文摘

Luteolin-6-C-neohesperidoside (LN)是一种从毛竹竹叶黄酮分离。这项研究进行了评估的疲劳效应LN在鼠模型进行重量强迫游泳试验(置)。简而言之,男性Sprague-Dawley老鼠(20 - 22周)被迫进行详尽的游泳每隔一天3周。每个游泳会话之后,管理的蒸馏水,LN(25 - 75毫克/公斤),或抗坏血酸(100毫克/公斤)1 h。口服LN显著提高运动耐力;归一化改变能量代谢标记;和减少血清乳酸、乳酸脱氢酶和血尿素氮水平进行了置的老鼠。此外,LN增强抗氧化酶和抗氧化剂的活动能力,以酶活性测定,rt - pcr和免疫印迹以及减少促炎细胞因子的水平,如肿瘤坏死因子-α,interleukin-1β(il - 1β),il - 6和增加抗炎的水平(il - 10)在肝脏和骨骼肌。这些结果表明,LN减少了慢性疲劳的生理和心理影响,可能通过衰减氧化应激损伤和炎症反应在肝脏和骨骼肌。因此本研究支持使用LN抗疲劳和抗氧化作用的功能食品。

1。介绍

慢性疲劳的特点是持续疲劳,不放心休息,总是由生理或心理活动恶化[1]。身体疲劳是由于过度的锻炼,和长期积累的生理疲劳会导致一系列的与疲劳相关的症状,包括认知问题、神经认知功能障碍,睡眠障碍,胃肠道症状,postexertional不适(2]。全世界大约10%的普通人群患有慢性疲劳,有重大不利影响工作能力和日常生活的质量3,4]。尽管这种情况的患病率,疲劳的病因尚未完全阐明。针对正在进行的研究慢性疲劳,这是强调疲劳与能量代谢有关的发病机制和免疫和内分泌系统,以及炎症反应和抗氧化防御系统的功能障碍(5- - - - - -7]。在这些潜在因素中,氧化应激在疲劳的病因中扮演最重要的角色。增加氧化应激增强分泌增加和活性氧(ROS),以及脂质过氧化反应,可以观察到在人类患有慢性疲劳综合症(8,9]。同时,氧化应激是显示刺激炎症反应通过增加促炎细胞因子的释放,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、白细胞介素- 6 (il - 6)和il - 1β慢性疲劳患者(10]。

因此,抗氧化治疗可能是最有价值的治疗方法之一,疲劳,虽然很少有有效的药物药物或疗法,可以成功地消除病人疲劳(11]。因此,重要的是要找到天然化合物与抗氧化活动和/或开发安全有效的抗疲劳功能食品,提高运动能力,推迟疲劳,加速疲劳的消除患者(12,13]。以前的研究报道,植物化学物质,如抗氧化剂吸收从茶、水果和药用植物不仅可以减少自由基形成和清除自由基,还拥有相当大的抗疲劳活性(14]。从植物中黄酮类化合物被认为是其中一个最有效的植物化学物质组由于其广泛的药理活性,如抗氧化、抗炎、免疫调节、治疗糖尿病药和抗肿瘤效果15- - - - - -18]。黄酮类化合物也被广泛研究作为一个新的群自然抗疲劳物质;许多研究表明,类黄酮补充提高耐力运动疲劳大鼠通过减少肌肉疲劳的性能(19,20.]。

毛竹竹(撂荒简历。下毛竹),属于家庭禾本科,其中最具代表性的经济重要的竹资源。广泛分布在中国的热带和亚热带,具有显著的经济和文化价值通过其用于纸张、食物和中药(21,22]。在民间医学,竹叶被用来治疗许多疾病通过直接医疗和营养的间接影响。竹叶富含多糖、氨基酸、生物碱、多酚、天然抗氧化剂类黄酮,如orientin isoorientin,牡荆素,isovitexin [23,24]。近年来,研究也发现,这些从竹叶黄酮有良好的生物活性,如抗氧化、防衰老、抗炎、抗菌、antihyperlipidemia,[免疫调节作用25,26]。在我们之前的研究中,一个黄酮醇糖苷,5、7、3′,4′-tetrahydroxy-6-C-neohesperidose黄酮醇糖苷(luteolin-6-C-neohesperidoside LN),如图1,从毛竹分离竹叶透露有强壮的收紧和清除DPPH自由基的能力(数据没有显示)。为进一步研究其药理作用,本研究进行了评估LN对氧化应激损伤的保护作用引起的器官的重量(置)在大鼠强迫游泳测试。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

新鲜的叶子毛竹竹从临安,浙江省,并被卢缓卢教授身份验证,浙江农业和林业大学植物分类学教授。样本干60°C 24 h,然后地面和通过40-mesh筛。所有包都由建成生物技术。科学。有限公司,南京,中国。所有其他化学试剂均为分析纯,从化学试剂国药控股有限公司(上海,中国)。

2.2。LN的隔离

从毛竹竹叶LN是孤立的。短暂,约15公斤的干叶子粉是在15 L冷75%乙醇浸泡24小时,然后在室温下提取。上层清液集中在旋转蒸发器(RV8;德国IKA)减压在45°C。上述过程重复两次,回收乙醇(reprepare浓度)。这时,一个相残留物获得(产量1.25公斤),这是分散到H₂O (5 L)与剧烈搅拌,然后连续提取石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的5倍(2.0 L /时间)。这些提取集中产生石油醚部分(56克),乙酸乙酯部分(163克),正丁醇部分(365克)和水比例(246克)。

正丁醇分数(365克)受到了柱层析法对Diaion HP-20(10×130厘米)和连续筛选了H₂O-MeOH解决方案。40%甲醇的分数都收集在一起,然后被在CHP-20 MCI凝胶柱层析法,交联葡聚糖LH-20,硅胶,与MeOH-H洗脱₂求梯度的解决方案。最后,我们得到了13.2 g LN从40%甲醇溶液和冻干成粉进行进一步分析。LN的收益率是0.088%,它的纯粹是98.16%。

2.3。动物

男性Sprague-Dawley老鼠(重180 - 220克;20 - 22个月大)购自浙江医学科学院实验动物中心(数量的动物许可证:SCXK(浙江)2016 - 0613]。老鼠笼在特定无菌设施在一个控制环境(恒温(25±2°C)、湿度(45% - -55%),和一个常数的黑暗/光周期12:12 h)与随意提供食物和水。所有程序批准的处理和实验动物机构浙江中医药大学动物委员会和所有老鼠收到护理在整个实验过程中按照指南的护理和使用实验动物(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.4。实验设计

驯化后的一个星期,所有的动物被随机分为六组(每组10大鼠)如下:正常对照组(NC),模型对照组(MC)、阳性对照组(抗坏血酸,100毫克/公斤,AA100),和LN-treated组(高,75毫克/公斤,LN75;中,50毫克/公斤,LN50;和低,25毫克/公斤,LN25)。LN和抗坏血酸的剂量决定根据我们初步测试(数据未显示)和先前的研究27]。LN和抗坏血酸溶解在蒸馏水和口头管理一旦每天3周,1 h之前强迫跑步机锻炼。数控和MC管理同样体积的蒸馏水口服药。

2.5。重量强迫游泳测试(置)

浮置板轨道进行的重量与一些小的修改(如前所述28]。LN-administered和MC组的老鼠受到置每隔一天同时支持恒定负载(固定尾巴基地)对应于5%的体重在一段时间内三个星期。置在游泳进行坦克(50×50×40厘米)30厘米深的水保持在25±2°C 1 h口服后相应的药物。然后老鼠从池中移除,用纸巾干,回到原来的笼子里。每个会话后池的水代替。疲惫是由观察失败损失的协调运动和游泳。耐力时间记录老鼠完全耗尽时,未能立即返回到水面呼吸5 s。动物牺牲下轻微麻醉后立即过去的运动。从腹主动脉血收集到离心管使用肝素化注射器。分离血浆和肝脏和骨骼肌组织样本存储在−80°C,直到进一步的分析。

2.6。组织学分析肝脏和骨骼肌

组织学部分(4μ米厚度)准备从肝脏和骨骼肌固定在10%缓冲甲醛,然后嵌入石蜡。组织学部分沾hematoxylin-eosin;使用光学显微镜观察染色区域在100 x放大。

2.7。生化检查血清和组织

血清从血液样本中获得,在血清生化参数包括血尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)、血浆乳酸(LA)、肝糖原(LG)骨骼肌糖原(毫克)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)测定分光光度检测方法使用商用设备(建成生物技术。科学。有限公司、南京、中国)。这些参数的水平测定按照制造商的协议。

骨骼肌和肝脏组织均质检查oxidant-related参数,如活性氧(ROS),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)和炎症相关的参数,包括il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 10。上述生化参数的水平用ELISA试剂盒检测骨骼肌和肝脏(建成生物技术。科学。Inc .)。

2.8。半定量rt - pcr分析Nrf2 HO-1信使rna

总rna从肝脏和骨骼肌组织分离,分别与试剂盒试剂(Sangon生物技术有限公司、上海、中国)。核因子E2-related因子2的信使rna (Nrf2)和血红素oxygenase-1 (HO-1)是由半定量rt - pcr分析和规范化β肌动蛋白。简单地说,1μ克总RNA reverse-transcribed使用低聚糖dT和逆转录酶(博雅有限公司、上海、中国)。然后,互补Nrf2和HO-1放大使用寡核苷酸引物(表1通过一步法rt - pcr工具包(豆类有限公司、日本)。以下应用PCR条件:Nrf2 HO-1, 35周期95°C的变性15和退火60°C 15年代在72°C扩展1分钟,和β肌动蛋白,25个周期94°C的变性30年代和退火30年代60°C扩展30年代的72°C。PCR产品受到水平在0.8%琼脂糖凝胶电泳,和图像捕获在一个Bio-Rad ChemiDoc成像系统(美国大力神,CA)。

2.9。免疫印迹分析Nrf2 HO-1在肝脏和骨骼肌

肝脏和骨骼肌,分别在里帕均质裂解缓冲和离心机14000 rpm(30分钟、4°C)获得总蛋白。然后,浮在表面的蛋白提取物浓度的测定采用BCA蛋白质分析工具包(Aidlab生物技术有限公司、北京、中国)。免疫印迹分析,等量的蛋白质(50μg每车道)加载井的12%聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳运行后,被electrotransferred到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔,马尔伯勒,MA)。3 h的膜是孵化阻断缓冲区(渐变20 1×TBS, 0.1%, 4%脱脂奶)在室温下,然后一夜之间在同一个缓冲区包含主要抗体Nrf2 (1: 1000), HO-1 (1: 1000)β肌动蛋白(1:1500)(武汉博士德生物技术有限公司,中国)。膜被三次5分钟和孵化2 h在4°C HRP-conjugated二级抗体(anti-rabbit和anti-rat)(武汉博士德生物技术有限公司,中国)。蛋白质检测使用一个增强化学发光检测系统(Amersham法玛西亚,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。

2.10。统计分析

所有数据都表示为均值±标准差的至少三个独立的实验。组之间的显著差异决定使用单向方差分析。图基的HSDt以及用于多重比较。所有使用IBM SPSS统计分析软件,版本。20.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。被认为在统计意义。

3所示。结果

3.1。LN对提高游泳能力的影响

补充AA100和LN 3周后,老鼠的游泳能力相比增加与MC组(图2)。显著剂量依赖性增加观察组LN(75毫克/公斤,;50岁和25毫克/公斤,)。图2 (b)表明耗尽游泳时间的增加比率每个治疗组(LN75、LN50 LN25)后LN政府为123.34%,90.65%,和67.68%,分别。图2(一个)表明,游泳时间组LN75疲惫,LN50, LN25 28.6±2.1, 24.8±1.9, 21.6±1.2分钟,分别长比(12.9±1.2分钟)MC老鼠置的最后一天。

3.2。LN对血清生化指标的影响

洛杉矶的血清水平、LDH和面包的研究团体如表所示2。慢性强迫运动组表现出显著增加水平拉()和LDH (),相对于那些NC组血清。这些效应明显减弱后LN治疗(75年和50毫克/公斤,25毫克/公斤啦;75毫克/公斤LDH,50岁和25毫克/公斤LDH,相对于那些模型对照组;表2)。的发髻MC组显著增加1.8倍的价格相比数控组。然而,LN干预阻止了包子的释放水平剂量依赖性的方式()。此外,没有明显的包之间的水平差异NC组和LN75集团()。

3.3。LN对糖原含量的影响肝脏和骨骼肌

LN的影响肝脏和骨骼肌糖原含量如表所示2。与那些MC组相比,LG和MG的水平显著增加在LN管理组()。特别是,在高剂量的管理LN(75毫克/公斤),肝糖原和肌糖原增加2倍和1.5倍与MC组相比,分别。

3.4。LN在ALT和AST的影响

在目前的研究中,我们确定的水平在所有大鼠的血清ALT和AST。如表所示2置曝光,导致血清中ALT和AST水平的增加与NC组。所有的这些影响都被政府LN (75毫克/公斤ALT,50岁和25毫克/公斤ALT;75年和50毫克/公斤AST,25毫克/公斤AST,相对于对照组)。

3.5。LN对肝脏和骨骼肌病理学的影响

肝脏和骨骼肌的表象在老鼠的组织学分析如图所示3。肝脏和骨骼肌的细胞形态学NC组保持正常,尽管所有运动组样本透露了一些异常,如充血和水肿和炎症细胞肝脏和骨骼肌的活动。此外,大量的无序平滑肌细胞和越来越多的泡沫细胞也可以观察到。与模型组相比,肝脏和骨骼肌细胞的肿胀和炎症细胞浸润的程度显著降低在LN-treated AA100集团组织和剂量依赖性的方式。

3.6。LN对Oxidant-Related参数的水平的影响在肝脏和骨骼肌

如图4与NC组相比,活性氧的水平和肝脏MDA显著增加()和骨骼肌()和SOD和氧化酶的活动均显著地减少两个器官组织(在MC组。相比之下,详尽的运动性ROS、MDA水平较高和较低的抗氧化酶的活动在肝脏和骨骼肌明显减毒LN补充与MC组(75毫克/公斤;50和25毫克/公斤)。

3.7。LN对肝脏和骨骼肌的细胞因子水平

肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,MC组的il - 6与NC组相比均有显著增加(所有在肝脏和骨骼肌),而il - 10的产量大幅减少这两个器官()。LN管理显著改善肿瘤坏死因子水平的变化α,il - 1β、il - 6和il - 10在剂量依赖性的方式接近基线(图5)。类似的对炎性细胞因子水平的影响出现在回应抗坏血酸。

3.8。LN对HO-1的表达的影响和Nrf2肝脏和骨骼肌

HO-1 mRNA的表达和Nrf2 mRNA很难发现在肝脏和骨骼肌的MC集团虽然显著增加组由LN ()(图6)。此外,LN的监管影响被发现增加浓度的方式。此外,HO-1的蛋白表达水平和Nrf2肝脏和骨骼肌的MC组通常是减少与NC组()(图7)。LN治疗后,这些蛋白质的表达显著增加肝脏和骨骼肌相比,在MC集团(75毫克/公斤在肝脏50毫克/公斤;75毫克/公斤和50毫克/公斤,骨骼肌的25毫克/公斤)。

4所示。讨论

现代社会生活在高速度,会导致压力增加,已被确定为一个因素慢性身心疲劳(29日]。根据传统中医,慢性疲劳是由于气(循环能源)和血液疾病,可引起肝脏的功能障碍,脾脏和肾脏。LN是一个从毛竹竹叶黄酮醇糖苷孤立,和类黄酮是一种强有力的抗氧化剂用于治疗各种疾病与疲劳有关,如高血压、冠心病、肿瘤、炎症、糖尿病,以及[30.,31日]。在这里,我们调查了LN抗疲劳的活动通过评估肌肉和肝脏功能活动,分析表型和分子反应治疗LN浮置板轨道的第一次的实验模型。

置代表一个有效的动物模型筛选各种生物活性化合物抗疲劳的能力(32]。游泳疲劳会导致身体和精神疲劳,和游泳的时间疲惫表明疲劳的程度(33]。一个进步的运动耐力是最有力的表现形式,抗疲劳的效果。在这项研究中,进行了为期三周的游泳大鼠模型。结果表明,LN治疗老鼠的耗尽时间延长,表明LN具有抗疲劳效果(图2)。

糖原是一种次要的长期能源存储,这是有关身体的耐力能力(34]。它作为一个能源储备,可以迅速动员以满足突然需要在运动时血糖和维持血糖水平在生理范围内(35]。研究表明,糖原的重要消费在肝脏和骨骼肌在力竭运动负责高架疲劳(36]。因此,消耗糖原内容是疲劳发展的不可或缺的因素。在我们的研究中,LG和MG的水平增加LN-treated组相比,那些MC组(表2)。这种效应可能成为有利的在改善身体疲劳和长时间的练习。

简单的物理运动始于有氧肌肉活动的增加,而密集的运动导致切换到厌氧代谢,导致转换LDH拉(37]。洛杉矶是一个常见的标志骨骼肌疲劳,和多余的LA抑制收缩活动以及糖酵解在肌肉组织(38]。与生产,血清LDH的变化相似,乳酸生产所需的一种关键酶,被测试显示。增加的LDH水平被认为是细胞坏死和组织损伤的迹象(39]。包子是能量代谢的副产品,代表正常的肾功能,许多因素如疲劳和压力可以改变包的水平。有面包和运动公差之间的正相关关系。换句话说,身体的运动能力越低,更重要的是包子水平增加(40]。因此,血清LA的积累,LDH,面包可以说明疲劳发展的速度和程度以及工作负载强度。正如所料,详尽的游泳水平显著提升,LDH,血清和包子,而这些增加显著减毒LN-treated组(表2)。这表明LN会加强身体的锻炼耐力减少能量和蛋白质的新陈代谢。

运动对骨骼肌和肝脏功能有不同影响,加强营养代谢和抗氧化能力。越来越多的证据表明,详尽的锻炼可能会损伤肝细胞通过减少肝脏的血流量(41)和门静脉(42),这常常导致肝细胞缺氧,最终诱导坏死。艰苦的体育锻炼会导致增加活性氧的生产,促进血管扩张,增加血流量和氧和葡萄糖的供应工作骨骼肌(43]。然而,详尽的运动可能影响骨骼肌的细胞功能影响其完整性,因此被认为是负责在锻炼肌肉疲劳。与那些MC组相比,肝脏和骨骼肌细胞的肿胀和炎症细胞浸润的程度显著降低LN-treated组(图3)。同时,剧烈的体育锻炼会导致肝细胞的收缩,和肝脏的体积变化与这不仅与肝脏糖原水平下降,而且肝脏功能障碍(44]。因此,海拔的ALT和AST预测肝细胞损伤和特征反应详尽的体育锻炼45,46]。在这里,我们发现显著增加的血清ALT和AST水平以应对慢性疲劳肝功能异常,在LN减毒治疗组(表2)。

氧化应激包括活性氧的生产之间的不平衡和抗氧化防御系统的能力(即。,抗氧化酶)清除他们(47];它已经涉及到慢性疲劳和与疲劳相关的疾病。在正常情况下,有规律的体育锻炼可以帮助身体功能更好,但详尽的锻炼可能导致体内过量的活性氧,导致膜结构的脂质过氧化反应和氧化损伤细胞在目标组织,如肝脏和骨骼肌(48,49]。MDA是脂质过氧化作用的中间产品,即自由radical-mediated损伤的主要成果之一。详尽的运动可以提高ROS、MDA水平在老鼠和老鼠的肝脏和肌肉50,51]。酶和非酶的抗氧化剂是两个主要的防御系统,努力降低ROS、MDA的有害影响细胞(52]。抗氧化酶SOD和氧化酶等被认为是主成分的酶促抗氧化防御系统来帮助对抗疲劳和保护细胞通过减少活性氧自由基的生成和分解产物的代谢氧化损伤(53]。详尽的运动增加活性氧和MDA明显减毒治疗LN。类似的动力学观察SOD和氧化酶反应weight-forced运动,几乎完全逆转的LN治疗在肝脏和肌肉组织(图4)。因此,我们的结果表明,LN具有有效的抗氧化活性,阻止脂质过氧化和保护细胞免受氧化应激损伤后大鼠的肝脏和骨骼肌的运动。

炎症是一种出现在回应exercise-mediated氧化应激。肿瘤坏死因子-α,il - 1β,三促炎细胞因子il - 6;大大限制的过度释放物理性能的条件下剧烈运动(54- - - - - -56]。这表明细胞因子反应之间的密切联系和氧化剂应激的发病机制和器官功能障碍引起的慢性疲劳(57]。之前的研究表明,肿瘤坏死因子-α,以及il - 1β和il - 6,诱发神经传递素的合成,增加疲劳和疾病在先前健康受试者58,59]。il - 10是一种抗炎细胞因子,会调节TNF -的活性α,il - 1β,il - 6和作为身体的防御能力的标志在炎症反应60]。在这里,我们发现显著的促炎细胞因子(TNF -的水平α,il - 1β和il - 6)在大鼠肝脏和骨骼肌力竭运动后,在LN减毒治疗组(数字5(一个),5 (b),5 (c))。同样,il - 10,抗炎细胞因子的表达下调MC组;这种效应也改善LN治疗(图5 (d))。这表明保护LN对肝脏和骨骼肌的影响反映在上面详细介绍的病理变化可能导致其抗炎活性。

澄清LN的分子机制参与了疲劳和与疲劳相关的器官功能障碍引起的运动,我们评估氧化应激相关信号的表达基因在肝脏和骨骼肌组织。越来越多的证据建立了详尽的运动可以引起疲劳和与疲劳相关的器官的氧化损伤。血红素oxygenase-1 (HO-1),诱导和病原反应酶,似乎催化血红素降解的一氧化碳和胆绿素,它随后被转化为胆红素(一种强大的抗氧化剂),胆绿素还原酶(61年]。研究表明,HO-1激活有助于抑制肿瘤坏死因子-等促炎细胞因子的产生α,il - 1β,il - 6在病理生理条件下(62年- - - - - -65年),它已成为一个关键分子调控炎症反应和氧化应激在各种各样的疾病,如慢性疲劳综合症、糖尿病、肝炎、癌症(66年]。此外,HO-1是第二阶段解毒酶抗氧化反应引起的元素——(是)介导的基因转录因子及其表达式是调制,核转录因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)。Nrf2通常存在于细胞质和结合kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1)作为redox-sensitive主监管转录因子。然而,当细胞内氧化应激发生时,Nrf2 Keap1分离,然后结合在二期抗氧化酶基因的启动子(销售税,HO-1),从而控制其表达式(67年]。换句话说,Nrf2诱导抗氧化酶的表达如HO-1被绑定在这些基因的启动子68年]。因此,Nrf2 /途径被认为是氧化应激疾病的治疗的一个重要目标。在我们的研究中,rt - pcr和免疫印迹分析进行确定LN增强HO-1和Nrf2表达式。我们发现,详尽的游泳导致HO-1和Nrf2水平显著减少,LN治疗规范化的数据6和7)。因此,LN治疗可以提高核Nrf2和HO-1在肝脏和骨骼肌蛋白表达。这些发现表明,Nrf2 /通路是一个潜在的分子机制LN的治疗效果,还需要进一步研究探索的可能性,作为预防治疗干预主要器官功能障碍引起的详尽的锻炼。

5。结论

在这里,所有的结果表明,LN管理可以显著提高大鼠的耐力置。此外,LN明显阻止肝脏和骨骼肌的功能障碍引起的氧化应激通过调节炎症和氧化反应。负责LN抗疲劳的作用的潜在机制主要包括氧化应激和炎症的调制通过激活Nrf2 /通路。这些结果表明,LN有利于身体健康因其抗疲劳活性,为天然产物的进一步发展提供了科学证据的预防和治疗疾病与疲劳有关。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

所有的作者都批准了最后一篇文章。

确认

这个项目是由中国国家自然科学基金(批准号81503206)。