文摘
叶破(FM)的叶子破香l,shows various biological functions including antioxidant activity andα葡糖苷酶抑制作用。然而,它的潜在治疗在急性肝损伤仍然是未知的。本研究调查了王亚南的潜在机制polyphenol-enriched分数(FMF)叶破。FMF表现出很强的自由基清除活性和阻止细胞HepG2 / Hepa1-6过氧化氢(H2O2-)体外诱导活性氧的生产和细胞凋亡。抗氧化活性和cytoprotective效应进一步验证了减轻APAP-induced小鼠的肝毒性。免疫印迹分析表明FMF预处理明显废除APAP-mediated MAPKs磷酸化,激活proapoptotic蛋白质caspase-3/9和伯灵顿,抗凋亡蛋白的表达Bcl2和恢复。APAP-intoxicated老鼠使用FMF表明核转录因子核积累增加的红色的两个相关因素(Nrf2)和肝目标基因的表达升高,NAD (P) H:奎宁氧化还原酶1 (NQO1)和hemeoxygenase-1 (HO-1)。高效液相色谱分析显示四个主要酚类化合物存在于FMF: narcissin isorhamnetin-3-O -β-D-glucoside、isovitexin和牡荆素。因此,这些发现表明,FMF拥有王亚南反对APAP-induced肝毒性主要是通过双修改ROS MAPKs /凋亡轴和Nrf2-mediated抗氧化反应,这可能是由于强烈的酚类抗氧化活性组件。
1。介绍
肝脏代谢和解毒作用的主要器官,调节体内平衡体内代谢物生成/外源性物质在药物暴露(1]。由于这些关键功能,肝脏是容易损害引起的肝毒素的化学、自由基等活性氧(ROS) (2]。生产过剩的增强剂/ ROS在肝脏结构和功能完整性造成破坏的细胞,导致广泛的肝损伤(3]。抗氧化功能障碍/解毒防御系统也被认为是发展中发挥重要的病理生理学作用,肝脏疾病(4]。因此,发展王亚南代理减少或消除活性氧的生产和加强生理抗氧化能力将是一个有效的策略对抗氧化应激导致肝损伤和疾病。
对乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol APAP即),常用的止痛和退热的药物,被广泛用于研究肝毒性与氧化应激和评估相关治疗药物的潜力的候选人。APAP即通常是安全有效的治疗剂量,但过量可引起严重的急性肝损伤(5]。机械化,APAP-induced肝毒性是由广泛的N-acetyl-p-benzoquinone形成亚胺(NAPQI) APAP即活性代谢物,从而耗尽肝脏谷胱甘肽(GSH)和导致线粒体功能障碍和破坏,导致生产过剩的线粒体活性氧(6,7]。在APAP即挑战,从线粒体ROS生成和其他来源不仅会导致细胞损伤通过与随后的肝损伤机制涉及脂质过氧化作用[8c-jun-N-terminal等),但也激活许多激酶激酶(物),加剧退化进程在肝组织中(9]。进一步增强了线粒体ROS生成激活物绑定。此外,物可以使磷酸化几个转录因子,如p53和NF -κB,加速肝细胞凋亡和炎症反应10,11),最终导致大量的氧化应激和急性肝损伤。
因此,严格控制ROS水平的抗氧化和解毒酶分子中起着至关重要的作用在维持细胞内氧化还原内稳态响应氧化侮辱。已经证明了核转录因子红细胞两个相关因子(Nrf2)及其负面调节器kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1)作为一种重要的细胞对抗氧化应激反应轴(12]。Nrf2属于基本亮氨酸拉链的转录因子家族,与氧化剂反应元素的主要监管机构——(是)介导的解毒和抗氧化基因表达13]。在基础条件下,Nrf2与Keap1留存在细胞质中。针对氧化应激,Nrf2 Keap1分离,把原子核,它结合在上游地区,随后促进其目标基因的转录,包括NAD (P) H:奎宁氧化还原酶1 (NQO1) glutamate-cysteine连接酶催化和修饰符单元(GCLC和GCLM),和血红素oxygenase-1 (HO-1) [14]。大量研究表明Keap1-Nrf2-ARE信号通路参与器官损伤造成的不良刺激。老鼠缺乏Nrf2显示高易感性APAP-induced肝损伤(15,16]。相反,hepatocyte-specific Keap1基因敲除小鼠表现出基因编码的增加解毒酶和抵制肝毒性(17]。因此,代理可以激活Nrf2可能有利于减轻肝脏氧化应激损伤。
尽管增加王亚南代理需要从肝损伤保护人们,只有数量有限的成功有效的和可靠的药物,其中一些甚至拥有潜在的不利影响。近年来,大量的食用和药用植物在世界各地引起了越来越多的关注作为膳食补充剂和治疗干预策略为他们的优秀的促进健康无害的属性和低于合成代理(18- - - - - -20.]。破香l,belonging to the Malvaceae family, is mainly distributed in tropical and subtropical areas of South and Southeast Asia [21]。在中国,它的叶子,命名为叶破(FM),传统上作为民间药物和草药茶材料用于治疗发热、中暑、消化不良、腹泻(22]。以前的植物化学的研究调频验证各种生物活性成分的存在,如常用药用、类黄酮和生物碱药理作用[21- - - - - -23]。然而,很少有报告可用来描述调频对肝损伤的潜在影响和什么样的化合物有关。因此,本研究评估polyphenol-enriched分数的影响(FMF)调频氧化应激和APAP-induced肝毒性和调查潜在的机制。此外,FMF的主要组件是识别和量化的反相高效液相色谱法(rp)获得洞察负责其抗氧化的化合物和王亚南效果。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
对乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol APAP即)、3 - (4 5-dimethylthiazol-2yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT), 2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA), 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),氮蓝四唑(电视台),吩嗪methosulfate (PMS),β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,减少二钠盐,三水(βnadh)、苏木精和伊红从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国);试剂盒,PrimeScript™RT大师混合,混合和SYBR绿色主购买从豆类生物技术(中国大连);寡核苷酸被Sangon合成生物技术(中国上海);没食子酸和抗坏血酸从Sangon购买生物技术(中国上海);分析工具的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、malonaldehyde (MDA),减少谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶和(氧化酶)购自南京建成生物技术研究所(中国南京);核和胞质蛋白提取设备购买Beyotime生物技术研究所(中国上海);杜尔贝科的最低基本培养基(看看),胎牛血清(的边后卫)、青霉素、链霉素和从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。所有其他化学物质都可用的最高等级。
2.2。植物材料、提取和准备
的叶子破香l是购买从广州清平中医专业市场,广东,中国。浓溶液(FME)准备按照以下程序(24]:调频(400克)的风干的叶子和煮粉7000毫升的去离子水1 h。过滤过的汤,然后集中由一个旋转蒸发器在55°C水浴。FME又过滤了之前添加到Diaion HP-20树脂(三菱化学、东京、日本)列,与两列的顺序,然后洗水和75%乙醇水溶液。糖、蛋白质和盐被用水洗列删除,洗出液被任命为逐步检测。多酚是保留,然后用75%的乙醇水溶液,筛选了,洗出液被指定为FMF。每个洗出液被真空旋转蒸发浓缩。集中解决方案在冷冻干燥器干燥然后储存在4°C。逐步的收益率和FMF分别为20.0和10.9 g,分别。
2.3。总多酚和总黄酮类化合物的测定
总多酚含量在不同的分数是衡量Folin-Ciocalteu方法没食子酸当量(GAE),表示为毫克每克分数没食子酸(25]。短暂,整除1毫升样品或标准的解决方案是混合1毫升Folin-Ciocalteu试剂反应,允许为3分钟。然后,1毫升10% Na2有限公司3的解决方案是添加到混合物,蒸馏水提供10毫升的最后一卷,其次是彻底混合和进一步站在25°C 2 h。吸光度检测在760 nm,总多酚含量计算GAE从校准曲线(,,1-50μ没食子酸的g)。数据表示为一式三份的平均值分析。
分数测定使用修改后的总类黄酮芦丁等价物(重新)比色法,表示为毫克每克分数(芦丁26]。大约1毫升的样品或标准的解决方案是混合0.2毫升的5%纳米2解决方案。5分钟后,AlCl 0.2毫升的10%3解决方案是增加,混合物被允许站5分钟。随后,反应的解决方案是与0.6毫升的4%氢氧化钠溶液混合,和60%乙醇立即提供获得最后一个10毫升,其次是彻底的混合和站10分钟。在510纳米混合物的吸光度测定,和总类黄酮含量计算是根据校准曲线(,,1-50μg(芦丁)。数据表示为一式三份的平均值分析。
2.4。测量在体外的抗氧化活动
DPPH自由基清除活性不同的分数是评估基于报道方法(27]。一毫升的样品在不同浓度添加到100毫升μ刚做好的DPPH自由基甲醇溶液。反应混合物都摇动了积极和孵化37°C在黑暗中30分钟,同等体积的甲醇和DPPH作为控制。吸光度测量在517海里。超氧化物阴离子自由基(O2•−)清除活动不同的分数测定使用修改后的方法(28]。一毫升的样品在不同浓度是468年先后与1毫升的混合μM NADH, 60μ经前综合症,和156年μM电视台,然后在室温下孵化为5分钟。在560纳米混合物的吸光度测定,和同等体积的甲醇作为控制。
清除活动估计基于百分比的DPPH和O2•−如图所示,下列方程:
2.5。细胞培养和治疗
人类肝癌细胞系(HepG2)和小鼠肝癌细胞株(Hepa1-6)从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。细胞在DMEM培养补充10%的边后卫和100 U /毫升青霉素和链霉素在37°C和5%湿润孵化器有限公司2纯度的浓缩铀的气氛。在H确定FMF的抗氧化作用2O2全身的氧化应激模型,细胞被播种在96孔板的初始密度2×104细胞/坚持一夜之间,孵化与不同浓度的FMF 12 h,然后暴露于400年μM H2O2在不改变介质4 h (29日]。控制细胞孵化与相同体积的培养基。
2.6。细胞形态学分析
细胞被播种在96孔板的初始密度2×104细胞/坚持一夜之间,孵化与不同浓度的FMF 12 h,然后暴露于400年μM H2O2在不改变中4 h。细胞形态学图像被放大的100 x [29日]。
2.7。细胞生存能力分析
细胞生存能力是衡量MTT试验(30.),这是基于麻省理工的转换深蓝色甲瓒由线粒体脱氢酶酶晶体。总之,10μL 5毫克/毫升MTT添加到每个在37°C和孵化4 h。孵化后,培养基从井中删除,取而代之的是150年μL DMSO溶液。盘子被大力动摇了以确保完全溶解。最后,甲瓒吸光度测量在盘子里读者(分子器件、桑尼维尔CA)在490海里。相对细胞生存能力的吸光度计算处理细胞除以未经处理的控制细胞的吸光度。
2.8。测量细胞内ROS体外
细胞内ROS水平衡量使用修改后的方法与DCFH-DA荧光探针(31日]。细胞培养在collagen-coated 96 -黑色板透明底部,治疗FMF在不同浓度为12 h,然后暴露于400年μM H2O2在不改变中4 h。随后细胞含有10μ在37°C M DCHF-DA 30分钟。与PBS缓冲洗两次后,荧光强度代表的细胞内ROS水平被发现在485/20 nm兴奋和528/20 nm发射使用荧光标(分子器件、桑尼维尔CA)。
2.9。动物和实验设计
雄性ICR小鼠体重22.5±1.0克购买实验动物中心,厦门大学(厦门,中国)。老鼠被允许适应实验室条件7天前剂量和维护在温度控制的环境中(22±2°C) 12 h光暗周期,免费的水,和标准啮齿动物食物。所有方法进行按照美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南。都是努力减少实验用动物的数量,他们的痛苦。
小鼠随机分为三组,如下:1组,对照组,给予适当的车辆在整个实验过程;组2、APAP即组,给予500毫克/公斤体重APAP即;组3、APAP即+ FMF组,给予不同剂量的FMF(100、200和400毫克/公斤体重)之前APAP即管理。
具体、组1和2有PBS和组3是口头管理FMF每天一次连续7天。两个小时后最终的管理,组1接受适当的车辆,而组2和3与APAP即治疗剂量500毫克/公斤体重的胃内的管理。随后老鼠麻醉血液样本集合,然后牺牲获得12 h APAP即治疗后肝组织。血清样本被离心分离血液在10000 g×10分钟在4°C,然后保持在生物−80°C。肝脏的一部分是由4%的多聚甲醛固定的组织病理学分析,和其余组织瞬间冷冻在液氮和存储−80°C进行进一步分析。
2.10。测量血清的生化参数
评估APAP即政府造成的肝损伤,酶活动的血清ALT, AST、LDH估计通过使用相应的商业试剂盒(南京建成生物技术研究所、中国)。结果ALT、AST、LDH表示为单位每升(U / L)。
2.11。测量肝脏谷胱甘肽的水平,氧化酶,SOD,猫,和MDA
肝组织均质在冰冷的PBS缓冲,然后在10000×g离心10分钟在4°C。上层清液收集的测量肝脏MDA,谷胱甘肽氧化酶,SOD,猫使用相应的商业试剂盒(南京建成生物技术研究所、中国)。结果纠正他们的蛋白质含量。
2.12。组织病理学分析
刚获得肝脏的部分被固定在4%多聚甲醛磷酸缓冲溶液为24小时,然后嵌入在石蜡切片(8]。苏木精和伊红染色进行5μm石蜡部分按照一个标准程序,分析了光学显微镜。
2.13。制备的核和胞质分数
肝脏核和胞质提取物是由使用核和胞质蛋白提取工具包(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)根据制造商的协议。蛋白质浓度测定布拉德福德方法使用牛血清白蛋白作为标准。
2.14。RNA隔离、rt - PCR和实时定量PCR分析
总RNA分离出肝组织使用试剂盒试剂(豆类生物技术,大连,中国),然后反向转录而互补使用PrimeScript RT大师混合(豆类)根据制造商的指示。定量实时PCR分析使用SYBR绿色主人混合(豆类)罗氏LightCycler®480系统(瑞士罗氏集团)。GAPDH分析每个样本的内部控制规范化,褶皱变化mRNA表达被Comparative-Ct计算方法(ΔΔCt方法)。
正向和反向引物用于特定基因列出如下:伯灵顿:(向前,5′-TTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′和反向,5′-GCAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3′);Bcl2:(向前,5′-GGCATCTTCTCCTTCCAG-3′和反向,5′-CTACCCAGCCTCCGTTAT-3′);GAPDH:(向前,5′-TGCCGCCTGGAGAAACCT-3′和反向,5′-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3′)。
2.15。免疫印迹分析
冷冻肝脏组织在裂解缓冲与均质玻璃均质器,和蛋白质浓度被确定。蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),转移到聚乙二烯二氟化物膜,然后通过免疫印迹分析确定适当的初级抗体的稀释1:1000。抗体裂解caspase-3 (9664), caspase-3(9665)、裂解caspase-9 (9509), caspase-9(9508),伯灵顿(2772)、Bcl2 (3498), phospho-JNK(4668)、物(9252),phospho-ERK1/2 (4370), ERK1/2 (4695), GAPDH (2118), Nrf2 (12721), HO-1(70081),微管蛋白(2148),和核纤层蛋白B(13435)从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA);抗体NQO1 (11451 - 1 - ap)和CYP2E1 (19937 - 1 - ap)买来Proteintech集团(武汉,中国)。辣根peroxidase-conjugated兔抗体免疫球蛋白(7074)或老鼠免疫球蛋白(7076)(1:5000稀释为每个)从杰克逊ImmunoResearch购买实验室(美国西树林,PA)。蛋白质乐队是可视化使用西方SuperSignal Pico工具包(美国热费希尔科学皮尔斯,IL)根据制造商的指示。
2.16。高效液相色谱法分析FMF的主要化合物
FMF的化学成分是决定使用高效液相色谱法。分析了使用型18列(5μ米、150毫米×4.6毫米id,安捷伦科技,美国)在一个安捷伦1260系列高效液相色谱系统配备一个二极管阵列检测器,一个autosampler,一个openLAB cd ChemStation工作站(安捷伦科技)。梯度洗脱是由不同比例的溶剂(acetonitrile-methanol 25日:75年,v/vB)溶剂(水、含0.1%甲酸),流速为1.0毫升/分钟。溶剂梯度是如下:清廉最小值从5%到25%;10 - 50分钟从25%到28%;50 - 70分钟从28%到28%的紫外检测波长为360纳米,注入体积是10μl .分离都是在25°C。FMF的冻干粉末溶解在甲醇浓度为0.44毫克/毫升。所有样品和移动0.45过滤阶段μm膜滤器(微孔),然后脱气前超声波浴使用。四个不同的黄酮类化合物,包括牡荆素、isovitexin isorhamnetin-3-O -β-D-glucoside, narcissin调查。识别这些化合物是由比较保留时间(tR)与商业标准。每个校准曲线的线性回归方程建立了策划的每个标准化合物注射量与平均峰面积。
2.17。统计分析
所有数据都代表至少有三个独立的实验。结果显示为平均数±标准差。学生的t以及用于比较两组。差异被认为是重要的。棱镜6软件包(GraphPad软件有限公司、美国)是用于统计测试和图形演示的数据。
3所示。结果
3.1。总酚、类黄酮含量和抗氧化活性不同的提取
多酚类化合物能够减轻氧化应激通过发挥抗氧化活动或影响抗氧化防御系统32,33]。因此,总酚含量FME基金逐步,FMF使用Folin-Ciocalteu方法测定。如表所示1FME基金,逐步,FMF包含79.3±1.1,24.2±2.5,338.1±8.4μ分别g GAE / mg提取。类似的结果观察测定的总类黄酮含量FME基金逐步检测,和FMF值达到175.8±2.1,36.0±4.2,519.3±5.3μ分别g RE / mg提取。定量分析表明,FMF包含总酚醛树脂和总类黄酮的含量最高,暗示FMF polyphenol-enriched分数。然后,DPPH自由基和超氧化物阴离子自由基(O2•−清除系统被用来评估的抗氧化潜力FME基金逐步和FMF。如图1和表S1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/3631565FMF表现出对DPPH浓度清除活动和O2•−激进分子从10μ40 g / mLμ克/毫升,这个属性是优于其他测试提取。此外,自由基清除活性的差异之间的FMF和积极控制抗坏血酸在检测系统中,尤其是当浓度高于40μ克/毫升。这些结果显示紧密联系总酚和类黄酮含量和抗氧化能力,表明polyphenol-enriched FMF叶破可能提供抵御氧化损伤。因此,FMF被选为下面的细胞和动物实验。
(一)
(b)
3.2。保护体外FMF对氧化应激的影响
一个小时2O2HepG2细胞介导的氧化应激模型成立调查FMF对氧化损伤的影响。我们可以看到在图2H2O2接触造成了严重的氧化应激,ROS增加生产和高细胞死亡率与未经处理的控制细胞。突出的形态变化也引起的H2O2刺激(图S1)。然而,上述改变明显减轻FMF预处理的剂量依赖性的方式。也观察到类似的结果Hepa1-6细胞(图S2和S3)。进一步的细胞毒性试验表明FMF几乎没有影响的可行性测试细胞(图S4)。总的来说,这些体外数据支持治疗FMF的潜力在调节抗氧化反应。
(一)
(b)
3.3。FMF抑制APAP-Induced肝损伤
氧化应激具有初始和增强作用的发病机理APAP-induced肝毒性(34]。因此,王亚南FMF的影响研究在APAP-induced肝损伤小鼠模型。如图3,老鼠接受APAP即(500毫克/公斤体重)显示严重肝损伤的证据,所显示的显著增加血清ALT、AST、LDH的活动。然而,这些APAP-caused增加明显,剂量依赖性抑制FMF预处理(100、200和400毫克/公斤体重)。组织病理学分析为生化参数分析(图提供了支持证据4)。APAP-intoxicated小鼠肝脏样本的部分显示的形式广泛的组织学变化显著的总值坏死,正弦充血,出血和炎性细胞浸润。有趣的是,FMF预处理明显改善APAP-induced肝损伤,和管理APAP即FMF的剂量400毫克/公斤体重外观接近正常水平显示,表明FMF可以防止APAP-induced肝损害。
(一)
(b)
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3.4。FMF APAP-Induced减少肝脏氧化应激
脂质过氧化和抗氧化剂酶活性测定检查FMF APAP-induced氧化损伤的作用。MDA,一个主要的最终产品形成过程中脂质过氧化反应的最后阶段,通常被认为是有毒的直接索引过程引起的自由基(35]。如图5老鼠,政府APAP即显著升高比未经处理的正常组MDA水平。小鼠的肝脏抗氧化能力也大幅减少,在肝脏谷胱甘肽显著减少,体现的氧化酶,SOD,和猫的活动,主要的酶或非酶的抗氧化剂和监管机构的组织负责细胞内氧化还原内稳态。然而,上述改变被FMF预处理有效争议,显然表明FMF的强大的抗氧化能力与APAP-induced肝损伤。
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3.5。FMF改善ROS / MAPKs /凋亡信号的激活和促进Nrf2核易位防止APAP-Induced肝毒性
确定FMF的潜在机制缓解APAP-induced急性肝损伤小鼠肝脏样本APAP即有或没有治疗FMF预处理(400毫克/公斤体重)均相免疫印迹分析。人们普遍认识到,APAP即转化为高度活性代谢物NAPQI由肝细胞色素P450系统,特别是CYP2E1的活动是至关重要的发展APAP-induced肝脏损伤(6,7]。提出了图6(一)APAP即治疗导致显著增加CYP2E1的表达水平。然而,FMF预处理明显抑制CYP2E1 APAP-induced高程。许多研究已经说明了细胞凋亡参与APAP-induced肝毒性(36,37]。因此,apoptosis-related蛋白质的表达。APAP即管理水平显著提高裂解caspase-3/9和伯灵顿,Bcl2蛋白表达减少。然而,这些影响被FMF预处理显著逆转。也观察到类似的结果mRNA水平的伯灵顿和Bcl2(图6 (b))。MAP激酶的活化,尤其是物和ERK的磷酸化,会加剧APAP-induced线粒体氧化应激和加剧肝细胞凋亡38]。我们可以看到在图6(一)老鼠APAP即管理,大幅增加磷酸化物和ERK的水平。这是在良好的协议与以前的研究结果。有趣的是,FMF预处理明显抑制APAP-mediated磷酸化。因此,这些结果表明FMF缓解APAP-induced肝细胞凋亡部分通过失活物/ ERK MAPK通路。Nrf2,氧化应激的关键传感器,具有保护作用对APAP-induced肝毒性通过调节细胞内的表达解毒和抗氧化基因负责cytoprotective进展(12]。检查是否FMF影响Nrf2信号,Nrf2蛋白表达和核测量积累。如图7,尽管Nrf2蛋白质水平略有增加,核易位Nrf2 APAP即中毒后抑制。假设APAP即治疗压抑的转录活动Nrf2进一步支持两个Nrf2目标基因的表达水平下降(NQO1和HO-1)。然而,抑制由于APAP即政府被FMF预处理显著恢复。此外,治疗FMF可能在某种程度上促进Nrf2核易位和目标基因的表达,以实验验证Hepa1-6细胞(图S5)。综上所述,这些数据表明FMF增强Nrf2核管理积累,导致一个增强抗氧化防御系统来防止APAP-induced氧化损伤。
(一)
(b)
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(b)
3.6。描述FMF的化学成分
高效液相色谱分析进行识别和量化FMF的主要多酚类化合物存在。高效液相色谱色谱标准和样本如图S6。提出了高效液相色谱的分析条件下,一个好的基线分离得到的所有分析物,和四类黄酮苷,包括牡荆素,isovitexin isorhamnetin-3-O -β-D-glucoside narcissin,被确定通过比较他们的保留时间(21.3,24.6,45.3,47.2分钟,resp)与真实的标准。从各自的标准曲线定量数据计算(表S2)。如图S6 (b)和表S2, narcissin (62.4μg / mg)被确认为FMF的主要酚类化合物,其次是isorhamnetin-3-O -β-D-glucoside (11.3μ10.6 g /毫克),isovitexin (μg /毫克),牡荆素(10.4μg /毫克)。
4所示。讨论和结论
在目前的研究中,我们证明polyphenol-enriched分数(FMF)叶破有一个预防APAP-induced肝细胞凋亡和氧化损伤的影响。APAP-induced肝毒性,作为一个实验方便临床相关的动物模型,被广泛用于研究肝损伤与活性氧等自由基引起的氧化应激(39]。先前的研究在APAP即毒性记载,氧化应激是主要的机制参与肝毒性的发展,和广泛的抗氧化防御系统的缺陷也观察到APAP-intoxicated组织(34]。目前,防治(NAC),作为抗氧化剂谷胱甘肽的前体(谷胱甘肽),作为小学和fda批准APAP即中毒的解毒剂。然而,它的效果是有限的,因为治疗窗口和不利影响40,41]。因此,重视发展与很少或没有有效的治疗药物的副作用。
最丰富的多酚类化合物存在于绿茶和草药茶,已经引起越来越多的关注,其药用功能和健康的好处,和被广泛接受的机制背后的这些属性包括减少清除自由基的氧化应激(42]。据我们所知,没有报告链接王亚南酚类成分的影响叶破。在这项研究中,polyphenol-enriched分数(FMF)叶破施加强有力的抗氧化特性在DPPH和O2•−清除化验(图1H)和预防2O2全身的ROS生产和细胞死亡(图2)。FMF的相当大的抗氧化效果,这主要是归功于多酚成分的含量高,意味着潜在的叶破在氧化stress-mediated肝损伤的预防或衰减。这个假设被进一步验证通过抑制APAP-induced肝损伤小鼠使用FMF。我们的数据显示,血清ALT水平显著增加,AST、LDH,这被认为是肝组织损伤的敏感指标,APAP即政府后,先前报道(图3)[7,10]。然而,FMF预处理明显阻止这些海拔,表明FMF不仅保留肝细胞膜结构和功能的完整性,也保护肝组织反对APAP即毒性作用。组织病理学检查为王亚南FMF的影响提供了视觉证据,所体现的恢复对histomorphological变化(图4)。
人们普遍认识到增强的脂质过氧化作用和减少功能的酶或非酶的抗氧化防御系统的主要特征是APAP-induced肝毒性(6]。在这项研究中,管理APAP即小鼠肝脏抗氧化能力显著下降,表现为MDA含量显著增加,减少肝脏SOD水平,猫,氧化酶,谷胱甘肽,往往被视为氧化应激反应指标(6,7,10]。然而,FMF预处理明显逆转肝氧化损伤参数的变化(图5)。集体和组织病理学证据,结果在血清和肝组织生化参数分析表明,在APAP-induced FMF肝损伤的保护作用可能导致修改的内源性抗氧化防御系统。
越来越多的证据表明,肝细胞凋亡中起着重要的作用APAP-induced肝毒性(36,37]。在这个过程中,活性氧源自APAP即bioactivation直接通过MAPK通路激活物。加上ROS,激活物能刺激proapoptotic蛋白质的表达和阻止凋亡蛋白的功能,导致严重的肝毒性和细胞凋亡38]。也报道,抑制物或hepatocyte-specific物基因敲除小鼠预防线粒体氧化应激的发展和降低肝细胞凋亡和肝损伤(43,44]。与以前的结果一致,目前的研究表明,APAP即政府造成了严重损伤的抗氧化防御系统和MAPK通路的激活。然而,这些改变可能会大幅逆转FMF预处理(数据5和6),这表明FMF来防止氧化应激的重要潜在的肝细胞凋亡。半胱天冬酶和Bcl2家庭成员提出了监管机构是至关重要的凋亡反应由许多代理。一些研究也证实了著名的凋亡特征APAP-intoxicated肝组织,正如从线粒体细胞色素c的释放,减少Bcl2 /伯灵顿比,caspase-3活动的增加,6,8,9 (45,46]。在我们的手中,在APAP即挑战,FMF预处理明显争议caspase-3/9转化为活性形式,增强Bcl2水平,并减少了伯灵顿蛋白质和mRNA水平表达,暗示行动对APAP-induced FMF的肝损伤可能是通过抑制细胞凋亡(图6)。在此基础上,我们的研究结果表明,在FMF的存在,减少ROS-mediated激活MAPKs可能会同还原对细胞凋亡的影响轴,增加导致的氧化应激和细胞生存APAP即挑战的回应。
在生物氧化应激后,抗氧化防御系统经常被激活提供保护,以防止氧化损伤通过维持细胞氧化还原内稳态(47]。大量研究证明了Nrf2积极参与氧化stress-mediated APAP即治疗[引起的肝毒性12- - - - - -17]。探索hepatoprotection的可能机制,目前的研究工作归纳影响FMF Nrf2激活的信号。我们的研究结果显示,FMF预处理增强Nrf2核积累和延迟核排斥APAP即,导致增强转录活动。FMF的积极调控Nrf2信号进一步体现第二阶段的恢复APAP-induced还原酶,包括NQO1和HO-1(图7和图S5),这两个中扮演关键角色的主要监管机构消除活性氧和有毒代谢物来源于肝脏组织的氧化还原过程。NQO1酶减少NAPQI和防止APAP即导致线粒体功能障碍48]。HO-1催化血红素形成胆绿素的乳沟和减少细胞内ROS生产(49]。因此,我们的研究结果表明,FMF增强肝防御系统通过激活Nrf2-mediated抗氧化和解毒基因表达来防止APAP-induced肝损伤。
在当前的研究中,主要多酚在FMF被识别和量化的主要有效成分高效液相色谱分析,获得洞察负责其抗氧化和王亚南效果。高效液相色谱法分析清楚地表明,narcissin (62.4μg / mg)被发现FMF的著名的酚类化合物,其次是isorhamnetin-3-O -β-D-glucoside (11.3μ10.6 g /毫克),isovitexin (μg /毫克),牡荆素(10.4μg / mg)(图S6和表S2)。Narcissin和isorhamnetin-3-O -β-D-glucoside共享相同的基本父异鼠李亭结构,不仅已被证明是一种有效的抗氧化剂代理也是一种候选药物预防和治疗肝脏疾病(50]。异鼠李亭报道中有效保护肝细胞免受氧化应激通过激活AMPK途径(51]。最近的一项研究证实异鼠李亭王亚南函数的衰减抑制肝纤维化的TGF -β/ Smad和Nrf2信号(52]。也表明narcissin具有显著的抗氧化效果non-enzyme-induced在孤立的微粒体脂质过氧化CCl并提高了肝细胞的生存能力4——和t-BuOOH-induced损伤模型53]。Isorhamnetin-3-O -β-D-glucopyranoside描述减轻肝脏的副作用乙醇摄入提高alcohol-oxidizing酶的活动,微粒体ethanol-oxidizing系统和醛脱氢酶(54]。牡荆素、isovitexin和牡荆素,isovitexin-enriched提取物也表现出抗氧化或王亚南活动(55- - - - - -57]。因此,存在narcissin isorhamnetin-3-O -β-D-glucoside、牡荆素isovitexin FMF的叶破可能导致其抗氧化的主要生物活性化合物和王亚南属性。这种假设需要进一步验证和将在我们未来的研究讨论。
总之,目前的研究首次展示了FMF的王亚南作用在肝脏组织作为一个关键的十字路口APAP即通过双重改性挑战引发的级联反应的细胞凋亡信号通过对活性氧的影响/ MAPKs轴和Nrf2-mediated抗氧化防御系统响应(图8)。总的来说,我们的数据强烈透露polyphenol-enriched分数的临床潜力叶破作为一个自然和功能性食品成分的氧化应激预防肝损伤。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Hongtan吴和张帮派贡献了同样的工作。
确认
这项研究是由厦门医科大学博士启动基金项目(KX1513;K2016-09)和年轻学者的教育和科学研究项目由福建教育部门(JA14422)和格兰特从厦门市政科技(3502 z20153032;3502 z20161229)。
补充材料
表S1。不同提取物的体外抗氧化活性叶破。图S1: FMF对形态的影响变化引起的H2O2在HepG2细胞。细胞治疗FMF(10、20、40、80、100、和200年μg /毫升)400年存在μM H2O24 h和显微镜观察到。(一)控制细胞。(b)细胞暴露于H2O2。(碳氢键)细胞使用不同剂量的FMF然后暴露于H2O2。图S2: FMF对H的影响2O2在Hepa1-6细胞介导的氧化应激。细胞治疗FMF(10、20、40、80、100、和200年μg /毫升)400年存在μM H2O24 h。(a)活性氧形成使用荧光标仪测量。(b)细胞死亡率被MTT试验评估。结果显示平均±标准差(n = 3)。∗∗∗与对照组相比P < 0.001;# # #p < 0.001,# #p < 0.01,#p < 0.05相比,H2O2中毒组。图S3: FMF对形态的影响变化引起的H2O2在Hepa1-6细胞。细胞治疗FMF(10、20、40、80、100、和200年μg /毫升)400年存在μM H2O24 h和显微镜观察到。(一)控制细胞。(b)细胞暴露于H2O2。(碳氢键)细胞使用不同剂量的FMF然后暴露于H2O2。图S4:细胞毒性试验。HepG2 (a)和(b) Hepa1-6细胞是治疗FMF(10、20、40、80、100、和200年μg /毫升)24 h,并通过MTT测定细胞死亡率评估。结果显示平均±标准差(n = 3)。图S5: FMF Nrf2核易位的影响及其目标基因的表达。Hepa1-6细胞治疗FMF(100μg /毫升)12和24小时。(a)核和胞质提取细胞的准备,和蛋白质水平的Nrf2决心通过免疫印迹。核纤层蛋白B和微管蛋白被用作核和细胞质内生控制,分别。(b)提取细胞总蛋白质,蛋白质含量,Nrf2 NQO1和HO-1取决于蛋白质印迹。GAPDH是作为内生控制。免疫反应性的乐队的相对强度进行了分析,结果显示为均值±SD (n = 3)。∗∗∗p < 0.001,∗∗与对照组相比p < 0.01。图S6: rp -概要(a)的类黄酮标准和(b)黄酮类化合物在FMF 360海里。峰:1、牡荆素;2、isovitexin;3,isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside;4,narcissin。