文摘

客观的。我们调查了假设富含甲烷的盐水(MS)可以用来修复脊髓损伤(SCI)在大鼠模型中通过抑制小胶质激活与氧化有关,炎症和凋亡损伤。方法。女士在SCI后大鼠腹腔注射。Hematoxylin-eosin(他)染色,氧化应激,炎症参数,和细胞凋亡检测72 h SCI后确定最佳剂量。然后,我们调查了保护机制和女士在SCI的长期影响。他和小胶质激活观察。低音部神经功能评估,比蒂,Bresnahan (BBB)规模。结果。女士可以显著减少梗死面积和抑制氧化应激,炎症和细胞凋亡SCI后72 h。保护作用的剂量女士20毫升/公斤是更好的。此外,女士可以显著抑制小胶质激活相关SCI后氧化和炎性损伤和改善后肢神经功能。结论。女士可以修复SCI,减少氧化应激的释放,炎性细胞因子,活化的小胶质细胞产生的细胞凋亡。女士提供了一种新颖的和有前途的SCI的治疗策略。

1。介绍

脊髓损伤(SCI)一直被视为一个主要的问题在医疗领域的高残疾[1]。据统计在美国,SCI的发病率在2012年达到54到3393例/ 100万,和住院死亡率居高不下的价格相比19932]。SCI患者往往伴随着严重的运动障碍,强加给家庭和社会造成沉重的负担。对SCI目前还没有有效的治疗方法。SCI的病理机制是复杂的,涉及多个因素,如氧化应激(3),炎症(4),和细胞凋亡5]。初级创伤SCI可以诱导释放活性氧(ROS)和炎症因子,引起小胶质细胞的激活。小胶质细胞被广泛遍布中枢神经系统(CNS)。他们是特殊的神经胶质细胞与各种不同的重要功能在脊髓由于环境变化。过度激活的小胶质细胞可以释放大量的活性氧和炎性细胞因子,这可能会导致更严重的二次SCI (6,7]。除了释放大量的活性氧和炎性细胞因子,过于活跃的星形胶质细胞可以释放过多的蛋白聚糖和中间丝,导致神经胶质疤痕形成(8,9]。过度激活的小胶质细胞被认为是一个关键因素增加二级SCI和阻碍轴突再生。因此,科学治疗策略不仅要关注的损伤脊柱手术去除机械压缩等因素也需要减少过度激活的小胶质细胞氧化、炎症和凋亡损伤。研究表明,减少炎症、氧化应激、细胞凋亡,尤其是神经元细胞凋亡,可以显著提高SCI的预后10- - - - - -13]。然而,现有药物的疗效,手术,和其他治疗方法在帮助恢复神经功能有限的各种不利影响,因此,更好的治疗策略SCI迫切需要探索。

甲烷是最简单的生物体在自然界和最重要的气体,造成全球变暖14]。氢由人类胃肠道正常菌群可转化为甲烷在小肠15]。甲烷在人体内可以自由穿透细胞膜进入细胞器。然而,甲烷在人体内的生理作用一直被忽视。在他们的生理作用的初步研究甲烷2012年,米德尔斯堡et al。16)报道,甲烷的抗炎和抗氧化效果发挥了重要作用肠道缺血/再灌注损伤(IRI)。你们et al。17]发现甲烷可以抑制炎症和细胞凋亡在肝IRI。吴et al。18)报道,甲烷的抗炎效应对链脲霉素诱导糖尿病性视网膜病变。吴et al。18)发现甲烷可以减弱心肌缺血损伤由于其抗氧化,抗凋亡、抗炎作用。尽管甲烷在某些疾病的治疗效果已初步研究,甲烷对SCI的影响和相关机制尚未报道。在这项研究中,我们试图验证是否腹腔内(i.p)注入富含甲烷的盐水(MS)可以帮助修复SCI在老鼠模型中通过抑制小胶质激活与氧化有关,炎症和凋亡损伤。

2。材料和方法

2.1。动物

女性Sprague-Dawley (SD)大鼠(200 - 220 g)用于本实验提供的第二军医大学实验动物中心。老鼠有免费的食物和水在20°C手术前1 - 2周的时间来适应环境。实验过程都是通过第二军医大学实验动物伦理委员会管理。

2.2。女士生产和检测

饱和女士提供的美国海军航空医学大学说。你们用描述的方法等。17),纯甲烷(> 99.9%)存储在一个油箱(吉祥标准气体有限公司、上海、中国)与0.4 MPa饱和盐水3 h,储存在4°C,刚做好的24小时之前,政府的动物,确保甲烷水平注入。根据计算,0.99更易与女士/ l的浓度。此外,饱和的脱气储存在4°C女士是不可避免的和有效的。甲烷的浓度在正常和SCI大鼠的血检测气相色谱法(气相色谱- 9860,祁阳有限公司,上海,中国)注射后10分钟。根据结果,血液中甲烷浓度没有显著区别健康老鼠和SCI大鼠()(补充图所示可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/2190897)。

2.3。SCI大鼠模型的建立

老鼠被10%水合氯醛麻醉30毫升/公斤,然后固定在卡口老鼠固定器。SCI模型由下降10 g锤自由从25厘米高度暴露在T9-10硬脑膜的层次上,被蔡et al。19]。成功建立科学建模是由脊髓休克的存在所象征的间歇性的老鼠尾巴,后肢的来回摇摆。为了防止感染,青霉素(每天500000单位)管理肌内手术后连续3天。为了帮助排尿,老鼠接受腹部手术后按摩每12 h,直到他们能够自发无效。体重变化是观察在整个实验。老鼠在假针灸组相同的操作由锤没有受伤。大鼠脊髓休克的症状被排除在外。

2.4。实验设计

这个实验分为两个部分。女士在第1部分中,我们测试的影响,确定最佳剂量。50同样雌性SD大鼠随机分为5组():假的,SCI, SCI + 0.5毫升/公斤女士,SCI + 5毫升/公斤女士,女士和SCI + 20毫升/公斤老鼠的虚假和SCI组腹腔注射生理盐水(NS),和老鼠三SCI + MS组收到ip注入0.5,2,和20毫升/公斤女士,分别每12 h。72 h SCI后,老鼠牺牲和受伤的脊髓损伤(6毫米在中心)是收获。获得的样本冷冻迅速进行进一步的研究。在第2部分中,我们研究了女士的保护机制在SCI和长期效应。45同样女性SD大鼠随机分为3组:骗局,SCI, SCI + 20毫升/公斤老鼠女士处理第1部分中描述的一样。SCI模型的成功建立后,老鼠注入i.p。20毫升/公斤或NS每12 h女士第二天。脊髓受伤的SCI后约6毫米收获2周分析后肢性能通过使用低音部,比蒂,Bresnahan (BBB)评分系统。

2.5。科学的组织病理学观察

失败的大鼠建模和死亡被排除在外。SCI 72小时和2周后,大鼠与过量水合氯醛麻醉。与0.01 PBS灌注后10分钟,老鼠和4%多聚甲醛灌注(PFA) 20分钟。蛋白质变性后,叶片被打开了,受伤的上方和下方受损的脊髓段3毫米()是收获。切除脊髓PFA 4 h,固定在4%酒精脱水,石蜡包埋,切成5μ米部分,他最后在显微镜下观察染色。

2.6。检测的疯狂和草皮

老鼠牺牲72个小时后成功的建模和脊髓是收获,在液态氮冷冻()。水平的丙二醛(MDA)在组织作为组织中脂质氧化的程度,而超氧化物歧化酶(SOD)的索引组织抗氧化。脊髓组织(100μg)溶解在1毫升NS在4°C,和上层清液离心收集的2000年15分钟。SOD活性(U / m)和疯狂的浓度测量(nmol /毫克),和脊髓受伤的蛋白质是由使用BCA试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国)根据制造商的指示。

2.7。炎性细胞因子的检测酶联免疫吸附试验(ELISA)

72 h SCI后,脊髓受伤的收获,在液态氮冷冻()。收集到的脊髓组织解冻,称重,并溶解在1毫升NS在4°C,匀浆是由离心收集在2000年15分钟。脊髓上层清液收集,TNF -的内容α,il - 1β,il - 6在上层清液检测严格按照指令的ELISA检测组件(研发系统,明尼阿波利斯,美国)通过使用设备指令(ELx800 BioTek)在450 nm吸光度值。

2.8。免疫印迹

72 h SCI后,脊髓受伤的收获,在液态氮冷冻()。样本的均质细胞溶解产物和离心机,享年14000岁15分钟在4°C。收集上清液,蛋白质浓度由BCA决定。调整后的蛋白质浓度、样例(50毫克)在Laemmli缓冲变性5分钟,装上12% sds - page凝胶。转移后的蛋白质,硝化纤维膜阻止了TBS含有5%脱脂奶粉在室温下2 h,与TBST洗两次,在孵化caspase-3抗体(细胞信号1 # 9662:500),与TBST洗3次,最后孵化与辣根过氧化物酶(合)贴上山羊anti-rabbit二级抗体(杰克逊1:2000)在室温下2 h。膜了,多余的液体被丢弃。PVDF膜包装塑料包装和开发的一个x射线胶片。光密度的比值(OD)地带的GAPDH带计算的相对表达水平样本蛋白质水平。

2.9。免疫组织化学

SCI 72小时和2周后,脊髓受伤的是收获,Iba-1的表达是通过免疫组织化学方法检测()。首先,老鼠在每组麻醉与预冷灌注多余的麻醉和PBS 10分钟,然后以4% PFA 20分钟。脊髓3毫米上下段被影响,固定在PFA 4 h, 4%与20%蔗糖脱水24 h,然后以30%蔗糖48 h。组织解决后,组织与场外组织固定,固定到10片μ米部分,免疫组织化学染色,清洗5分钟×3 PBS,封锁与驴血清2 h,一夜之间孵化与初级抗体山羊anti-Iba-1 (Abcam 1: 500年,剑桥,英国)在室温下。组织又洗了三次PBS和孵化与相应的二次抗体2 h。细胞核与DAPI染色。这些照片是用荧光显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。Image-Pro + 6.0(美国媒体控制论、银、弹簧)被用来量化阳性细胞的数量。

2.10。通过TUNEL染色法检测细胞凋亡率

脊髓受伤的细胞凋亡率被TUNEL染色检测到72 h SCI后()。实验进行了严格按照指示TUNEL试剂盒(罗氏分子生化药剂,印第安纳波利斯,美国)。Image-Pro + 6.0(美国媒体控制论、银、弹簧)被用来计算凋亡细胞的数量。10片被随机选择并计算凋亡指数。

2.11。后肢运动功能

老鼠放在平台之前和之后的1、3、7、10、14 d。的活动和躯干运动髋关节和踝关节的三组()使用BBB评分方法(观察到20.]。

2.12。统计分析

数据分析使用SPSS 21.0软件(美国SPSS,芝加哥,IL)。测量数据表示为平均数±标准差。后肢运动功能的评价是重复测量方差分析和LSD事后概率法。其它指标组间差异比较的单向方差分析(方差分析)。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。女士提高SCI后大鼠后肢运动功能

BBB评分被用来评估后的大鼠后肢复苏SCI(图1)。SCI的BBB评分和SCI + MS组明显低于那些虚假的组1、3、7、10、14 d手术后(),确认在脊髓损伤诱导的成功。动物收到BBB评分明显高于那些女士收到了生理盐水()。在我们的研究中,BBB评分随着时间的增加在SCI和SCI +女士组,表明SCI大鼠后恢复运动功能。女士在SCI +集团BBB评分在14 d时间点明显高于SCI集团(),表明改进的恢复运动功能与老鼠相比,老鼠接受女士收到NS。

3.2。的形态学变化

正常脊髓组织的特点是灰色和白色物质之间的界限清晰,清晰的轮廓神经元细胞细胞质的制服和深度染色。整个脊髓结构完整(图2(一个))。他SCI后染色72 h女士表明政府显著减少细胞死亡,出血,在脊髓和炎性细胞浸润。SCI组出血、液化和炎性细胞浸润观察中间的脊髓病变;脊髓灰质和白质之间的边界是不清楚;脊髓组织表现为无序神经纤维伴随着大量的坏死和神经细胞萎缩;颗粒和空泡变性是发现在神经元细胞的细胞质(图2 (b))。SCI + 2毫升/公斤MS组72 h SCI后,局部出血和炎性细胞浸润观察脊髓受伤;神经细胞的结构几乎是完成;一些神经细胞出现空泡的变性和渗透一些炎症细胞(图2 (c))。SCI + 20毫升/公斤MS组,有较少的神经元和炎症细胞比SCI + 2毫升/公斤女士。SCI组脊髓腔SCI后观察两周;脊髓灰质和白质之间的边界是不清楚足够的炎性细胞浸润(图2 (d))。SCI + 20毫升/公斤MS组,脊髓腔的横截面积是小的炎性细胞浸润较少(图2 (e))。

3.3。女士在SCI变弱氧化应激

MDA和SOD水平测量72 h SCI后确定脊髓水平的氧化应激(图3)。SCI组,SOD水平增加,MDA水平显著降低,而那些虚假的组。在SCI + 0.5、5、20毫升/公斤女士组,MDA水平降低,SOD水平显著增加,相比之下,那些在SCI组(包括)。SCI + 20毫升/公斤MS组,MDA水平降低,SOD水平显著增加,相比之下,那些在SCI + 0.5和5毫升/公斤(MS组)。此外,女士的保护作用与SCI SCI + 20毫升/公斤MS组比女士在其他两个组,表明对SCI摄入量有关女士的保护作用。

3.4。女士在SCI减少炎症

il - 1的内容β肿瘤坏死因子-αSCI后,发现了il - 6在72 h来确定水平的脊髓炎症水平ELISA(图4),知道TNF -α,il - 1β,il - 6是炎症的主要指标。肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,il - 6在SCI大鼠显著增加,相比之下,那些虚假的集团()。然而,TNF -α,il - 1β在治疗后,il - 6含量显著减少与女士()。此外,肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 6水平显著降低20毫升/公斤MS组比0.5和5毫升/公斤女士组()。

3.5。抑制女士SCI后的细胞凋亡

施加一个女士凋亡影响脊髓SCI后通过TUNEL染色法和免疫印迹。TUNEL染色是用来评估细胞凋亡率。caspase-3蛋白被免疫印迹投资。TUNEL染色表明,科学组细胞凋亡率显著增加,显著降低20毫升/公斤MS组72 h SCI后()(图5)。免疫印迹分析还表明,caspase-3的蛋白质含量显著增加在SCI组相比在虚假的组。然而,caspase-3蛋白显著减少20毫升/公斤MS组相比在SCI集团()(图6)。

上述结果表明,政府施加一个女士对SCI存在剂量依赖的相关性影响。看到这个保护作用更好的女士在20毫升/公斤集团的剂量20毫升/公斤女士在第2部分中使用实验,调查其效果在抑制小胶质激活对SCI和长期的影响。

3.6。女士在SCI抑制小胶质激活

知道增加的数量和激活的小胶质细胞在二级SCI的发展起到了关键的作用,我们通过免疫组织化学方法研究小胶质激活72 h(图7(一))和2 w(图7 (b))SCI后,没有20毫升/公斤女士治疗。众所周知,小胶质细胞能具体地表达Iba-1。如图7,一些Iba-1-positive细胞中观察到虚假的集团,而更多Iba-1-positive细胞被发现在脊髓损伤SCI后72 h和w。发现Iba-1-positive细胞的数量减少,和小胶质激活后抑制管理20毫升/公斤形态被免疫荧光显示,女士和SCI-induced激活小胶质细胞的肥大和增生的特点,和Iba-1-positive细胞的数量在72 h显著下降,在SCI(图2 w7 (c),)。的小胶质激活和过度表达Iba-1显著抑制后女士管理。此外,Iba-1-positive细胞的数量在2 w SCI后下降明显比在72 h SCI后()。

4所示。讨论

近年来,巨大和快速进展的研究沼气如一氧化氮(NO) (21),一氧化碳(CO) (22],硫化氢(H2S) [23]。在过去的十年里,氢已成为一个热点的研究由于其抗氧化,抗炎,抗凋亡属性(24- - - - - -27]。人类肠道中的细菌可以产生氢气,可以转化为甲烷和氢气在肠道产甲烷细菌(15]。但甲烷在人体内的生理和治疗作用一直被忽视。众所周知,甲烷是一种最丰富和最容易的烷烃有机气体的性质,作出贡献的“温室效应”的影响。最近,一些学者报道,甲烷对糖尿病性视网膜病变(会有积极的影响18),肠道红外(28),和肝脏红外(17)通过抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[29日]。此外,气体分子的扩散特征包括氢、CO和乙烷呈现渗透细胞膜和细胞器。更重要的是,甲烷可以自由通过blood-spinal绳障碍。这些特性的甲烷提供用于治疗SCI的可能性。

SCI的特点是高发病率和死亡率,根据神经病理学(可分为三个阶段30.- - - - - -33]:第一阶段是炎症反应的早期阶段,主要从损伤破坏的开始后3天,和这一阶段的特点是出血,髓鞘损伤,细胞死亡,组织水肿,炎性细胞浸润。在第一阶段,氧化应激和炎症被认为是科学的主要因素。大量的研究已经证实,过量的活性氧会导致DNA氧化损伤,细胞损伤,脊髓功能障碍在SCI的早期阶段。因此,ROS、MDA的含量可以代表在细胞氧化应激损伤的严重程度(34]。炎症是科学发展的主要原因。在SCI炎症反应的第一阶段,大量的炎症细胞和小胶质细胞被激活并释放大量炎症因子,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6,导致炎症级联导致严重的次生SCI。第二个阶段是坏死物质清除阶段,这个阶段从4天到2周后损伤,表现为水肿、小胶质激活和增生、坏死细胞间隙,脊髓空洞症的形成和细胞凋亡。细胞凋亡是细胞失活的一个重要因素。在生理条件下,细胞凋亡是细胞死亡的一种现象。在SCI,氧化应激和炎症反应可以增加细胞凋亡率的脊髓35]。过度激活的小胶质细胞可以产生多种炎症因子,导致不平衡的免疫调节脊髓,使科学更糟。第三阶段是神经胶质细胞增殖的阶段2周后损伤,表现为astroglial扩散和脊髓体积减少(36]。在SCI的第三阶段,增殖和活化的星形胶质细胞可以形成胶质瘢痕,神经再生的主要障碍在后期SCI (37,38]。

在我们的研究中,我们首次发现,女士可以修复SCI,减弱氧化应激和细胞凋亡,减少小胶质激活产生的炎性细胞因子的释放。女士管理ip可以显著减少脊髓损伤的炎性细胞因子的含量。女士也可以显著提高SOD活性,降低疯了的内容,从而减少氧化应激损伤脊髓。脊髓组织的细胞凋亡,抑制女士的表达caspase-3分开。此外,政府可以调节免疫反应和抑制小胶质激活女士在该地区受到SCI-induced SCI的影响。女士可以减少炎症反应的强度和氧化应激的受伤的脊髓受伤的脊髓小胶质overactivation减少,从而减少SCI和促进脊髓修复。简而言之,我们专注于炎症的病理生理过程,氧化应激、细胞凋亡过程中SCI和证明,女士可以减少SCI抑制小胶质激活和抑制glial-associated氧化损伤,炎症和凋亡损伤。

在第一部分,我们研究了不同剂量的影响甲烷的SCI的早期阶段。我们检查了氧化应激在脊髓的变化通过检查的内容在受伤的脊髓组织中SOD和MDA SCI后24小时,检测肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,并通过ELISA测定il - 6在SCI炎症反应的强度。我们的研究结果证实,氧化剂和炎症水平大幅增加72 h SCI后,女士可以下调氧化剂压力和炎症因素SCI 72 h后的内容。结果表明,不同浓度的女士都可以减弱引起的炎症和氧化应激SCI,这可能是由于减少炎性细胞因子和活性氧。各种类型的细胞死亡,相关科学的发展。研究表明,减少细胞凋亡,尤其是神经元细胞凋亡,可以显著改善预后的SCI (39]。在目前的研究中,细胞凋亡测定72年h女士有或没有注射的小鼠。发现ip注入20毫升/公斤女士显著抑制细胞凋亡。这可能是女士的机制发挥其保护作用。这种效应存在剂量依赖的相关性,最为明显的剂量20毫升/公斤。因此,20毫升/公斤女士是在第2部分中使用的实验评估保护机制和长期的效果。发现小胶质激活在SCI后72 h和w。SCI地区发现小胶质细胞被激活在72 h和w,这小胶质激活女士可以减毒的管理。抑制小胶质overactivation可以降低炎症反应的强度,氧化应激,在脊髓细胞凋亡,表明甲烷产生的保护作用对SCI抑制小胶质激活与氧化有关,炎症和凋亡SCI后受伤。

SCI后运动功能的老鼠,我们进一步研究了BBB评分为SCI大鼠2周后没有女士,知道它有更多的临床意义。结果表明,治疗后与女士SCI帮助改善运动机能,特别是在SCI的早期阶段,确认越早越女士管理保护效果会越好。然而,由于数量有限的动物()和主观性质的BBB评分系统用于这项研究中,可能会有一些错误的实验结果。

然而,抑制效果的确切分子机制相关小胶质活化甲烷的氧化应激、细胞凋亡、炎症反应尚不清楚。不同的研究者提出不同的假设。米德尔斯堡等。16)认为,甲烷可能积累在细胞膜的接口和改变蛋白质的理化性质或原位功能嵌入到环境中。Kai et al。40)提出,甲烷可能影响膜通道,影响G蛋白、膜受体介导信号和acetylcholine-activated离子通道动力学。芬克(41)提出,应该进行更多的研究来阐明加氧酶的存在可以利用甲烷作为衬底,甲烷受体在细胞,和甲醇之间的关系,反应性酒精、NAD (P) + / NAD (P) H比,和甲烷。需要更多的研究来确认女士对小胶质激活的影响之前,可以用于临床实践(42]。我们假设甲烷可能调节古典(M1)的影响和替代(M2)平衡的小胶质细胞和促进小胶质细胞M1转换在SCI M2。进一步的研究需要阐明甲烷和小神经胶质细胞类型之间的关系和分子机制。

5。结论

目前的研究表明,甲烷可以显著抑制小胶质激活与氧化有关,炎症和凋亡损伤SCI后。综上所述,甲烷是临床治疗的承诺SCI无毒性,相对稳定,自由通过细胞膜渗透率。甲烷的影响方式和路线的政府在SCI和甲烷的确切分子机制需要进一步研究。

信息披露

内容完全是作者的责任。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

李WeiHeng王、小东黄和剑本文同样起到了推波助澜的作用。肖建你们和花城ξ同样支持这个项目。

确认

这个项目是由中国国家自然科学基金(批准号81472071和81472071)和国家高技术研究发展计划(“863”计划)(批准号2013 aa032203)。

补充材料