文摘
范围。人类肿瘤转换由于全球医疗DNA损伤带来了越来越关注。维持基因组的完整性是至关重要的,以避免肿瘤起始和进展。本研究旨在调查苹果类黄酮的疗效分数(AF4)对各种carcinogen-induced毒性在正常人类支气管上皮细胞DNA损伤反应及其机理和修复过程。方法和结果。AF4-pretreated细胞暴露于nicotine-derived亚硝胺酮(NNK),醋酸亚硝胺(NNK-Ae)、甲氨蝶呤(MTX)、顺铂验证细胞毒性,活性氧,细胞内抗氧化剂,DNA碎片,尾巴和DNA损伤。此外,磷酸化组蛋白(γ-H2AX)和蛋白质参与DNA损伤(ATM / ATR, Chk1、相关和p53)和修复(DNA-PKcs和Ku80)机制进行评估通过免疫荧光和免疫印迹,分别。显示较低的细胞毒性,结果显示,AF4-pretreated细胞活性氧生成,和DNA碎片连同顺向抑制DNA的尾巴。水平的增加γ-H2AX和DNA损伤蛋白质carcinogen-treated细胞中观察到显著()在AF4-pretreated细胞,抑制ATR-dependent方式。AF4预处理也促进了DNA-PKcs的磷酸化,从而启动修复机制。结论。苹果类黄酮可以保护体外DNA氧化损伤和促进修复机制。
1。介绍
哺乳动物基因组DNA是容易受到各种环境、细胞毒性、基因毒性的药物,有效修复DNA损伤和激活信号级联机制。在正常情况下与一个特定类型的DNA损伤、DNA损伤通常是通过nonhomologous修理结束加入(NHEJ) /同源重组(人力资源)机制(1,2]。烷化剂、铂药物、抗代谢物,拓扑异构酶抑制剂和电离辐射,亚硝基脲,氮杂环丙烷化合物、烷基磺酸盐,和三嗪化合物的亲电试剂,共价烷基转移到DNA碱基,破坏DNA螺旋和诱发DNA断裂3]。DNA双链断裂(双边带)是最致命的损伤,会导致突变,染色体畸变和细胞死亡4,5]。大量的DNA损伤和修复系统缺陷可导致基因组不稳定性和启动心血管疾病和癌症2,6]。因此,维持基因组完整性拥有全球卫生挑战,应该好解决。
氧化应激水平增加常常引起过多的活性氧(ROS)生成、打破平衡的正常细胞代谢过程和启动双边带(7]。结果,细胞激活DNA损伤反应(DDR)机制,启动修改DNA的各种酶和核损害。招聘phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)家庭成员的DNA损伤是第一步的DDR机制,和共济失调的磷酸化telangiectasia-mutated (ATM)或ATM-Rad3-related (ATR)激酶的往往是在DDR过程(8]。ATM / ATR的磷酸化调节下游目标包括细胞周期检查点激酶(相关/ Chk1),肿瘤抑制基因p53和磷酸化组蛋白γ-H2AX疫源地,俗称双边带的标志(9]。γ-H2AX焦点作为平台的装配和招聘其他DNA修复的因素,包括介质的DNA损伤检验点1 (MDC1)发起DDR机制[10]。依赖DNA的蛋白质激酶(DNA - pk),由Ku70/80异质二聚体和催化亚基(DNA-PKcs),作为合作的顶峰蛋白质ATR / ATM使其他蛋白质磷酸化参与DNA损伤(11,12]。在磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基(T2609、T3950 S2056), dna - pk发起NHEJ修复机制的发现是非常常见的在哺乳动物细胞(4]。dna - pk也会autophosphorylated,表示在正常和恶性不同人体组织与相对小的变化的水平(13]。然而,还有许多其他的蛋白质参与这个复杂的机制和他们的角色仍然是不确定的。
从自然资源开发有效的保健品主要研究努力在过去的十年。虽然有几种报告显示各种植物类黄酮的保护作用和提取不同的基因毒性14),我们所知,没有具体研究显示可用苹果类黄酮的作用机制发挥保护在正常的人类细胞DNA损伤。我们之前的研究表明,苹果皮黄酮类分数(AF4)具有抗氧化、神经保护、抗炎、抗癌活动在不同体外和体内模型(15- - - - - -17]。此外,AF4高度丰富的黄酮和酚酸的含量如槲皮素苷、花青色素3-galactoside,表儿茶素,根皮苷、绿原酸17]。根据这些发现,我们假设AF4可能呈现抵御各种化学物质或环境引起的DNA损伤剂,其主要目标是不可避免的在肺气道上皮细胞。为了验证这个假设,我们调查的影响AF4正常人类支气管上皮细胞(BEAS-2B)挑战与已知的致癌化学制剂如4 - (methylnitrosamino) 1 - (3-pyridyl-d4) 1-butanone (NNK), 4 - [(acetoxymethyl) nitrosamino] 1 - (3-pyridyl) 1-butanone (NNK乙酸;NNK-Ae)、甲氨蝶呤(MTX)、顺铂。我们也分析了信号蛋白质参与DNA损伤途径因为理解DNA修复机制有着重要的影响在发展中一个强有力的治疗剂。
2。材料和方法
2.1。化学物质、包和抗体
支气管上皮细胞生长培养基(BEGM) BEAS-2B细胞从Lonza购买(Walkersville,医学博士,美国)。SCGE彗星试验设备购买从恩佐(美国纽约)。细胞DNA碎片是酶联免疫试剂盒购自罗氏诊断(德国柏林)。免疫荧光研究anti-H2AX主要抗体(S139)是获得微孔(体态,加拿大)和二级抗体Alexa面粉594驴anti-mouse生命科技(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。Bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验设备购买从热科学(美国马切姆斯福德)。总抗氧化能力(TAC)装备从Biovision购买(苗必达、钙、美国)。抗体对dna - pk p-ATM、p-ATR p-Chk1, p-Chk2, p-H2AX, p-P53, Ku80 SOD1,过氧化氢酶,GPX1, beta-actin从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国)。p-DNA-PKcs抗体购自Abcam(多伦多,加拿大)。dna - pk抑制剂[NU7026;((2)- morpholin-4-yl苯并[h] chomen-4-one))是购自Sigma-Aldrich(奥克维尔,加拿大)。 NNK and NNK-Ae were purchased from Toronto Research Chemicals (Toronto, ON, Canada). Cisplatin, MTX, and NP-40 were purchased from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Apple flavonoid fraction (AF4) was isolated from apple peels as described previously [14]。股票的解决方案准备100%二甲亚砜(DMSO),和最终的浓度不超过0.5% (v/v在媒介文化治疗。
2.2。细胞培养
正常的人类支气管上皮细胞(BEAS-2B)从美国购买组织文化类型集合(写明ATCC;crl - 9609)和培养在BEGM媒体37°C湿润孵化器有限公司为5%2。细胞培养在聚苯乙烯T75(75厘米血压得到较好的控制2)培养瓶,预镀的0.01 mg / mL纤连蛋白,0.03毫克/毫升牛胶原蛋白I型,和0.01毫克/毫升牛血清白蛋白溶解在BEBM(基底)中过夜。细胞生长~ 70%融合在所有实验条件和使用来自早期的段落(< 10)和内部的指数增长阶段。
2.3。细胞通过MTS试验可行性
细胞浓度测定96™水细胞生存能力分析(MTS) [18)是用于执行BEAS-2B细胞在不同处理条件下的生存能力。为了找出AF4次致死量,存在剂量依赖的相关性的初步分析为各种浓度的AF4进行24 h。同样,大剂量效应各种致癌物质(NNK, NNK-Ae、顺铂和MTX)也使用该试验标准化。对于cytoprotection分析,1×104细胞被镀在96孔板与媒体150μ信用证。24小时后,细胞使用AF4 (50μg / mL)之前不同的致癌物质治疗(200μM亚硝胺;100年μM NNK-A;10μM顺铂;和200年μM MTX)或单独与致癌物额外的24小时。15毫升的MTS试剂(PMS)被添加到每个在黑暗和孵化进一步3 h。吸光度是记录在490 nm使用标(无限®200 PRO, TECAN,瑞士)。DMSO控制细胞没有任何治疗和细胞只包含培养基和MTS为每个实验试剂为空白。
2.4。测量细胞内的活性氧
ROS水平以BEAS-2B细胞治疗后如前所述[19]。2′,7′二乙酸-Dichlorofluorescin (DCFH-DA)很容易被细胞和DCFH随后水解,可以氧化二氯荧光素的荧光产品(DCF)。AF4-pretreated细胞(1 h)暴露在3 h(致癌物质或独自在不同实验小组。细胞只有DMSO媒体担任车辆控制。治疗后,DCFH-DA被添加到最终浓度的细胞培养板5μM紧随其后40分钟在黑暗的孵化。荧光退化然后测量在490 nm的激发波长和发射波长510 nm利用无限200 PRO, TECAN,瑞士。结果表示为相对总ROS水平对DMSO控制。
2.5。总抗氧化能力(TAC)
colorimetric-based方法被用来测量细胞内的TAC,根据制造商的指示和轻微的修改。简而言之,总细胞溶解产物制备治疗后NP-40裂解缓冲(5 M氯化钠,1米三,10% NP-40)。每个样本与100年了μ我刚做好的铜2 +工作方案和孵化为1.5 h在黑暗。减少(铜2 +对铜+)反应当时以570海里通过无限200 PRO, TECAN,瑞士。Trolox作为标准量化的TAC测试样品,和Trolox等价表达的结果。
2.6。γ-H2AX免疫荧光试验
免疫荧光法(20.)是用来测量DNA损伤在组蛋白水平的量化γ在BEAS-2B细胞-H2AX疫源地。简单地说,2×105细胞被播种在涂盖玻片放置在一个6-well板24小时孵化。实验设置,然后细胞治疗AF4仅1 h或前致癌物治疗3 h(同样的待遇条件维持所有实验后)。DMSO媒体作为控制为每个测试样本。治疗后,细胞用PBS彻底清洗和固定在3.7%甲醛在黑暗为20分钟。细胞被permeabilized 0.5% Triton x - 100在PBS为摇臂在室温下15分钟之后通过阻断4% BSA 20分钟。这些细胞被孵化主要抗体(1:250)1 h在室温下,用PBS洗了三次,然后用二次孵化抗体(1:500)45分钟。在PBS洗细胞三次后,盖玻片转移到幻灯片很仔细,安装使用wet-mounting介质,Vectashield®包含DAPI和密封的指甲油。然后荧光图像被使用显微镜(蔡司,X-Cite系列120 PC) 100 x放大。
2.7。DNA碎片分析
BEAS-2B细胞DNA碎片是衡量细胞DNA碎片酶联免疫试剂盒(21根据供应商的指令)。简而言之,BEAS-2B细胞被贴上10μ在1×10 M溴脱氧尿苷(BrdU)5细胞密度/毫升。几百毫升的BrdU-labelled细胞培养基被视为每上述条件。与裂解缓冲细胞被细胞溶解,凋亡DNA片段在上层清液离心后收集每个样本27010分钟。几百毫升的样品然后转移到预镀anti-DNA 96 -嗯,乘微型板块与孵化90分钟25°C。DNA是变性的微波辐射(5分钟500 W)的100紧随其后μL anti-BrdU-POD共轭解孵化的额外的90分钟。与洗盘子洗了三次缓冲区(1 x)和100年μL的衬底(三甲)的解决方案是添加颜色的发展。25毫升水中停止解决方案增加了5分钟后,和盘子在使用标450海里(无限200 PRO, TECAN,瑞士)。
2.8。彗星试验
彗星试验进行测量DNA尾时刻按照设备的说明书和一些细微的修改。治疗后,1×105细胞结合熔LMA(低熔点琼脂糖)的比率1:10 (v/v)和75μL(每个样本用移液器吸取彗星幻灯片和孵化在黑暗在4°C 20分钟。幻灯片当时沉浸在寒冷的裂解缓冲在4°C 45分钟紧随其后的是碱性治疗(300毫米氢氧化钠,1毫米EDTA, pH > 13)额外的45分钟的黑暗。幻灯片与此种缓冲(1 x)洗5分钟和接受水平电泳条件(1 V /厘米10分钟)。幻灯片是风干在70%乙醇浸渍后5分钟,沾CYGREEN®染料(1:1000),并分析了在显微数字化(蔡司X-Cite系列120个人电脑;多伦多,加拿大)40 x放大(激发/发射489/515 nm)。彗星被商用软件,得分OpenComet (http://www.cometbio.org),至少50个细胞是通过测量尾部DNA百分比量化的时刻。
2.9。西方墨点法
这些细胞被收获治疗和细胞溶解后使用1×SDS裂解缓冲(1毫米Tris-HCl (pH值6.8),2%w/vSDS, 10%甘油)减少的条件下在了冰面上。每个样本中总蛋白浓度测定采用BCA蛋白质化验设备。总共25μg蛋白质样本加载4 - 12% sds - page凝胶和electro-transferred硝化纤维膜。膜被屏蔽5%脱脂奶的解决方案,探索与特定主要抗体(1:1000)隔夜孵化,洗和reprobed各自二级抗体(1:2000)45分钟,然后由增强化学发光(ECL)方法使用Chemidoc议员(Bio-Rad,米西索加、加拿大)。蛋白表达每个乐队的规范化与各自的肌动蛋白水平,和相对蛋白表达是量化为每个实验对未经处理的控制乐队。
2.10。统计分析
所有的实验进行了一式三份()和至少三个独立的时间和分析了双尾学生的t以及利用GraphPad棱镜软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。数据提出了均值±标准差(SD)被认为是重要的实验组之间。
3所示。结果
3.1。细胞生存能力和Cytoprotective AF4的影响
为了实现AF4亚致死的剂量,影响细胞和细胞龛之间初步剂量反应关系的可行性BEAS-2B细胞使用MTS试验进行了研究。观察细胞活力下降细胞和细胞龛之间一个剂量反应关系BEAS-2B细胞AF4浓度的增加,特别是在100年和200年μ克/毫升(图1(一))。然而,在观察细胞生存能力50≥80%μg / mL AF4浓度,因此采取了进一步的实验评估保护作用。我们之前的研究也表明,50μg / mL AF4没有改变细胞的异常的三个主要的正常细胞治疗24和48 h (17]。在所有实验显示细胞毒性≤5% DMSO控制。与每个致癌物后24小时的治疗,我们观察到一个更高的细胞毒性(> 50%)10μ顺铂,200μM的MTX, 100μNNK-Ae的M(图1 (b))。顺铂表现出非常高的细胞毒性研究(> 80%)的致癌物质。然而,BEAS-2B NNK没有显示更高的细胞毒性细胞(< 50%)。同样,研究cytoprotective AF4的影响,我们最初治疗与AF4 BEAS-2B细胞(50μ每个致癌物暴露前g / mL)。AF4预处理显示显著()为NNK-Ae细胞毒性水平,减少MTX,和亚硝胺暴露的细胞相比,其治疗。相比之下,AF4预处理没有任何明显的降低细胞毒性cisplatin-treated细胞,发现与圆形的或分离的细胞形态不同的(数据没有显示)。
(一)
(b)
3.2。ROS减轻AF4潜力和抗氧化剂
过多的活性氧是主要因素之一,能在健康细胞DNA损伤(22]。ROS水平研究与AF4单独或与carcinogen-treated BEAS-2B细胞,和数据图所示2(一个)。几乎所有的carcinogen-treated细胞显示一个双重的增加相对于总ROS (DMSO控制)水平相比AF4-treated细胞。预处理与AF4之前每个致癌物暴露显著()在这些细胞ROS水平降低。有趣的是,在所有的AF4 preexposed细胞,我们观察到类似的ROS水平尽管每个致癌物质进行研究。
(一)
(b)
(c)
抗氧化剂降低ROS生成能力是众所周知的,特别是在氧化应激,这被认为是许多疾病的主要事件(23]。我们评估了抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶)(图2 (b))和TAC(图2 (c))在BEAS-2B细胞处理后AF4单独或与致癌物。预曝光AF4显示增加SOD1表达NNK-Ae或MTX-treated样品相比,其控制。然而,过氧化氢酶和GPX水平保持在所有测试组几乎相同。TAC在AF4 preexposed组表现出更强的抗氧化能力比单独的致癌物质。研究结果表明,AF4潜力增强细胞内抗氧化。
3.3。AF4抑制DNA-Histone蛋白质损失
γ-H2AX免疫荧光试验被用来分析DNA损伤在每个治疗组蛋白水平条件下,结果如图所示3(一个)。DAPI用于染色细胞核(蓝色)与γ-H2AX疫源地,出现红色荧光显微镜下观察。顺铂、NNK-Ae或MTX-treated组表现出严重损害组蛋白水平(139年代)相比,DMSO控制细胞。治疗AF4没有造成任何增加组蛋白损伤水平相比,DMSO控制细胞。量化的数据(图3 (b))表明,预处理AF4显著()抑制γ-H2AX NNK-Ae(焦点/核)水平造成的损害或MTX曝光。顺铂引起的DNA损伤不能能够减少预曝光AF4。观察到其他化验,顺铂显示最高的伤害在所有致癌物质测试。顺铂和亚硝胺因此避免从所有剩余的研究,因为他们发现了有毒或更少的有毒,分别从观测到的γ-H2AX化验。
(一)
(b)
3.4。AF4保护BEAS-2B细胞DNA碎片
DNA碎片被认为是一个早期事件启动H2AX组蛋白蛋白质的磷酸化丝氨酸139位置(24]。调查是否AF4 NNK-Ae保护严重的毒性作用或MTX在DNA水平,我们使用了一个ELISA法和分段层次如图4。OD在450 nm对应BEAS-2B细胞DNA碎片的水平。NNK-Ae和MTX治疗增强DNA碎片级别相比,DMSO控制。我们观察在AF4-treated细胞DNA碎片,但发现是不重要的对DMSO控制。预处理与AF4显著()减少DNA碎片NNK-Ae——和MTX-treated团体和保护这些细胞的DNA的完整性。
3.5。预曝光AF4减少尾部DNA损伤
彗星试验被用来衡量一个真核细胞的DNA链断裂和有多个应用程序,如监测与genotoxins环境污染,人类生物监测和分子流行病学、DNA损伤和修复的研究(25]。治疗后,DNA尾损失评估从细胞核DNA的迁移和数据量化描述的数据5(一个)和5 (b)。未经处理的细胞(DMSO控制)和AF4-treated细胞细胞完整性,保留,他们的尾巴损伤比例< 15%。类似的结果也观察到的未经处理的PC12神经元细胞(26]。BEAS-2B细胞NNK-Ae或MTX处理显示更高比例的DNA受损的尾巴(分别为97.4%和68.0%),和AF4预处理明显()减少尾部的长度百分比伤害,如量化从至少50彗星细胞。NNK-Ae-treated细胞显示最高的尾部DNA损伤MTX治疗相比,在相同的浓度和时间。
(一)
(b)
3.6。AF4抑制DDR信号和促进修复机制
我们进一步调查的作用机制AF4呈现NNK-Ae防护,MTX-induced BEAS-2B细胞毒性分析信号蛋白参与DDR过程。ATR, dna - pk的ATM的磷酸化水平,用免疫印迹(图进行了研究6)。细胞周期检查点激酶Chk1和相关的肿瘤抑制蛋白p53也进行了分析和量化(图6)。ATM / ATR突变DNA损伤的主要原因是,他们行为的上游p53传感器和DDR感觉功能的细胞(9]。NNK-Ae和MTX治疗增强DDR信号和ATR(428)丝氨酸磷酸化BEAS-2B细胞对控制细胞。然而,我们没有观察到任何ATM蛋白的磷酸化作用相同的剂量和时间。发现dna - pk的表达水平与未经处理的控制或carcinogen-treated相同的细胞。有趣的是,预处理与AF4表达下调对控制细胞dna - pk的蛋白质。效应蛋白像Chk1、相关和p53在NNK-Ae-treated磷酸化细胞被发现。相比之下,MTX治疗中没有引起这些信号蛋白。预处理和AF4显示重要的()减少ATR的磷酸化,Chk1和p-53 NNK-Ae-treated细胞水平。我们还观察到一个明显的抑制γ-H2AX AF4-pretreated细胞蛋白质之前NNK-Ae治疗。总体而言,我们的数据表明,预处理与AF4明显变弱DDR蛋白质尤其是挑战对NNK-Ae基因毒性。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
此外,调查是否AF4促进体外DNA修复机制,我们还测试了蛋白质如p-DNA-PKcs和KU80 AF4-pretreated细胞之前NNK-Ae治疗(图7(一))。有趣的是,AF4减少dna - pk水平当单独治疗或结合NNK-Ae但激活p-DNA-PKcs T2609位置。的磷酸化水平DNA-PKcs被发现在AF4-pretreated细胞比NNK-Ae-treated细胞相对较高,表明其DNA修复的潜力。进一步证实了这一点,我们使用NU7026抑制dna - pk的蛋白表达(27]。治疗NU7026 BEAS-2B细胞为20μ米(30分钟)几乎消除了dna - pk的蛋白质在这些细胞(图7 (b))。一个autophosphorylated DNA-PKcs蛋白质在未经处理的细胞,并与抑制剂治疗减少了DNA-PKcs水平即使在AF4-pretreated细胞。这个初步结果进一步证实AF4预处理将促进细胞使磷酸化DNA-PKcs在NHEJ修复机制是至关重要的。
(一)
(b)
4所示。讨论
异常引起生物体的基因组变异增加接触致癌物质往往会导致称为基因组不稳定性的条件。即使是低剂量的化学物质或环境暴露可以引起DNA损伤尤其是有失败在适当的DNA修复机制28]。由于过多的活性氧,预计在天然抗氧化剂防御系统干扰和破坏所有的生物分子,包括核酸。富含抗氧化剂的食物和营养补充剂可以很好的治疗策略来克服氧化核酸损伤(29日]。因此,在这项研究中,我们评估了苹果类黄酮,这是一个丰富的抗氧化剂(17,30.,31日)对各种carcinogen-induced BEAS-2B细胞DNA损伤。我们也旨在研究的潜在机制AF4 DDR和修复过程的影响其次是DNA损伤。
我们先前的研究已经证明了选择性细胞毒性AF4诱导细胞死亡的癌症细胞在不改变正常细胞的生理功能,主要包括人类肝细胞(NHEPS),主要鼠肝细胞(RTCP-10)和主肺细胞(WI-38) [17]。扩大这方面的知识,我们分析了不同剂量的影响AF4 BEAS-2B细胞的生存能力和观察到50μg / mL维护细胞的完整性和可行性甚至24小时治疗后80%以上。然而,发现高剂量大大减少可行性和他人也报道32),表明饮食的激效影响类黄酮(14,33]。因此,我们选择了50μg / mL评估AF4 BEAS-2B细胞的保护作用。亚硝胺、NNK-Ae MTX,顺铂被用来诱导BEAS-2B细胞DNA损伤,因为我们和其他人注意到,这些致癌物质可以显著降低细胞的正常细胞的异常增强ROS水平和细胞死亡机制(34,35]。预处理AF4显著降低毒性致癌物的但不是顺铂治疗。这可能是由于细胞内抗氧化酶(增加SOD和小分子或蛋白质中观察到AF4-pretreated组,可能扮演一个角色在清除这些活性氧,并帮助减轻氧化应激的细胞。黄酮类化合物是众所周知的ROS清除势(14,36),和类似的效果,苹果被许多研究人员报道(15,16,31日]。
组蛋白翻译后修饰在双边带最早的事件之一,常常为染色质的重塑组织(37]。致癌物质用在这项研究中观察调节组蛋白蛋白质转译后的机制甚至在3 h的接触。这观察到毒性可能由于interstrand crosslink-induced双边带在复制叉,主要是负责观察γ-H2AX疫源地carcinogen-treated细胞(38]。每个焦点认为代表一个双边带(39]。然而,与AF4预处理抑制组蛋白变体的重组调节DNA甲基化。这可能占保护作用的相似性组蛋白和DNA碎片,这似乎是敏感的工具分析DNA损伤。DNA碎片被认为是细胞死亡机制和不可逆转的标志事件提交正常细胞死亡(20.]。AF4保护这一现象被发现在BEAS-2B细胞对NNK-Ae和MTX毒性。黄酮类化合物是已知的展示这些针对各种基因毒性的防护潜力明显从不同的研究14,29日,40,41]。碎片级别中观察到的未经处理的细胞可能是因为身体的正常机制处理大片段DNA的死细胞,这可能是维持正常组织内稳态的关键(42]。
因此,定量分析是由使用彗星试验了解致癌因素引起DNA损伤的程度。增加彗星尾巴表示双边带的感应通过切除后再合成和结扎的碎片。显著抑制DNA尾损失记录AF4-pretreated细胞致癌物质治疗相比,进一步证实在BEAS-2B AF4呈现DNA的潜在保护细胞。综上所述,我们推测,这些保护作用主要是由于AF4的抗氧化特性的生化或刺激DNA修复酶的能力。多酚类物质,如毛地黄黄酮、槲皮素和rosmarinic酸显示类似的效果,保护神经细胞DNA损伤与氧化应激(14,26]。最近的一项研究也表明,sesaminol芝麻与增加活动的木质素过氧化氢酶和SOD,保护BEAS-2B细胞对DNA损伤引起香烟烟雾提取物(43]。所有这些研究证实,植物多酚抗氧化活性可以抵消致癌物质的毒性作用,有助于维持基因组稳定。
为了测试我们的假设,我们进一步研究了双边带诱导的分子机制NNK-Ae或MTX,因为它是至关重要的药物发现过程中确定治疗目标。招聘的DDR因素分析了双边带immunoprobing对不同蛋白质(ATR, dna - pk的ATM, Chk1,相关的,和p53)。ATM / ATR突变在监测中发挥着关键作用的基因组完整性以及信号传感器(38]。ATM-Chk2或ATR-Chk1在双边带两个常见的通路被激活并最终引发p53 [44]。我们的数据表明,NNK-Ae引发双边带通过ATR的磷酸化而不是ATM BEAS-2B细胞。ATR是主要的激酶激活在复制压力和起着关键作用在细胞周期阻滞(“S”阶段11]。效应蛋白如Chk1、相关和p53也成为激活NNK-Ae治疗。然而,MTX没有在BEAS-2B细胞诱导这些蛋白质。我们推测,低剂量和照射时间MTX可能适合诱导早期事件在双边带,但可能不足以激活一连串的效应蛋白。此外,MTX也是已知的治疗中应用低剂量使用时(45]。我们也观察到在T2609 dna - pk的磷酸化位点是最常见的目标,其激活(46]。ATM / ATR经常认为在双边带coregulate dna - pk的表达,但他们选择参与仍然是不确定的4,11,46]。
与我们的免疫荧光数据一致,接触NNK-Ae触发的磷酸化γ-H2AX观察免疫印迹,进一步证实了在双边带组蛋白蛋白质的重组。一个小时的AF4预处理明显抑制ATR / Chk1 / p53 /γ-H2AX信号,表明保护作用的机制可能通过ATR-dependent方式。此外,我们还评价了AF4参与DNA修复机制。AF4略激活DNA-PKcs连同coexpression KU80蛋白质NNK-Ae-treated BEAS-2B细胞。DNA-PKcs主要提高NHEJ修复机制的激活4]。证实了这种效应的AF4使用dna - pk的抑制剂,NU7026。然而,更多的研究需要索赔DNA修复功效的AF4 NNK-Ae曝光。总体而言,我们的研究启示是第一步在评估苹果类黄酮在支气管上皮细胞对致癌物引起的氧化损伤。
总之,我们的研究表明,预曝光苹果类黄酮保护挑战BEAS-2B细胞免受各种致癌物质,特别是nicotine-derived亚硝胺酮,通过抑制DDR信号并启动DNA修复机制。进一步的研究也可以给见解理解AF4的有效成分,也可以作为潜在的治疗佐剂来减少各种细胞毒性、基因毒性化疗的副作用。
缩写
| AF4: | 苹果类黄酮分数 |
| ATM机: | 共济失调毛细血管扩张突变 |
| ATR: | ATM-Rad3-related |
| BEAS-2B: | 正常的人类支气管上皮细胞 |
| BEGM: | 支气管上皮细胞生长介质 |
| 分: | 检查点激酶 |
| DDR: | DNA损伤反应 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| dna - pk: | dna蛋白质激酶 |
| 双边带: | DNA双链断裂 |
| 人力资源: | 同源重组 |
| 如果: | 免疫荧光 |
| MDC1: | 介质的DNA损伤检验点1 |
| MTX: | 甲氨蝶呤 |
| NHEJ: | Nonhomologous结束加入 |
| 亚硝胺: | (4)- Methylnitrosamino 1 - (3-pyridyl-d4) 1-butanone |
| NNK-Ae: | NNK醋酸 |
| PI3K: | Phosphatidylinositol-3-kinase |
| ROS: | 活性氧物种。 |
的利益冲突
无利益冲突被宣布为作者在这篇文章。
作者的贡献
Vazhappilly Cijo乔治执行所有的实验,分析数据,并写了初稿的手稿。惠普Vasantha Rupasinghe是主要研究者设计了实验,导致了手稿。
确认
作者请确认提供的金融支持发现补助计划的自然科学和工程研究理事会(NSERC)加拿大(2016 - 05269),Mitacs-Accelerate程序(IT07444)和CoraMedical,多伦多,加拿大。作者还要感谢博士格雷厄姆Dellaire医学院,达尔豪斯大学的有价值的建议和支持建立和验证的γ-H2AX化验。