文摘

目的。虾青素(AST)有很强的抗氧化细胞膜伴侣蛋白的保护作用。最近,一种水溶性纳米尺度的AST (nano-AST)生产,预计提高口服摄入的疗效的影响。本研究的目的是研究口腔nano-AST是否具有医疗效果UV-induced角膜炎的老鼠。方法。C57BL / 6小鼠接种两次与nano-AST, AST石油、叶黄素、越桔提取物3小时前和前不久紫外线照射(剂量:400 mJ /厘米2)。眼角膜被收集后24小时内照射和圆)和TUNEL染色。NF -κB, dihydroethidium(她)cox - 2》κB -α,肿瘤坏死因子α,通过免疫组织化学和CD45表达式进行评估,免疫印迹分析,qPCR。结果。角膜上皮明显厚于小鼠口服接种nano-AST比其他人( ),大大减少NF -κB核易位( ),并显著减少TUNEL细胞( )。弱信号检测在nano-AST集团( 相对于其他的)。此外,减少炎症和减少细胞死亡在角膜组织观察nano-AST组显示cox - 2的表达,减少》κB -α,肿瘤坏死因子α和CD45。结论。口服nano-AST展示了一种保护作用的UV-induced角膜炎通过抗氧化、抗炎、抗凋亡的活动。

1。介绍

眼睛的接触紫外线B (UVB)辐射会导致角膜炎,条件是与调节炎症介质的表达如核转录因子——(NF)κB和前列腺素E2 (PGE2 / COX2)的一部分prostaglandin-endoperoxide合成酶(发现)系统(1]。急性UVB照射影响所有层的角膜,尤其是上皮(2)在角膜细胞通过诱导细胞凋亡和坏死(3]。先前的报道表明,UVB照射在400 mJ /厘米2鼠标眼角膜是一个有用的模型为研究急性角膜炎和测试抗氧化化合物的能力(3]。

虾青素(AST);3 30-dihydroxy-b b-carotene-4 40-dione),没有维生素a活动的类胡萝卜素(4,5),具有潜在的临床应用由于其抗氧化活性,这是高于β胡萝卜素和α生育酚(4,6]。此外,报告它的药理作用,包括抗肿瘤、抗癌、治疗糖尿病药和抗炎活动6- - - - - -9]。此外,先前的研究表明,口服AST可能改善代谢综合症在肥胖的老鼠8]。其细胞保护作用也在肝脏和声带(10,11]。AST展品活性氧(ROS)清除活动(12)和抑制UVB-induced细胞凋亡在角化细胞13]。的眼睛,AST变弱减少细胞凋亡视网膜损伤的视网膜神经节细胞在小鼠体内通过抑制氧化应激(14)和光致视网膜损伤(15]。此外,AST降低糖尿病视网膜氧化应激在体外实验(16),减少视网膜缺血损伤(17,抑制细胞死亡的视网膜神经节细胞在各种压力(18在小鼠模型。据报道,在人类中,AST口服补充增加超氧化物清除房水的活动19]。

人类消费食品是AST的天然来源,如鲑鱼、螃蟹、海带,自古以来没有任何已知的副作用和毒性。1999年,纯粹的AST是作为膳食补充剂通过食品和药物管理局(FDA)在美国(20.]。AST是部分被肠粘膜细胞吸收。然而,AST导致有限的生物利用度的亲油性AST到达体循环(由于不完整的初步的新陈代谢和21]。

然而最近,AST已成功生产nanoemulsion滴。微生物采油穆罕默德Affandi等人接触水/ AST油溶液在高压高速离心(800条)来产生稳定的AST油液滴(nano-AST)直径150 - 160 nm。AST的化学成分是不改变;液滴不聚合,可以进一步溶解在水中22]。

减少自氧化和延长保质期nano-AST化合物的报道,和潜在的更高的生物利用度。(22]富士胶片(日本东京)证实nano-AST血清浓度的增加和延长半衰期在大鼠口服相比AST溶解在油(23]。

我们以前报道,AST展品抗炎效应存在剂量依赖的相关性(24,25)和NF -抑制炎症介质的产生κ通过减少NF - B下游通路,κB激活和肿瘤坏死因子(TNFα)生产在体外(26]。

在这项研究中,我们确定口腔nano-AST有潜在疗效UV-induced角膜炎在小鼠和评估保护作用与常用的抗氧化剂,包括叶黄素,水溶性越桔提取物,AST溶解在油油(AST)。

2。材料和方法

2.1。照顾动物

在目前的研究中,8-10-week-old C57BL / 6 j雄性老鼠从制药非饱和服务集团有限公司(日本札幌)。老鼠在特定的无菌条件下保持许可的动物保健设施健康科学大学的北海道(日本札幌)。实验动物实验委员会批准健康科学大学的北海道。过程涉及的动物都是按照规定执行的实验动物保健和使用健康科学大学的北海道和下午决议的使用动物研究。

2.2。治疗和UVB照射

下列物质被使用:(1)nano-AST (ASP-1;很多:F4X03,富士胶片公司,日本东京;0.5、5、50毫克/公斤,重蒸馏的水)(DDW)中所描述的;(2)AST石油(ASTOTS-10O;很多:150121 - 100;Kashiwa武田志贵、日本;油);(3)万寿菊提取物(叶黄素;植物如果留意;很多:UE014040117;DSM营养日本,日本东京;油);(4)越桔提取物(花青素;干越桔提取物等;很多:31584 / M1;DDW)。

AST石油的比例和剂量,叶黄素,AST和越桔提取物:叶黄素:越桔= 1:1:10人推断基于报告作为食品补充剂在人类眼睛;AST油:6毫克/天,叶黄素:6 - 10毫克/天,和越桔提取物:120毫克/天(21,27- - - - - -29日]。

最初,确定nano-AST的有效浓度,UVB-exposed动物管理与nano-AST(0.5、5、50毫克/公斤)或DDW(积极的控制)。未照射和参与动物作为负控制(天真)。后来,nano-AST保护作用(50毫克/公斤)在小鼠UV-induced角膜炎与AST石油(50毫克/公斤),叶黄素(50毫克/公斤),越桔提取物(500毫克/公斤)以及天真的对照组。药物/复合/治疗是口头管理使用软鼠标喂养针3小时前和紫外线辐照之前立即。老鼠与戊巴比妥麻醉腹腔内(i.p。)(50毫克/公斤;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和UVB辐射的剂量(290 - 320 nm) 400 mJ /厘米2使用FS-20荧光灯(松下、大阪、日本)。在实验端点(治疗后24小时内),动物被严厉批评(戊巴比妥,100毫克/公斤,i.p)和组织样本收获。

2.3。组织学和免疫组织化学

眼角膜是收获,一夜之间有10%甲醛固定在4°C,并嵌入到石蜡。矢状的部分5μ米厚是沾hematoxylin-eosin(圆))形态分析和成像奥林巴斯BX50(奥林巴斯、东京、日本)使用FLOVEL文件系统相机(FLOVEL、东京、日本)。中央角膜上皮厚度被一个蒙面的观察者和平均测量。

细胞死亡是通过末端转移酶的研究dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色使用细胞死亡检测设备(罗氏诊断日本,东京,日本)根据制造商的协议。TUNEL-stained部分成像与Eclipse TE 2000 - e(尼康、东京、日本)使用EZ-C1 3.80软件。TUNEL-positive细胞数和平均。

免疫组织化学、deparaffinization补液,沸腾的部分抗原检索的柠檬酸钠缓冲(10毫米柠檬酸钠,0.05%渐变20,pH值6.0)和阻塞(1% BSA, 1小时,在室温下(RT))进行。部分被孵化主要抗体,包括兔多克隆抗体anti-CD45 (ab10558;1:100;Abcam,剑桥,英国),兔多克隆抗体anti-COX-2 (aa584 - 598;1:100;美国开曼化学,安阿伯市MI),鼠标单克隆》κB -α(B-9) (sc - 8404;1:200;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),和兔单克隆裂解半胱天冬酶3 (c-caspase 3);(D175;1:100;细胞信号技术,丹弗斯,美国马)。

彩色部分是可视化(DyLight 488或594 DyLight二级抗体(1:1000;热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国))、安装(延长钻石不变色试剂与DAPI(表达载体,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)),并使用LSM成像700(从卡尔蔡司,德国)。在生成的图像,使用ImageJ COX-2-positive细胞(绿色)统计,相对于总数DAPI-stained核(蓝色)。图像被随机分析和量化蒙面的方式。

2.4。NF -κB核Colocalization

角膜组织是嵌入在最佳切削温度(10月)化合物,flash在液态氮冷冻,切割(10μ米厚度)。解冻部分被洗(0.1 PBS, RT)阻塞(1% BSA, 1小时,RT),对NF -染色κB(兔单克隆anti-NF -κB (ab16502;1:100;Abcam,剑桥,英国)一夜之间在4°C,和洗(0.1 PBS)。部分与荧光孵化dye-conjugated山羊anti-rabbit抗体(1:100;细胞信号技术,日本东京,日本)、安装(延长黄金不变色与DAPI试剂;表达载体,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国),成像。与(粉红色)信号合并图像进行评估并提取使用Photoshop(美国加利福尼亚州圣何塞Adobe Systems,)。的数量产生的NF -κB与核被一个蒙面的观察者和平均。

2.5。检测活性氧(ROS)

Dihydroethidium(她Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),一个氧化红色荧光染料,用于胞质超氧化物阴离子(O2−)检测在10月部分氧化30.]。简而言之,部分被解冻,立即应用30μM的解决方案在PBS 5分钟,洗后用PBS和温和的PFA固定使用1%,10分钟。彩色部分是用PBS和安装与DAPI延长钻石不变色试剂(表达载体,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。

图像获取与Eclipse TE 2000 - e(尼康、东京、日本),和区域大小相同,包括角膜上皮细胞层和在底下的基质,平均亮度值的进行评估和量化ImageJ(美国马里兰州贝塞斯达国家健康研究所)。对比染色与DAPI是增强组织可视化但并不是用于量化。

2.6。免疫印迹分析

组织是由试剂盒均质TissueLyser LT(试剂盒、希尔登,德国)和全蛋白提取Ready-Prep™总蛋白提取设备工作的解决方案,补充了蛋白酶停止蛋白酶和磷酸盐抑制剂鸡尾酒(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。蛋白质含量是量化(量子位3.0荧光计,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),煮(25μ总蛋白质的g Laemmli样品缓冲1:3体积比,5分钟,95°C, Bio-Rad),通过sds - page分离(迷你千变万化的预制丙烯酰胺凝胶,Bio-Rad)。样品被转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜electroblotting (Trans-Blot涡轮增压传输包,Bio-Rad),其次是堵塞(5%脱脂奶,1小时,RT, Bio-Rad)。随后,使用兔多克隆抗体进行孵化anti-CD45抗体(ab10558;1:250;Abcam,剑桥,英国),鼠标单克隆》κB -α(B-9)抗体(sc - 8404;圣克鲁斯生物技术1:200年,圣克鲁斯,CA,美国),兔多克隆抗体cox - 2 (aa 584 - 598;开曼化学1:200年,安阿伯市,美国MI)。其次是辣根peroxidase-conjugated二级山羊anti-rabbit (AP307P, 2700944, 1: 1000;美国默克密理博,Billerica的)和anti-mouse抗体(AP308P, 2688593;1:1000;美国默克密理博,Billerica的),甚至蛋白质加载被兔多克隆抗验证β肌动蛋白抗体(pa1 - 21167;1:2000;热费希尔科学)。与化学发光信号可视化清晰™西方ECL衬底(Bio-Rad)根据制造商的协议并使用las - 500检测成像系统(美国通用电气,费尔菲尔德,CT)。

2.7。RNA分离和定量实时PCR (qPCR)

角膜组织无巩膜的边缘中断(试剂盒TissueLyser LT、试剂盒、希尔登,德国),RNA提取(RNeasy迷你装备,试剂盒),量化(热费希尔科学NanoDrop 2000年,沃尔瑟姆,妈,美国),和反向转录cDNA根据制造商的协议(ReverTra Ace®qPCR RT大师混合,Toyobo,大阪,日本)。执行qPCR TNFα(mTNFα转发:GCCTCTTCTCATTCCTGCTTG;反向:CTGATGAGAGGGAGGCCATT (31日])和GAPDH (mGAPDH转发:AGAACATCATCCCTGCATCC;反向:CACATTGGGGGTAGGAACAC)使用Kapa SYBR快速LightCycler 480 (Toyobo,大阪,日本)。三个五生物复制技术和运行每组

肿瘤坏死因子α阈值周期(CT)值规范化GAPDH值,使用相对量化方法计算基因表达(2−△△Ct)。获得的数据被调整为褶皱变化相对于天真的组。

3所示。统计分析

所有的值表示为均值的平均值±标准误差(SEM)各自的团体。使用双尾学生统计分析确定t以及。一个 值小于0.05被认为是重要的。数据中使用以下标记:无意义的(n)。 ); ; ; 。

4所示。结果

4.1。确定最优治疗Nano-AST和剂量依赖性的保护作用

在UVB照射后24小时,角膜上皮细胞层是保存在小鼠口服nano-AST 50毫克/公斤。相比之下,政府的0.5和5毫克/公斤nano-AST表现出类似上皮损伤以及水肿在牙龈层相对于对照组UVB(图1(一))。量化的角膜上皮厚度(图1 (b))透露,角膜上皮在50毫克/公斤nano-AST组相比明显较厚的UVB控件( ) 而上皮厚度在0.5和5毫克/公斤nano-AST-treated动物并没有明显的不同于UBV控件( )。基于这些结果,50毫克/公斤被认为是一种有效的浓度nano-AST进行进一步的实验。

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图1
摄入量有关nano-AST对角膜上皮厚度的影响,UVB照射后24小时。(一))角膜上皮细胞和间质组织的染色。角膜上皮明显厚与保存完好的细胞形态学50毫克/公斤nano-AST组相比,UVB控制和低浓度(0.5和5毫克/公斤)的nano-AST治疗。比例尺= 25μm。(b)量化的角膜上皮厚度显示50毫克/公斤nano-AST的重要保护作用,指出通过显著厚上皮( 比未经处理的UVB)控制。而0.5和5毫克/公斤nano-AST治疗没有达到意义( UVB对照组)相比,总体平均的值表明可能存在剂量依赖的相关性反应。 (眼睛)每组。n。 ; ; 。
4.2。Nano-AST治疗效果相比AST石油、叶黄素、越桔提取物

接下来,我们研究了AST石油的保护作用,叶黄素,越桔提取物和nano-AST相比(图2)。Nano-AST保存治疗上皮和导致温和的角膜表面形态变化相比,在其他组织(图2(一个))。没有观察到显著的保护作用AST石油——叶黄素,和越桔extract-treated组,表明没有检测到显著差异( )在角膜厚度相对于UVB控制动物(图2 (b))。相比之下,nano-AST显著(50毫克/公斤)保存角膜上皮厚度比UVB对照组( )、AST石油( ),黄体素( )和越桔提取物( ),(图2 (b))。

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图2
比较nano-AST保护作用、AST石油、叶黄素、越桔提取物。(一)小鼠角膜组织的形态分析使用)染色。明显变薄,形态和结构的变化与细胞浸润增加上皮细胞层观察角膜基质的UVB控制、AST石油——叶黄素和bilberry-treated组。角膜上皮细胞层厚度在nano-AST-treated动物显然是稀释剂与未照射眼角膜天真相比,细胞形态和上皮细胞层结构保存完好。比例尺:30μm。(b) Nano-AST(50毫克/公斤)治疗导致重大厚角膜上皮UVB控件(相比 )、AST石油( ),黄体素( )和越桔提取物( )治疗。 (眼睛)每组。n。 ; ; ; 。
4.3。Nano-AST治疗减少ROS在角膜组织生产

调查ROS生产、收获角膜组织是沾染了她(图3)。免疫组织化学显示强大的表达式在UVB-irradiated组,而明显下降的信号中检测出nano-AST和AST油动物(图3(一个))。她信号(图的定量分析3 (b))显示,活性氧产量显著降低口服nano-AST ( )和AST油( )组相对于对照组UVB-irradiated,而叶黄素或越桔提取物治疗没有显著影响ROS在UVB-irradiated角膜组织生产。

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图3
评估活性氧(ROS)水平dihydroethidium(她)染色。(一)细胞核与DAPI染色(蓝色)。活性氧通过她染色了。ROS和她之间的反应,她的形式,一个红色荧光,生产,即2-hydroxyethidium。ROS是强烈UVB-irradiated组发现,叶黄素和越桔。相比之下,nano-AST组显示ROS的微弱信号,与一些AST降低石油。比例尺= 25μm。(b)染色量化显示显著降低亮度值在nano-AST - ( )和AST石油( )治疗组。叶黄素和越桔提取物管理局并没有导致显著减少ROS信号比UVB控制。 (眼睛)每组。n。 ; ; ; 。
4.4。Nano-AST治疗减少角膜细胞死亡和细胞凋亡蛋白酶3-Dependent细胞凋亡

UVB照射在角膜细胞凋亡;因此,我们评估了nano-AST和其他抗氧化剂对细胞死亡的影响。首先,凋亡细胞与TUNEL染色(图4(一))。发现了众多TUNEL-positive核UVB-irradiated眼角膜,而只有少数TUNEL-positive nano-AST-treated眼角膜细胞被观察到。AST石油、叶黄素和越桔提取物管理,然而,相比没有明显不同的TUNEL染色显示信号UVB控制。通过TUNEL染色法进一步获得数据支持的凋亡标记c-caspase 3染色(图4 (b))。量化的TUNEL-positive细胞(图4 (c))显示显著减少凋亡细胞的数量在nano-AST政府比UVB控制( )和其他治疗组( )。相比之下,发现无显著差异之间的UBV对照组和动物对待AST石油、叶黄素、越桔提取物( 、n)。

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图4
细胞死亡分析角膜组织通过TUNEL检测和裂解半胱天冬酶3染色。(一)细胞核与DAPI染色(蓝色)。细胞死亡被TUNEL染色(绿色)评估。大量TUNEL-positive核检测角膜的UVB控制老鼠。相反,一些TUNEL-positive核观察nano-AST-treated老鼠,和AST石油管理局引起轻微减少TUNEL-positive细胞。叶黄素和越桔提取物没有导致TUNEL-positive核的数量明显减少。未照射组(天真)显示背景TUNEL-positive细胞的水平,可能与组织相关的收获过程。(b)裂解半胱天冬酶3染色结果与TUNEL染色结果,显著增加c-caspase 3-positive通过整个角膜上皮细胞层的UVB控制、AST石油——叶黄素和bilberry-treated组。Nano-AST-treated动物,然而,证明只有少数c-caspase 3-positive表面的上皮细胞信号层。没有具体c-caspase 3信号被检测到在天真的眼角膜。 (c) Numbers of TUNEL-positive cells were evaluated and averaged. Quantitative analysis confirmed the significant reduction of apoptotic cells by nano-AST ( UVB对照组相比。AST油、叶黄素、和越桔提取物有类似的数字TUNEL-positive核的UVB对照组( )。 (眼睛)每组。n。 ; ; 。
4.5。Nano-AST治疗减少了NF -κB激活

NF -κB以其活性的形式驻留在细胞质中,观察到在未照射的小鼠角膜组织(图5(一个))。UVB照射激活NF -κB信号通路,导致NF -κB易位到细胞核,UVB-irradiated组(图所示5(一个))。NF -的数量κ量化(图B易位到细胞核5 (b))。量化显示显著降低NF -κB核colocalization核内信号nano-AST组相对于对照组UVB ( )。AST石油管理局、叶黄素和越桔提取物不显著降低NF -κB易位( )相比,UVB控制。

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图5
Immunofluorescent NF -分析κB核易位。(一)UVB照射诱发NF -κB移位入核。NF -κB(红色)仍在细胞质中天真的老鼠,虽然nano-AST(50毫克/公斤)治疗显著降低translocalization(粉红色)的NF -κB在核(蓝色)。获得免疫组织化学没有数据表明AST显著信号改变石油——叶黄素或越桔extract-treated组。比例尺= 25μ分析m。(b),平均值的NF -κB-positive细胞被评估。数量的NF -κB-positive细胞显著减少nano-AST组相对于其他辐照组( )。 (眼睛)每组。n。 ;
4.6。Nano-AST抑制促炎的表达环氧酶- 2 (COX)和磷酸化κB -α炎症细胞和CD45关键中介招聘

cox - 2, NF -的下游基因κB,是炎症细胞的重要中介招聘。促炎因子的表达cox - 2在UVB诱导接触(图6(一)UVB控制)。然而,明显减少角膜组织中cox - 2的信号是通过免疫组织化学方法显示nano-AST-treated组。虽然轻微减少观察cox - 2信号在某些AST油样品,评估COX-2-positive证实细胞显著减少的百分比nano-AST - ( )治疗动物,但并没有发现显著减少其他治疗组相比,UVB控制(图6 (b))。这些结果进一步支持通过免疫印迹分析,明确降低cox - 2带强度nano-AST-treated眼角膜和在较小程度上AST油组。相比之下,叶黄素和越桔提取物政府并没有导致降低cox - 2表达证明免疫组织化学和免疫印迹分析。NF -κB是抑制蛋白质在细胞质中举行的κBα。在NF -κ我激活,κBα磷酸化(πκBα)导致的封存NF -κB,我κBα复杂和NF -κB核易位。符合NF -κB核易位染色(图5),免疫组织化学显示减少πκBα信号nano-AST-treated组和减少表达AST石油管理局后比UVB控制(图6(一))。免疫印迹分析πκBα表达在角膜演示了UVB控制之间的细微差别和nano-AST乐队强度(图6 (c))。

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图6
cox - 2的表达水平,phospo-IκBα(导出κBα)和CD45在角膜组织。(一)cox - 2(绿色)和phospho-IκBα(绿色)表达在角膜组织的治疗(nano-AST、AST油、叶黄素和越桔)和控制老鼠(UVB控制,天真的);原子核由DAPI复染色(蓝色)。比例尺= 20μm。(b) cox - 2表达的定量结果计算的每个部分的COX-2-positive细胞数量相对于细胞的总数由DAPI信号平均计算。COX-2-positive细胞数量显著减少nano-AST-challenged组( ),但AST石油——叶黄素和越桔extract-treated动物显示相似数量的COX-2-positive细胞UVB对照组( )。 (眼睛)每组。(c) CD45、cox - 2和phospho-IκB -α表达式是由免疫印迹分析进一步证实了。β肌动蛋白作为加载控制。n。 ; ; ; 。

此外,CD45的表达在nano-AST减毒和一定程度上在AST-treated鼠标眼角膜(图6 (c))。

4.7。Nano-AST治疗减少肿瘤坏死因子α转录

TNF的表达谱α治疗组(UVB控制、nano-AST和AST石油)被qPCR评估(图7)。肿瘤坏死因子的转录α在UVB对照组相比显著增加了天真的( ),然而,nano-AST显著降低( 相对于UVB)集团控制。肿瘤坏死因子α基因表达没有明显影响AST石油、叶黄素、越桔治疗( )


图7
肿瘤坏死因子的定量PCR分析α在小鼠角膜表达式。肿瘤坏死因子显著减少褶皱变化α表达相比,UVB控制nano-AST - ( )治疗组。AST石油、叶黄素和越桔提取物UVB对照组(没有显著不同 )。 (每组动物)。数据表示为褶皱变化相对幼稚的对照组。n。 ; ; 。

5。讨论

角膜上皮的作用是保护潜在的角膜基质,后眼睛结构和组织对UVB吸收大量的紫外线辐射的影响。上皮细胞有一种天生的抗氧化系统32)这是不知所措的接触更有活力UVB光。UVB照射时,ROS生产是暂时性的增加和激活细胞信号通路(33]。过度UVB照射导致DNA和细胞膜损伤导致角膜上皮细胞的坏死和凋亡诱导激活的转录因子如NF -κB (34]。

NF -κB被称为的一个主要转录因子调节炎症和细胞生存35]。激活NF -κB诱发upregulation炎症介质、酶和细胞因子如cox - 2、PGE2和肿瘤坏死因子α(9]。肿瘤坏死因子α启动炎症正反馈循环,导致NF -κB激活(36]。早期组织与炎症细胞浸润,主要与CD45和CD11b-positive白细胞发生后数小时内UVB进一步暴露,引起组织损伤(37]。

AST抑制在活的有机体内激活NF -κB在endotoxin-induced葡萄膜炎(EIU)和脉络膜新生血管模型(24,25]。我们之前报道,局部AST眼药水悬浮在聚乙二醇(PEG)防止UV-induced通过减少NF -角膜炎κB表达和活性氧激活(38]。然而,缺乏水溶性AST的限制因素是局部使用,以及其不透明的特性,这样可以减少视觉应用后在短时间内。因此,AST的使用仅限于皮肤化妆品产品。

此外,随着角膜是nonvascular组织之一,明显高于血液AST水平需要达到预期的治疗效果在角膜疾病口服摄入。

目前的研究表明口服nano-AST行政保护作用对UV-induced急性角膜炎。50毫克/公斤nano-AST口服药物保存上皮细胞形态和数量显著降低TUNEL和NF -κB-positive细胞角膜。免疫组织化学、免疫印迹分析和qPCR进一步支持这些结果表明cox - 2的显著减少,CD45》κBα,肿瘤坏死因子α表达式,从而导致减少炎症反应和细胞死亡。

之前报道,口服nano-AST导致等离子体高1.5 - -1.8倍AST浓度AST油摄入量相比,等离子体AST水平达到3小时后管理(23]。我们可以推测,亲水性nano-AST达到足够高的水平,足以可以有效的眼表面的渗透blood-eye障碍,从而到达房水和流体。

确定的相对有效性nano-AST配方,抗氧化化合物是众所周知的在研究和商业应用39)被纳入实验设计,如叶黄素、AST油和越桔提取物。

从内部合成叶黄素在黄斑组织的发现是人类和一些动物的眼睛40]。它已经表明,黄斑类胡萝卜素的含量可以通过饮食来改变操作和类胡萝卜素水平较低年龄相关性黄斑变性(AMD)患者已报告(41]。而叶黄素的抗氧化效能高是众所周知的,并演示了在各种细胞(42)和组织(43),亲油性限制其口服生物利用度(44]。在目前的研究中,叶黄素对细胞死亡没有产生任何显而易见的影响,角膜炎症或活性氧反应。

最近的数据表明,花青素作为可利用其他黄酮类(子类45),如flavan-3-ols和黄酮,相对生物利用度在2.5%和18.5%之间(46,47]。然而,花青素被迅速代谢消除,并产生许多不同的分解产物和代谢产物(45),从而限制了其实用性眼部疾病的治疗。在这项研究中,叶黄素和越桔提取物在抑制无效的角膜损伤,nano-AST相比。

AST石油减少ROS生产(相当于nano-AST)。然而,AST石油没有显著影响角膜上皮细胞死亡或炎症。这个结果可以解释的更好的生物利用度nano-AST AST相比石油(23]。此外,NF -阈值水平κB激活诱导的“全或无”反应在组织缺氧(48]。因此,部分抑制NF -κB激活这并不减少激活阈值水平几乎没有影响随后的炎症级联。这个论点支持我们的免疫印迹和组织学观察,AST石油管理》略有减少κB -α和cox - 2表达但对角膜上皮的形态的影响最小,细胞死亡标记,或肿瘤坏死因子α表达谱。这些结果也表明,AST的影响不仅限于ROS清除。

最近的一项研究表明,AST可能直接影响c-Jun-N-terminal激酶1,调节下游c-Jun的众多因素,如ATF2 SMAD4, HSF1。这些因素是高度参与细胞凋亡、DNA修复,细胞增殖,分别和陪护人员的响应(49]。此外,AST已被证明对cox - 2表达下调基因表达以及cox - 2蛋白和变弱有丝分裂原,压力激发了蛋白激酶的磷酸化(MSK) 1导致减少的磷酸化NF -κB在UVB-irradiated人类角质细胞(50]。AST的确切机制如何达到这种效果尚未完全理解。然而,内质网(ER)压力的减少或磷酸化MSK-1建议尽可能的候选人(49,50]。进一步的机械研究磷酸化c-Jun-N-terminal激酶1和ER应激的角膜上皮细胞培养需要更为深入地理解直接影响细胞内的AST nano-AST配方可能变得更加突出。

迄今为止,AST并不导致任何直接的毒性甚至在高剂量或浓度在活的有机体内(51]或在体外(24]。作为nano-AST化学性质和AST (22),预计不会产生直接的细胞毒性效应。然而,AST积累在皮肤上,导致大鼠可见粉红色的颜色在长期口服剂量30克/公斤(51],而nano-AST在当前研究的有效浓度不超过50毫克/公斤,低于600倍报导致AST明显改变皮肤颜色口服消费(51]。我们不能排除nano-AST溶解度的增加可能会导致肤色较低浓度的变化,这可能是不受欢迎的影响和限制因素对人类使用。延续很长的研究口服nano-AST对AST积累和颜色变化的影响在哺乳动物皮肤是需要确定数量可能会产生这样的效果。

nano-AST配方不仅我们的发现表明可能的临床使用的情况下增加的UVB照射,UVB照射风险等专业登山者、北极、南极和人员,但也表明nano-AST潜在作为补充和预防治疗各种炎症和角膜变性条件,提高眼部表面与ROS生产干眼病(52],圆锥形角膜[53),福克斯的内皮营养不良,大疱的角膜病(54]。

6。结论

目前的研究提供了证据表明nano-AST可有效的保护眼部表面对急性UVB照射的不利影响,且没有明显的副作用。口服nano-AST摄入量可能是一个有前途的自然派生的水溶性物质防止眼部表面高氧化应激的损伤状况。

信息披露

没有其他人员参与这项工作得到报酬从富士胶片公司任何形式的直接或间接。实验结果验证了眼科学系的研究人员,临床和实验医学研究所,林雪平,瑞典林雪平大学与富士胶片公司没有关系。

的利益冲突

坂口欲之医疗实验室的全职雇员,富士胶片公司,日本东京。

作者的贡献

这项研究是设计的构思和Fumiya Harada安东Lennikov, Nobuyoshi Kitaichi。实验是由Fumiya Harada Osamu Uehara Tetsuro Morikawa说道,Rie Takai,安东Lennikov,安东尼Mukwaya,米拉Schaupper。组织学染色获得和分析了Fumiya Harada Tetsuro Morikawa,安东Lennikov,米拉Schaupper, Nobuyoshi Kitaichi。免疫印迹分析和解释,安东Lennikov米拉Schaupper,安东尼Mukwaya。qPCR数据被Fumiya收购Harada米拉Schaupper,安东Lennikov Fumiya Harada和安东尼Mukwaya和分析。手稿是由Fumiya Harada Osamu Uehara喜田岛Abiko,安东Lennikov,安东尼•Mukwaya米拉Schaupper,尼尔·Lagali Nobuyoshi Kitaichi。所有作者批判性的回顾和修订后的手稿和批准提交的最终版本。

确认

作者要感谢尼康成像中心的贡献在北海道大学这项研究的共焦显微镜图像采集和分析,博士的贡献大地的节目从口腔医学的划分和病理学,人类生物学和病理生理学,北海道大学牙科学院,健康科学的“盲”组织学结果的量化。Nano-AST化合物被富士胶片公司请提供。富士胶片公司提供部分资金进行这项研究包括消耗品资产,如动物、抗体、试剂。富士胶片公司也提供nano-AST和负有责任的纯度和有效性提供了为她制定虾青素化合物用于这项研究。

补充材料

补充表1:角膜上皮厚度、UVB照射后24小时内,接受不同剂量的Nano-AST。补充表2:比较Nano-AST其他抗氧化剂治疗。补充表3:平均灰度值(ROS)染色在角膜。补充表4:量化TUNEL阳性细胞。补充表5:量化的NF - ?积极的核。补充表6:量化的cox - 2阳性细胞率。补充表7:定量PCR分析TNFa表达的小鼠角膜。

  1. 补充材料