萎缩1 |
| Drp1: | Dynamin-related蛋白1 |
| Mdivi-1: | 线粒体分裂抑制剂1 |
| PINK1: | PTEN-inducible激酶1 |
| SIRT1: | Sirtuin蛋白1 |
| bcl - 2: | b细胞淋巴瘤2 |
| 伯灵顿: | Bcl-2-associated X |
| RSV: | 白藜芦醇 |
| 挺: | 羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone |
| BrdU: | 溴脱氧尿苷 |
| LC3: | Microtubule-associated蛋白质1 b / 1轻链3。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究受到了澳门科学技术发展基金(项目号:073/2011 / A3和052/2013 / A2)。