文摘
氨基甲酸乙酯(EC)是食品和环境毒物和关心人类接触的原因。一些研究表明,EC-induced毒性与氧化应激有关。据报道,桑椹果实广泛的生物活性化合物和药理活性。因此,本研究旨在调查的保护财产桑椹提取物(MFE) EC-induced细胞毒性和氧化应激。化学成分分析表明,MFE总酚含量和总类黄酮含量分别为502.43±5.10,219.12±4.45毫克QE / 100 g弗兰克-威廉姆斯。花青色素3点-葡萄糖苷和花青色素3点-rutinoside MFE主要花青素。在体外抗氧化研究(DPPH、abt和收紧化验)联合展出MFE的强有力的抗氧化能力。进一步的研究表明,MFE保护人类肝脏HepG2细胞清除过度繁殖细胞ROS EC-induced细胞毒性。EC处理促进了细胞内谷胱甘肽(GSH)的损耗,造成线粒体膜电位(MMP)崩溃,以及线粒体膜脂质过氧化作用,而MFE预处理明显抑制谷胱甘肽耗竭和恢复线粒体膜功能。总体而言,我们的研究表明,polyphenolic-rich MFE买得起一个强有力的保护EC-induced细胞毒性和氧化应激。
1。介绍
氨基甲酸乙酯(EC)主要存在于各种发酵食品、烟草和酒精饮料1]。各种动物研究表明,电子商务有一个潜在的诱导细胞毒性和基因毒性,进一步导致癌症发展(2,3]。由于它的致癌特性,电子商务分为一组2致癌物,国际癌症研究机构(IARC),指的是它可能致癌4]。尽管人类暴露在氨基甲酸乙酯通过食物和饮料是最低,人体接触氨基甲酸乙酯很长一段时间不能被忽视。
积累的证据表明EC-induced毒性可能与氧化应激相关的其次是增加和积累ROS (5]。因此,废除的氧化应激增加抗氧化防御可能被视为治疗EC-induced毒性的治疗工具。最近,许多研究都集中在自然生物活性分子存在于水果和蔬菜,因为这些天然生物活性化合物有可能减弱细胞氧化应激。据报道,例如,黑莓提取和消化Caco-2细胞免受氧化损伤引起的氨基甲酸乙酯(6)和蓝莓果多酚抑制氧化应激骨骼肌细胞损伤在体外(7]。这些研究给了我们一个想法是否饮食EC-induced细胞毒性和氧化应激可以改善通过食用水果和蔬菜。
桑树被列为一种同源性医学和食品在中国。大量的研究报道,桑树富含类黄酮、花青素给它一个强力的抗氧化活性(8,9]。此外,桑椹果实也被证明具有各种生物活性包括典型药物(10,11],降糖药[12),和抗炎作用13]。然而,至今为止罕见的研究集中在桑树水果和EC-induced细胞毒性之间的关系。因此,本研究旨在调查的影响桑椹提取物(MFE) EC-induced细胞毒性和阐明对EC-induced MFE氧化应激的保护机制。
2。材料和方法
2.1。化学品和材料
花青色素3点-葡萄糖苷,花青色素3点-rutinoside,天竺葵色素3点-苷、槲皮素3点-rutinoside(芦丁)、抗坏血酸,Folin Ciocalteu酚试剂,3 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)壬基吖啶橙(NAO)、赫斯特33258年2′,7′二乙酸-dichlorofluorescin (DCFH-DA),罗丹明123 (Rh123)和Naphthalene-2 3-dicarboxaldehyde (NDA)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。其他试剂均为分析纯。
2.2。桑椹果实
新鲜的黑桑椹果实(桑属阿尔巴来自中国浙江省,l .)获得。获取果实后,他们彻底清洗与无菌蒸馏水和干干净无尘的环境下阴凉处。进行分析、水果选择基于他们的一致性在颜色,形状,重量,和含水率。
2.3。样品制备
黑桑椹果实(1公斤)为分析选择单一化和被提取之后,加入3000毫升乙醇/水(70:30,v/v在黑暗中)在室温下1 h。提取过程重复两次。提取的混合物过滤和收集的样本。收集样本集中使用旋转蒸发在40°C减压下进行实验分析。
2.4。酚类化合物的分析
2.4.1。总酚类化合物分析
总酚含量(TPC)的桑椹提取物(MFE)是由Folin-Ciocalteu方法(14]。简单地说,0.6毫升的稀释MFE (1: 6,v/v、提取/蒸馏水)增加了0.1毫升Folin-Ciocalteu试剂和0.2毫升的碳酸钠溶液(15%)。混合物的吸光度为760 nm后跟2 h在室温下孵化。结果表示为毫克没食子酸当量(GAE) / 100克鲜重(FW)没食子酸作为参考标准TPC的量化。
2.4.2。类黄酮总量分析
总类黄酮含量(交通)MFE是由比色方法如前所述14]。总之,纳米0.04毫升的5%2和0.45毫升蒸馏水被添加到0.05毫升的MFE和孵化为5分钟。孵化时间后,0.04毫升的10%(没有3)3添加到反应混合物和孵化6分钟。此外,0.4毫升的4% (v/v)氢氧化钠和0.02毫升蒸馏水被添加到反应混合物和孵化15分钟。最后,孵化后吸光度测量在510海里。数据被表示为毫克槲皮素3点-rutinoside(芦丁)等价物(QE) / 100克鲜重(FW)作为槲皮素3点-rutinoside被用作参考标准量化的交通。
2.4.3。花色苷的高效液相色谱分析
花青素的MFE分析通过高效液相色谱二极管阵列检测器(美国ThermoFisher科学Dionex终极3000)使用Promosil C18柱(4.6×250毫米,5μ米)。1.5%的流动相由甲酸水(溶剂)和甲酸/乙腈/甲醇/水(1.5:22.5:22.5:48.5,v/v/v/v)(溶剂B)。一个线性梯度程序进行了如下:7 - 25%(溶剂B)从0到35分钟,25 - 65%(溶剂B)从35到45分钟,100%到65(溶剂B)从45 - 46分钟,100%的溶剂B从46到50分钟,和100年的7%(溶剂B)从50到57分钟紧随其后的是有7%的溶剂B为3分钟。10μL的样本注入,流量被设置为1.0毫升/分钟。发现花青素进行了520海里。定性和定量分析,花青素进行根据公布的数据和商业可用的标准(花青色素3点-葡萄糖苷,花青色素3点-rutinoside,天竺葵色素3点-配糖体)。
2.5。抗氧化性质MFE
2.5.1。彻底清除试验(DPPH)
使用DPPH自由基清除活性MFE评估(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil)作为一种自由基根据以前描述的方法用细微的修改8]。简单地说,20μL (MFE(不同浓度)添加到700年μL(0.1毫米DPPH乙醇溶液和混合物在室温下蒙在鼓里(30分钟)。吸光度测量517海里。DPPH自由基清除率(%)为每个MFE浓度计算使用以下公式:
维生素C作为一个积极的控制。因此,MFE DPPH自由基清除活性的表达为维生素C等价物(毫克/ g(鲜重)。
2.5.2。abt MFE的自由基清除活性
abt自由基阳离子(abt+)分析方法(8)用来评估MFE的自由基清除活性。稳定的abt原液激进的阳离子是由添加10毫升的7毫米2、2-azobis (2-amidinopropane)盐酸盐179毫升140毫米水过硫酸钾,,混合物在室温下孵化12 h在黑暗中。然后,股票的解决方案是用蒸馏水稀释20倍的abt做准备+工作的解决方案。20μ与700年L (MFE添加μL abt+·工作方案和孵化6分钟在黑暗中在室温下。减少吸光度测量在734海里。abt彻底清除率(%)为每个MFE浓度计算使用公式(1)。维生素C作为一个积极的控制。MFE abt自由基清除活性的表达为维生素C等价物(毫克/ g(鲜重)。
2.5.3。铁降低抗氧化能力(捆牢)
铁减少MFE活动是由收紧试验根据文献中描述的方法用细微的修改(15]。收紧试剂是由混合10毫升的更易与L TPTZ解决方案,10毫升20 L FeCl更易3,100毫升300更易与醋酸/ L缓冲区(pH值3.5)。20μ在37°C L (MFE孕育了30分钟紧随其后的700年μL收紧的解决方案,和吸光度测量在593海里。结果表示为维生素C等价物(毫克/ g(鲜重)。
2.6。细胞培养和治疗
人类肝脏HepG2细胞从细胞库获得中国科学院的文化类型的集合。细胞在DMEM培养基培养(Gibco)包含10%的牛血清,100单位/毫升青霉素、链霉素和100单位/毫升。5%的细胞在湿润的气氛中孵化有限公司2在37°C。根据不同的实验,为对照组,HepG2细胞缺乏EC和MFE孵化。电子商务集团,与EC细胞孵化24 h,而治疗组,细胞与MFE preincubated 24 h, EC暴露前24 h。
2.7。细胞生存能力分析
MTT分析是用来确定EC和MFE细胞生存的影响根据前面描述的方法(16]。HepG2细胞被播种到96孔细胞培养板、浓度为3.5×103细胞/。EC准备的原液的浓度1 M×溶解在去离子水。对照组,HepG2细胞缺乏EC和MFE孵化。EC集团与EC细胞孵化24 h,而治疗组,细胞与MFE preincubated 24 h, EC暴露前24小时。随后,细胞与肝癌和0.5毫克/毫升的孵化4 h。孵化后,上层的移除,形成甲瓒沉淀溶解了150μDMSO的L。光密度测量在使用M200 Tecan无限标490海里。
2.8。测量细胞内活性氧(ROS)
细胞内活性氧的生产使用oxidation-sensitive测量荧光探针DCFH-DA如前所述[17]。简而言之,HepG2细胞浓度为2.5×104细胞/被播种到24-well细胞培养板和培养24小时。然后,培养细胞洗了PBS和preincubated MFE在不同浓度(0.5毫克/毫升,1毫克/毫升,和2毫克/毫升)6 h。随后,这些细胞被孵化24小时的EC(60毫米)。MFE和EC处理后,细胞收获和PBS洗然后用10孵化μ在37°C M DCFH-DA 30分钟。与PBS细胞被洗了三次,立即ROS的感应是通过荧光显微镜检查。图像被认为从六个不同的微观领域,光纤和结果表示为荧光强度计算图像分析软件ImageProPlus6.0(媒体控制论Inc .)。
2.9。赫斯特33258年核染色分析
荧光探针赫斯特33528年用于核染色根据前面描述的方法(18]。隔夜培养后HepG2细胞浓度为2.5×104细胞/在24-well板,细胞治疗与不同浓度的MFE(0.5毫克/毫升,1毫克/毫升,和2毫克/毫升)前24小时他们孵化与EC(60毫米)。24小时孵化后,细胞被洗了三次与PBS和孵化10μ在37°C 33258赫斯特在黑暗中30分钟。然后,细胞被洗PBS和细胞与荧光显微镜检查。
2.10。测定细胞谷胱甘肽(GSH)
细胞谷胱甘肽检测、HepG2细胞治疗与不同浓度的MFE(0.5毫克/毫升,1毫克/毫升,和2毫克/毫升)24 h与EC孵化前24小时(60毫米)。然后,这些细胞被洗50 PBS和孵化μM NDA为30分钟37°C。其次是孵化与荧光探针、细胞与PBS洗去除游离荧光探针荧光显微镜下观察,然后立即评估。
2.11。测定线粒体膜电位
线粒体膜电位(MMP)测量根据前面描述的方法(19]。简而言之,HepG2细胞孵化24 h和EC(60毫米)的存在与否MFE(0.5毫克/毫升,1毫克/毫升,和2毫克/毫升)。然后,这些细胞被孵化在37°C与Rh123 30分钟(10μg / mL)。其次是孵化,这些细胞被洗了三次PBS和荧光显微镜下立即分析。结果表示为意味着Rh123荧光强度。
2.12。流仪测定线粒体膜电位(Ψ米)
MMP进一步确定使用流式细胞仪根据前面描述的方法(20.]。短暂,HepG2细胞被播种在6厘米细胞培养菜1×10的密度6每道菜24 h。然后,MFE(1毫克/毫升和2毫克/毫升)被添加到每道菜24 h,紧随其后的是60毫米EC 24小时。洗后用PBS三次,HepG2细胞通过离心收集然后孵化Rh123荧光探针为30分钟。这些细胞被洗了三次以去除荧光探针和没有phenolsulfonphthalein悬浮在细胞培养基。HepG2细胞的荧光强度是由gallio™流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特)。
2.13。检测线粒体膜脂质过氧化作用
线粒体脂质过氧化作用是决定如前所述14]。总之,HepG2细胞孵化与EC(60毫米)24小时的存在与否MFE(0.5毫克/毫升,1毫克/毫升,和2毫克/毫升)。孵化后,这些细胞被洗和孵化为30分钟37°C和10μM NAO。最后,这些细胞被洗了三次立即与PBS和荧光显微镜下观察。结果表示为意味着NAO荧光强度。
2.14。统计分析
所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)至少三个独立的实验,分析了单向方差分析使用SPSS(19.0版)。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。分析桑椹提取物中酚类化合物(MFE)
浆果,富含酚酸等酚类化合物、类黄酮、花青素和各种生物活性如抗氧化活性与这些酚类化合物。因此,总酚含量和总类黄酮含量桑椹提取物(MFE)第一次被确定。如表所示1GAE,总酚含量为502.43±5.10毫克/ 100克弗兰克-威廉姆斯和总类黄酮含量为219.12±4.45毫克QE / 100 g弗兰克-威廉姆斯。相比之下,一些浆果像草莓21),黑莓(21,蓝莓22),和树莓23),桑椹果实中酚类化合物的含量要高得多。因此,桑椹果实可以看作一种膳食补充剂的酚类化合物的良好来源。在目前的研究中,原料的水分桑椹提取物(MFE)是86.22±0.11%。花青素,是一种酚类化合物,具有强大的抗氧化活性。在目前的研究中,花青素的类别和内容在MFE识别和衡量高效液相色谱与相关标准。在图1所示,三个山峰色谱在520海里;他们被确认为花青色素3点-葡萄糖苷(1)峰值,花青色素3点-rutinoside(2)峰值,天竺葵色素3点-葡萄糖苷(最高3)基于相应的标准,公布的数据24]。其内容分别为81.36±2.05毫克/ 100克弗兰克-威廉姆斯,36.05±1.14毫克/ 100克弗兰克-威廉姆斯,和12.46±0.65毫克/ 100克弗兰克-威廉姆斯在序列。我们可以看到,花青色素3点-葡萄糖苷和花青色素3点-rutinoside占领MFE总花青素的一大部分。根据我们的研究结果,可以得出结论,MFE富含酚类化合物,可以赋予它一个强有力的抗氧化活性。
(一)
(b)
3.2。抗氧化活性的MFE
其次是MFE测定酚类化合物,我们接下来对MFE的抗氧化活性进行了研究。自从MFE富含不同的多酚类物质,一个方法确定抗氧化活性不能给出一个综合预测的抗氧化能力。因此,三个在体外DPPH等化验分析、abt化验和收紧试验被用来确定MFE基于不同的抗氧化活性机制(25),和维生素C作为积极的控制。从表中我们可以看出2基于能力降低铁离子亚铁形式(收紧试验),MFE显示明显的铁还原能力(2.54±0.08毫克VCE / g弗兰克-威廉姆斯),表明它有一个潜在的抗氧化活性。其次是收紧化验,我们进一步分析了MFE用DPPH的抗氧化活性和abt化验。符合铁还原能力,MFE表现出类似的抗氧化能力(2.45±0.15毫克VCE / g FW)清除DPPH自由基,而对于abt化验,桑树水果的抗氧化活性每克等于3.69±0.05毫克VCE,证明abt激进更敏感比DPPH自由基或暴露在MFE铁离子。结合上述的结果,可能得出的结论是,丰富的酚类化合物的存在MFE导致他们的抗氧化潜力。事实上,酚类化合物是由一个或多个芳环具有一个或多个羟基,因此能够猝灭自由基的形成共轭苯氧基自由基(上26]。
3.3。保护作用的MFE EC-Induced HepG2细胞的细胞毒性
人类的肝脏HepG2细胞被用来调查针对EC-induced MFE细胞毒性的保护作用。如数据所示2(一个)和2 (b)HepG2细胞孵化与EC仅显示减少细胞浓度的方式生存,而没有减少细胞生存能力与MFE观察治疗(0.5毫克/毫升,1毫克/毫升,和2毫克/毫升)仅与控制(细胞生存能力定义为100%)。MTT结果的基础上,集中60毫米的EC和三个梯度浓度(0.5毫克/毫升,1毫克/毫升,和2毫克/毫升)的MFE被用于后续的实验。为了评估MFE的保护作用,HepG2细胞进行预处理与MFE 24小时然后用60毫米的EC孵化24小时,其次是MTT试验。如图2 (c)与对照组的细胞生存能力相比,其他组的细胞的异常(EC-treated组)、71.18%±2.27% 83.61%±7.64%(1毫克/毫升MFE-treated组)和89.18%±2.49%(2毫克/毫升MFE-treated集团),表明MFE治疗(1毫克/毫升和2毫克/毫升)提供一个保护EC-induced细胞毒性。与我们相比之前的研究(5,6),MFE比覆盆子提取和黑莓提取提供保护EC-induced毒性。之前的研究结果显示,电子商务可以代谢高度活跃的环氧化物的形式像环氧乙烯基氨基甲酸酯,这可能最终导致DNA损伤的DNA加合物形式(27]。因此,我们调查了MFE预处理是否能够保护从EC-induced HepG2细胞基因毒性。赫斯特33258年,荧光探针可以敏感地绑定到adenine-thymine网站的DNA,用于评估EC-induced基因毒性。可以看到从图2 (d),EC-induced基因毒性观察基于核染色的比例仅在与EC细胞治疗与控制和MFE预处理细胞。细胞核呈现更多的细胞的数量是用亮蓝色点仅在细胞治疗EC表明DNA损伤,染色质凝结或核分裂,而HepG2细胞进行预处理与MFE显示细胞的数量减少与明亮的蓝色圆点证明MFE预处理提供保护EC-induced HepG2细胞的细胞毒性。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。MFE提供保护EC-Induced ROS生产
增加证据中,外源性物质引起的细胞毒性与氧化应激(28]。这进一步好奇我们EC-induced细胞毒性是否与生产过剩和活性氧的积累。因此,细胞HepG2细胞ROS水平随后EC-incubation光纤是由荧光测定。如数据所示3(一个)和3 (b),水平细胞HepG2细胞ROS孵化与欧共体就显著增加意味着DCF荧光强度达到157.10%±2.35%,表明ROS EC孵化后过度生产和积累。有趣的是,预处理和1毫克/毫升的MFE和2毫克/毫升的MFE使光纤的平均荧光强度恢复到125.42%±9.53%和114.83%±14.39%,分别,这表明,过度繁殖ROS MFE孵化后回收。这一发现表明,EC-induced细胞毒性与生产过剩的活性氧和MFE提供保护EC-induced通过阻止细胞毒性在HepG2细胞ROS生产过剩和积累。
(一)
(b)
3.5。在HepG2细胞MFE抑制谷胱甘肽耗竭
谷胱甘肽(GSH)的最丰富的细胞抗氧化剂中扮演一个重要的角色在维持细胞氧化还原平衡29日]。要仔细考虑,我们评估是否EC孵化可能导致HepG2细胞谷胱甘肽耗竭和调查的保护作用对谷胱甘肽耗竭MFE NDA荧光探针。如数据所示4(一)和4 (b)NDA-stained细胞被大大减少(NDA荧光强度是64.04%±6.04%),单独与EC细胞被孵化。然而,NDA染色显著增加在1毫克/毫升的MFE-treated细胞和2毫克/毫升MFE-treated细胞(意思是NDA荧光强度74.56%±4.74%和84.18%±5.10%,职责),这表明EC-induced细胞毒性与谷胱甘肽耗竭,MFE可以恢复细胞内谷胱甘肽从而保持细胞氧化还原平衡提供力量。
(一)
(b)
3.6。MFE阻止EC-Induced线粒体膜损伤
3.6.1。MFE废除EC-Induced线粒体膜电位的崩溃
线粒体ROS生成的主要网站,生产过剩的活性氧与MMP的崩溃(30.]。上述研究结果使我们探索MFE反对EC-induced细胞毒性的保护作用是否与MMP的崩溃。罗丹明123 (Rh123),亲脂性的阳离子染料,可以绑定到内心的线粒体膜紧随其后进入线粒体,线粒体内,进一步,保留基于负MMP [20.]。因此,我们未来使用Rh123 MMP的决定。如数据所示5(一个)和5 (b),Rh123荧光强度(平均荧光强度为71.71%±5.83%)相比,EC治疗后明显下降,对照组(荧光强度的100%),表明降低MMP随后治疗EC孤单。然而,MFE预处理(2毫克/毫升)显著预防EC-induced MMP的下降,平均荧光强度达到95.60%±6.98%。
(一)
(b)
(c)
紧随其后的是荧光显微检测MMP的崩溃,流式细胞术结合Rh123染色进一步用来证实EC-induced MMP的改变。正如预期的那样,与对照组相比,细胞MMP损失的比例从5.81%上升到17.54% EC治疗后,这表明EC MMP的可能导致明显降低。同样的,当使用1毫克/毫升和2毫克/毫升的MFE 24 h,细胞MMP损失的比例下降到12.72%和5.91%,分别为(图5 (c))。这些结果共同表明,MFE能有效地改善EC-induced MMP的减少。
操作。MFE抑制EC-Induced线粒体膜脂质过氧化作用
另一个破坏性影响线粒体ROS的膜脂质过氧化作用[31日]。线粒体脂质氧化膜会导致形成活性脂质亲电试剂;因此,活性氧引起的脂质过氧化反应与氧化还原状态的改变在肝细胞癌(32]。自EC处理拒绝MMP其次是生产过剩的活性氧中观察到上述结果,因此我们研究电子商务是否能诱导脂质过氧化反应在HepG2细胞的线粒体。NAO荧光探针用于检测心磷脂,一个主要的线粒体膜脂质成分发生氧化降解的ROS的存在(20.]。HepG2细胞治疗EC单独显示,平均荧光强度显著下降(65.83%±3.03%)与对照组(100%)。相比之下,细胞使用1毫克/毫升或2毫克/毫升的MFE意味着NAO荧光强度有显著提高。的保护作用2毫克/毫升的MFE抑制EC-induced线粒体膜脂质过氧化作用等于对照组(数字6(一)和6 (b))。我们的研究结果表明,MFE表现出良好的性能在抑制EC-induced线粒体氧化损伤。
(一)
(b)
4所示。结论
总之,目前的研究公布,polyphenolic-rich MFE能够发挥潜力对乙基carbamate-induced细胞毒性的保护作用。我们的研究结果表明,MFE富含茶多酚和总酚含量和总类黄酮含量达到502.43±5.10,219.12±4.45毫克QE / 100 g弗兰克-威廉姆斯,分别。进一步表明花青色素高效液相色谱分析3点-葡萄糖苷和花青色素3点-rutinoside主要花青素。在体外研究抗氧化活性相关(DPPH、abt和收紧化验)表示,MFE是一种有效的抗氧化剂。此外,MFE被发现拥有强大的能力来保护人类的肝脏从EC-induced HepG2细胞细胞毒性通过清除过度繁殖细胞ROS。更重要的是,我们的研究结果证明了MFE反对EC-induced细胞毒性的保护作用是通过抑制谷胱甘肽耗竭,MMP的崩溃,线粒体膜脂质过氧化作用。总之,我们的结果表明,桑椹提取物能够负担得起保护EC-induced细胞毒性,氧化应激通过其抗氧化性质。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持由中国国家关键技术研发项目(没有。2016 yfd0401201),中央大学的基础研究基金(2017 qna6006),浙江省教育部门和研究基金会(Y201328143)。