文摘
尽管aspalatone(乙酰水杨酸麦芽酚酯)被认为是一种抗凝剂与抗氧化和抗血小板潜力;它的效力在防止内皮功能障碍是未知的。在这项研究中,我们检测了抗血管增生,抗氧化,抗炎效果的aspalatone人类主动脉内皮细胞(HAECs)。具体来说,aspalatone对VEGF-induced HAECs增长,移民,管形成和脂质水平peroxidation-derived丙二醛(MDA)检查。我们的结果表明,治疗HAECs aspalatone VEGF-induced细胞迁移,减少管形成,和MDA水平。Aspalatone也抑制VEGF-induced减少的表达以挪士和伊诺的表达增加,ICAM-1, VCAM-1。Aspalatone也阻止了VEGF-induced单核细胞与内皮细胞的粘附。此外,aspalatone还阻止VEGF-induced释放炎症标记物,如Angiopoietin-2瘦素,EGF, g - csf, HAECs HB-EGF, HGF。因此,我们的研究结果表明,aspalatone可以用来防止内皮功能障碍、心血管疾病的病理生理学的重要过程。
1。介绍
内皮细胞形成新的血管发挥重要作用在心血管疾病(CVD)的病理生理学1]。虽然,正常内皮细胞功能是参与各种生理过程,如血管生成,胚胎发育、伤口愈合、和组织重构,内皮功能异常可能导致增加血管并发症,肿瘤生长和转移2- - - - - -4]。等因素中断正常内皮细胞功能损伤,脂质入渗,氧化应激和炎症反应可能导致内皮功能障碍(5,6]。一些研究也表明,广泛的血管内皮激活,障碍,和破坏导致多器官功能衰竭在严重的细菌感染和脓毒症(7]。此外,导致血管内皮功能是参与肿瘤的发展、生存、入侵和转移(3,8]。几项研究表明血管内皮的意义在不同疾病病理和识别几个代理,可以防止内皮功能障碍作为潜在代理控制心血管疾病(2,4,6,9]。
在病理条件下,增加氧化应激产生活性氧(ROS)通过NAPDH氧化酶/线粒体途径。ROS增加导致脂质过氧化反应并释放有毒的脂质形成醛丙二醛(MDA)和4-hydroxynonenal等。脂肪醛可以作为辅助信号中间体来改变信号通路负责细胞平衡导致内皮细胞表型的变化,增加促炎基因表达,组织损伤,内皮功能障碍(10- - - - - -13]。增加FGF表达,VEGF在氧化应激诱导内皮功能障碍(14- - - - - -17]。除了CVD, VEGF也被证明是参与了子痫前期患者的内皮功能障碍和慢性肾脏疾病(18,19]。几个VEGF抑制剂已经被合成和测试作为潜在心血管疾病药物。然而,一些VEGF抑制剂已被证明导致增加内皮细胞毒性等副作用,诱发血栓形成和高血压(20.- - - - - -23]。除了几个合成抗vegf药物,一些报告还表明,大量使用各种抗氧化剂预防的内皮功能障碍(24,25]。抗氧化剂如姜黄素、槲皮素、白藜芦醇和防治作用已被证明,以防止内皮功能障碍临床前研究(24,26- - - - - -29日]。虽然,这些抗氧化剂已经为心血管疾病的治疗的临床试验,他们不是那么有效在实验动物30.,31日]。因此,选择抗氧化治疗方案需要控制内皮功能障碍。
阿司匹林(乙酰水杨酸)是一个前线解热、抗炎剂与强有力的抗血栓形成的活动,拯救数百万人的生命在心血管疾病患者32,33]。除了CVD,阿司匹林也已被证明能够降低肿瘤生长和转移的速度和改善患者的总体生存率(34- - - - - -36]。此外,阿司匹林已被证明是有效地抑制各种炎性细胞因子的释放负责心血管疾病(37,38]。然而,如胃肠道副作用侮辱已报告更高的剂量阿司匹林使用(39]。即使短期内政府,阿司匹林报道表现出胃和十二指肠粘膜损伤(40]。因此,为了克服这些问题,不同配方的抗血栓形成的药物具有相似的治疗潜力,但较小的副作用已经开发出来。
Aspalatone是一种强有力的抗氧化剂的酯化合成乙酰水杨酸(阿司匹林)、麦芽酚(41- - - - - -43]。阿司匹林相比,aspalatone已经显示了微不足道的胃肠道损伤和具有强大的抗血栓形成的活动(41,44,45]。Aspalatone还能抑制胶原诱导血小板聚集在体外和体内(IC50= 180μ米)(45]。然而,aspalatone阻止内皮功能障碍的影响尚不清楚。在目前的研究中,我们审查的影响aspalatone VEGF-induced内皮细胞生长、迁移、管形成,单核细胞粘附。我们的研究结果表明,aspalatone防止VEGF-induced内皮细胞功能障碍,防止VEGF-induced增加脂质过氧化反应,炎症和粘连制造商表达式,伊诺和VCAM-1表达和降低以挪士的水平。因此,我们的研究结果表明,aspalatone,小说的导数阿司匹林,可以用于内皮功能障碍及其相关并发症的预防。
2。材料和方法
2.1。材料
Aspalatone从开曼化学公司购买。内皮细胞培养基(ECM)是获得ScienCell™研究实验室。PBS、青霉素、链霉素溶液和胰蛋白酶/ EDTA表达载体。从双子座的边后卫获得生物制品。麻省理工是来自σ。里帕缓冲区从圣克鲁斯生物技术获得。血管内皮生长因子(vegf - 165)和抗体VCAM-1, ICAM-1,以挪士,GAPDH从细胞信号的技术。从Abcam抗体间接宾语了。CM-H2DCFDA从分子探针,表达载体。丙二醛(MDA)检测设备是来自Oxis研究。人类Milliplex血管生成细胞因子多路复用设备从微孔中获得。使用的所有其他试剂和化学物质均为分析纯,从σ。
2.2。细胞培养
主要人类主动脉内皮细胞(HAECs)获得ScienCell™研究实验室,在完整的内皮细胞生长介质(ECM)补充与血管内皮生长因子与青霉素、链霉素的边后卫5%和1%。所有的细胞都维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。
2.3。测量细胞毒性
HAECs(3000细胞/)与0.1%血清含有不同浓度的aspalatone growth-arrested (25 - 200μ米)没有或VEGF (10 ng / mL)。24小时后,MTT比色细胞生存能力分析。
2.4。细胞迁移试验
HAECs被播种在12-well盘子和允许形成一个支流单层。细胞在一夜之间被growth-arrested包含媒体在0.1%的边后卫。单层的纵向中心统一抓了10μL无菌吸管提示仔细,单层与血清媒体洗3 x。HAEC媒体有0.1%的边后卫和VEGF (10 ng / mL)包含车辆或aspalatone (50μ米)被添加到井中。井被拍到在0 h和18 h。细胞迁移的变化百分比计算公式(−)/。
2.5。在体外形成毛细管测定
HAEC管形成试验是由使用EMD微孔后的体外血管生成工具制造商的指示。简单地说,50μL稀释ECM矩阵的解决方案是添加到每个的96孔板和孵化37°C允许矩阵巩固。增长HAECs被捕收获,然后播种仔细而不打扰凝固在1×10矩阵4细胞/没有和aspalatone (10μ米,20μ50米,μ米,100μ米)和孵化额外18 h。照片拍摄和毛细管网的长度是估计的数量如前所述46,47]。
2.6。Monocyte-Adhesion化验
体外单核细胞粘附试验进行了如前所述[46]。简而言之,HAECs被播种在96 -孔板的密度3000细胞/好,subconfluent aspalatone (50μ米)。孵化后,细胞无血清培养系统冲洗了媒体和THP-1细胞中添加的比例1:3 (HAEC: THP-1)没有或aspalatone和VEGF (10 ng / mL)另一个18 h。结束时潜伏期井清洗和100μL媒体包含MTT添加和孵化3 h。甲瓒晶体被添加DMSO溶液溶解使用板和吸光度被记录在570 nm的读者。
2.7。测量在HAECs活性氧积累
细胞内活性氧积累使用CM-H通过流式细胞仪测定2DCFDA。CM-H2DCFDA chloromethyl导数的H2DCFDA用于测量活性氧(ROS)的细胞。分析ROS水平,细胞治疗18 h和VEGF (10 ng / mL)没有或aspalatone (50μ米)。潜伏期后,与CM-H细胞被染色2DCFDA 5分钟,收获,并立即分析流式细胞分析仪(BD LSRII Fortessa)。数据分析使用流乔(美国Treestar、亚什兰或)和表示为褶皱的变化意味着荧光强度(MFI)相比,控制。
2.8。HAECs MDA含量的分析
脂质过氧化指标、MDA水平以HAECs从Oxis国际有限公司,通过使用一个工具制造商的指示。简单,细胞治疗了18 h和VEGF (10 ng / mL)没有或aspalatone (50μ米)。这些细胞被洗PBS 2 x和细胞溶解在PBS声波降解法。细胞碎片在3000×g被离心10分钟4°C。上层清液是用于分析和吸光度的指令使用板读者被记录在586海里。MDA含量(总μ米)计算基于蛋白质含量的标准曲线和规范化。
2.9。分析HAECs炎性细胞因子分泌的
分析各种细胞因子分泌VEGF在处理HAECs (10 ng / mL)缺失或aspalatone (50μ米和100μ分析了M)使用人工血管生成/生长因子后磁珠从微孔板工具制造商的指示。简单,文化媒体收集,由冻干浓缩,孵化与标签的磁珠。隔夜孵化后,珠与Streptavidin-Phycoerythrin复染色,分析Luminex™分析器从微孔。结果表示为pg / mL根据标准曲线生成的标准。
2.10。免疫印迹分析
等量的细胞溶解产物(40μg)加载和分离12% SDS-polyacrylamide凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜被屏蔽5%脱脂奶粉和孵化的具体主要抗体在4°C隔夜其次是孵化与特定的二级抗体。西方Immunolabeling检测使用SuperSignal™Pico化学发光底物(ECL)热科学遵循制造商的指示。细胞膜被恢复™+剥离缓冲与热科学根据制造商的指示与其他抗体或GAPDH reprobing。
2.11。统计分析
数据意味着±SD和值是由使用一个未配对的学生的决定t以及从微软Office Excel 2007软件。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Aspalatone对HAECs生存能力的影响
在VEGF-induced aspalatone细胞生存能力的影响是未知的;因此,我们首先检查HAECs aspalatone对生存能力的影响。如图1、治疗的细胞与aspalatone本身并没有引起任何显著增加细胞生长或死亡时用aspalatone浓度在25岁,50岁,100年和200年μm .然而,治疗HAECs VEGF增加细胞生长和增加预防aspalatone的预处理。因此,我们的研究结果表明,单独aspalatone HAEC生存能力但没有任何明显的影响减少VEGF-induced增加细胞生长。
3.2。Aspalatone对VEGF的影响,诱导HAECs迁移和管形成
我们下一个检查的有效性aspalatone预防VEGF-induced细胞迁移。伤口愈合体外测定了细胞内VEGF在没有和aspalatone的存在。结果如图2(一个)和2 (b)表明,VEGF HAECs迁移引起的,所观察到的伤口的完全关闭;然而,预处理aspalatone阻止HAECs VEGF-induced迁移。自从迁移新血管形成的细胞是重要的一步,我们接下来检查aspalatone对体外VEGF-induced管形成的影响,确定体外血管生成的标准方法。HAECs被播种在96孔板涂以ECM凝胶矩阵的解决方案。ECM矩阵含有生长因子的混合物,包括最大的VEGF诱导的内皮细胞管形成。如数据所示3(一个)和3 (b)控制细胞相比,aspalatone治疗细胞显示显著减少毛细血管的形成像结构剂量依赖性的方式。细胞治疗与50μ米和100μM aspalatone显著防止管内皮细胞的形成,表明aspalatone可以防止新生血管形成。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.3。Aspalatone对VEGF-Induced内皮功能障碍的影响
单核细胞与内皮细胞粘附以来被认为是一个初始事件的血管疾病,我们接下来检查效果aspalatone VEGF-induced HAECs单核细胞粘附。如图4(一),VEGF导致显著增加单核细胞粘附的HAECs和在aspalatone单核细胞的粘附HAECs显著下降。自增加粘附分子的表达,如ICAM-1和VCAM-1已被证明是负责单核细胞粘附,我们下一个检查的影响aspalatone HAECs VEGF-induced粘附分子的表达。如图4 (b),VEGF诱导的表达VCAM-1 ICAM-1 HAECs和细胞治疗aspalatone + VEGF的表达VCAM-1但不是ICAM-1显著下降。然而,当控制相比,aspalatone独自没有在HAECs增加这些粘附分子的表达。因此,这些结果表明,aspalatone防止VEGF-induced单核细胞粘附,防止粘附分子的表达。我们下一个检查aspalatone的影响以挪士和伊诺内皮细胞的表达。图中所示的数据4 (b)表明,VEGF的表达减少,引起以挪士在伊诺的表达,增加HAECs和aspalatone显著逆转VEGF-induced表达的变化以挪士和伊诺表明aspalatone防止VEGF-induced内皮功能障碍。检查如果aspalatone不仅局限于VEGF的影响还要其他氧化剂,我们下一个治疗HAECs与脂多糖(LPS, 1μg / mL)的存在和没有50μ米aspalatone和检查以挪士的表达,进气阀打开,VCAM-1, ICAM-1。如图4 (c),aspalatone也阻止LPS-induced VCAM-1的表达,增加HAECs ICAM-1,进气阀打开。此外,aspalatone也恢复了LPS-induced减少以挪士的水平。因此,我们的研究结果表明,aspalatone可以防止氧化应激内皮功能障碍。
(一)
(b)
(c)
3.4。Aspalatone对VEGF-Induced炎症标记物的表达的影响
因为众所周知,增加各种细胞因子和生长因子的表达HAECs负责内皮功能障碍,我们下一个检查的影响aspalatone VEGF-induced表达各种炎症标记物在HAECs通过微孔多路复用ELISA数组。结果如图5表明Angiopoietin-2的表达显著增加,EGF, Follistatin,瘦素,g - csf, HB-EGF, HGF,和引发在VEGF-treated HAEC文化媒体,和aspalatone显著降低VEGF-induced释放炎性细胞因子和生长因子的培养基。这些结果表明,aspalatone通过防止各种炎症标记物的表达可以防止VEGF-induced内皮功能障碍和管的形成。
3.5。Aspalatone对VEGF-Induced ROS形成和脂质过氧化作用的影响
氧化应激的主要原因是VEGF-induced内皮功能障碍和生长因子是众所周知的施加通过增加氧化应激的影响。因此,我们下一个检查aspalatone的影响VEGF-induced HAECs代ROS和脂质过氧化作用。我们的结果如图6(一)和6 (b)指示一个约2倍增加细胞内ROS的生成与VEGF治疗。活性氧的增加生产HAECs被aspalatone显著预防。Aspalatone独自没有造成任何重大的变化与未经处理的控制细胞ROS水平和相当。因为在氧化应激和脂质过氧化作用是一个重要的事件作为一个指示器的氧化应激增加,我们下一个检查aspalatone的影响VEGF-induced丙二醛(MDA),脂质过氧化作用的标志。MDA水平HAECs对待VEGF在没有或存在aspalatone MDA测定试验装备。我们的结果显示在图7表明一个大约1.3倍增加VEGF-treated MDA水平细胞的形成,这增加显著预防aspalatone表明aspalatone防止VEGF-induced HAECs氧化应激。
(一)
(b)
4所示。讨论
尽管大量证据显示抗炎、抗癌和抗氧化活动的阿司匹林(48- - - - - -51),我们所知,我们不知道有任何研究记录aspalatone恢复增长因素内皮功能障碍。在这项研究中,我们提供了证据表明aspalatone,阿司匹林和麦芽糖醇的酯化衍生物,防止VEGF-induced内皮功能障碍。我们的数据表明,aspalatone防止VEGF-induced活性氧的抗氧化作用,脂质过氧化作用,内皮细胞的各种炎症标记物的表达。因此,我们的数据表明,首次aspalatone防止内皮功能障碍。
内皮细胞发挥重要作用在动脉粥样硬化和其他心血管并发症,包括慢性心脏疾病(1,4,6,9]。内皮功能障碍与心血管疾病的风险增加(6,9]。多项研究表明,氧化stress-generated ROS水平决定不同的细胞过程,如细胞生长、分化、凋亡、DNA损伤、组织损伤(52- - - - - -54]。抗氧化剂也获得相当大的注意力在这方面各种抗氧化剂已报告改善内皮功能通过减少活性氧的形成从而保护内皮细胞完整性和功能(25- - - - - -28]。植物多酚也有报告称,改善内皮细胞功能和血管病理施加有益的影响55]。等生长因子VEGF VEGFR1绑定到其受体VEGFR2和氧化应激介导的激活下游信号通路等激酶p38MAPK, AKT,物,内皮细胞激活(有重要的调控作用56,57]。赵等人已经表明2-glycoprotein-I防止VEGF-induced HAEC增长以及迁移通过调节ERK1/2和AKT的激活58]。进一步,蜀等人表明vasostatin防止内皮细胞生长的差别caspase-3的激活和对这些以挪士在HUVEC细胞(59]。同样,upregulation Notch信号通过激活Rac1 VEGF诱导活性氧的生产依赖NADPH氧化酶在内皮细胞(57,60]。ROS反过来激活各种redox-sensitive转录因子如低氧诱导因子,AP-1, NF -κβ,抄写各种促炎基因调节各种信号通路导致内皮细胞激活和功能障碍(61年,62年]。南汽等抗氧化剂,维生素C,和活性氧抑制剂生产已报告是有效的防止内皮细胞活化在文化和动物模型25- - - - - -29日]。此外,阿司匹林已被证明是一种抗氧化剂和抗炎的行动。阿司匹林可以减少内皮功能障碍,高血压,和心血管并发症(32,33]。它被认为是一个最常用的镇痛药物,赋予重要的防止炎症并发症,包括动脉粥样硬化、糖尿病、癌症和一些形式的(32- - - - - -37]。我们的数据表明,aspalatone抑制VEGF-induced ROS生产HAECs表明VEGF-induced内皮功能障碍可能是通过ROS介导。ROS增加可能导致后续减少内皮一氧化氮(NO)的可用性和减少以挪士的水平。多项研究表明,以挪士水平下降可能导致内皮功能障碍(26,63年,64年]。由于以挪士是一个血管张力的关键调节器和抗血栓形成的过程,因此,我们检查了aspalatone对VEGF的影响——LPS-induced以挪士。我们的研究结果表明,aspalatone恢复VEGF和LPS-depleted以挪士水平表明通过恢复以挪士aspalatone可以改善内皮功能障碍的水平。与我们的数据一致,抗氧化剂如姜黄素已被证明恢复以挪士水平和改善内皮功能障碍在体外和体内24- - - - - -26]。
ROS也诱导脂质过氧化反应和脂质清除作用醛是重要的细胞信号分子,调节各种细胞过程(62年,65年包括内皮细胞激活和单核细胞粘附[66年- - - - - -68年]。多项研究表明,氧化脂质和脂肪醛如4-hydroxynonenal导致内皮功能障碍导致单核细胞粘附发挥重要作用在血管炎症在动脉粥样硬化(16,68年]。单核细胞已被证明是重要的免疫应答和监管机构发挥重要作用在血管生成69年,70年]。此外,多项研究表明,新血管形成是导致动脉粥样硬化斑块进展的主要因素71年]。我们的结果表明,aspalatone阻止VEGF-induced脂质peroxidation-derived醛,丙二醛在HAECs,表明aspalatone防止代脂质过氧化终端产品负责血管并发症。此外,我们的研究也表明aspalatone防止VEGF-induced单核细胞粘附内皮细胞通过减少VEGF-induced VCAM-1和ICAM-1的表情。VEGF可以调节通过调节内皮功能的表达ICAM-1 VCAM-1导致各种血管炎性疾病(72年]。Radisavljevic等人也表明VEGF诱导内皮细胞迁移上调ICAM-1表达式通过PI3K / AKT /不脑微血管内皮细胞(73年]。而被证明VEGF-induced白细胞粘附抑制内皮细胞通过防止粘附分子的表达,比如ICAM-1 VCAM-1, E-selectin [74年]。各种细胞因子,趋化因子,生长因子如白细胞介素(il - 1、il - 6和引发)、肿瘤坏死因子(tnf)、转化生长因子β(TGFβ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)和干扰素已报告扮演重要角色在血管疾病包括动脉粥样硬化(69年,70年,75年]。各种天然抗氧化剂已经被用于减少各种促炎细胞因子和生长因子的释放内皮细胞(30.,76年,77年]。阿司匹林、姜黄素、白藜芦醇和几个黄酮类化合物已被证明控制心血管疾病,因为他们的活动在预防各种炎症标记物的表达(30.- - - - - -33,37,38,76年,77年]。我们的研究结果也表明,aspalatone显著地抑制各种细胞因子和生长因子的释放内皮细胞有或没有VEGF治疗。aspalatone防止VEGF-induced内皮功能障碍可能通过抑制炎性细胞因子的生产以及与VEGF的自分泌和旁分泌串扰的影响。
总之,尽管阿司匹林也被报道通过其抗氧化和消炎,防止心血管疾病等一些常见的副作用胃肠道(GI)侮辱和胃和十二指肠粘膜损伤已报告(39,40]。相反,aspalatone已被证明有微不足道的胃肠道副作用,表现出相似的抗氧化和抗血小板活动阿司匹林(41- - - - - -45]。然而,aspalatone对内皮功能障碍的影响尚不清楚。我们的研究表明,治疗HAECs aspalatone阻塞VEGF-induced内皮功能障碍的恢复以挪士水平和抑制炎症和粘附分子的表达。aspalatone的抑制作用的机理VEGF-induced内皮功能障碍可能涉及aspalatone的抗氧化和抗炎功能,保证这种化合物的治疗发展进一步调查。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。