的保护角色ROS-Mediated Mitophagy^125年我在HCT116细胞种子辐射诱导细胞死亡

文摘

对于许多不可切除的癌和局部复发癌症领头的),^125年我的种子近距离放射疗法是一种可行的、有效的和安全的治疗。多项研究表明,^125年我的种子辐射产生抗癌活动引发DNA损伤。然而,最近的证据显示线粒体质量细胞命运的另一个关键决定因素,与mitophagy控制机制发挥着核心作用。在此,我们发现^125年我种子辐照线粒体受伤,导致显著升高线粒体和细胞内ROS(活性氧)水平HCT116细胞。线粒体活性氧的积累增加HIF-1的表达α和它的目标基因BINP3 NIX (BINP3L),后来mitophagy触发。重要的是,^125年我的种子辐射诱导mitophagy HCT116细胞凋亡促进细胞生存和保护。这些结果表明^125年我种子辐射引发mitophagy上调ROS水平,促进细胞内环境稳态和生存。目前的研究发现mitophagy的至关重要的作用在调节肿瘤细胞对放射治疗的敏感性,建议化疗针对mitophagy可能改进的效率^125年我种子放射治疗,这可能是肿瘤治疗的临床意义。

1。介绍

由于其低并发症率和高efficacy-which相当的激进手术和体外放射疗法^125年我种子植入近距离放射疗法已经成为最受欢迎的许多不可切除的癌和局部复发的癌症的治疗方法(1- - - - - -7]。一系列的研究探索的分子机制^125年我的种子辐射产生抗癌活性。大多数研究都集中在细胞凋亡和细胞周期阻滞接触后造成DNA损伤^125年我的种子辐射(8- - - - - -10]。然而,有越来越多的证据表明,线粒体,占到总数的30%细胞体积,也可能是重要的核外介质辐射的细胞毒性效应(11,12]。健康的线粒体作为大国,能源生产细胞功能通过三羧酸循环(三羧酸循环)和氧化磷酸化13]。线粒体损伤可导致细胞死亡和各种各样的其他问题(14]。

Mitophagy,指的是选择性清除受损或多余的线粒体,线粒体质量控制是至关重要的压力如饥饿后,照片损坏,缺氧,ROS生产(15]。某些生理应力可以引起线粒体损伤,可导致氧化应激和细胞死亡引发了ROS的产生从线粒体电子传递链(等)。高水平的活性氧可以选择性地隐藏在自噬体和被溶酶体降解过程称为mitophagy促进细胞内环境稳态和生存(16]。Mitophagy可以减轻细胞损伤后的压力,作为一个有效的抗氧化途径和结算增加线粒体和胞质ROS。Mitophagy被报道参与抗肿瘤治疗,维持健康的线粒体(17,18]。

Mitophagy是由特定的受体,如无BNIP3, FUNDC1在哺乳动物系统(19]。BNIP3和拒绝是两个重要的线粒体与同源性压力传感器BCL2 BH3域。一旦触发mitophagy, BNIP3和无选择性地招募了线粒体功能失调,然后绑定到守恒LC3-interacting地区(LIR) LC3-II出现在自噬体促进移除受损的线粒体自噬小体的(16,20.,21]。此外,BNIP3和NIX促进mitophagy通过促进释放的Beclin1 Beclin1-Bcl2 / Bcl-X复杂[22]。NIX和BNIP3低蛋白质目标线粒体autophagosomal退化,是转录HIF-1的产物α(23]。HIF-1α是一个重要的预测肿瘤恶化的几种类型的固体癌症和可以调节的转录基因的数量(如BNIP3和女水妖)参与mitophagy和细胞凋亡24]。多项研究表明,线粒体ROS增加HIF-1的表达升高α和它的目标基因BNIP3 / NIX [17,25]。

在目前的研究中,我们关注的监管角色自噬在肿瘤的放射敏感性^125年我的种子辐照以及背后的分子机制^125年我的种子辐射诱导mitophagy。我们发现mitophagy显著降低肿瘤细胞的敏感性^125年我的种子辐照。因此,针对mitophagy结合放射治疗在临床肿瘤患者可能提高治疗效率,需要临床研究的证实。

2。材料和方法

2.1。^125年我辐射源

的^125年我种子作为辐射源在本研究从宁波购买君安制药技术公司(宁波、哲江省,中国),安装在内部实验室体外模型^125年我的种子辐射。早些时候发表的这个模型的详细描述(26,27]。^125年我的种子~ 59.4天的半衰期。适用的实验辐射剂量率^125年我种子范围从2.77 cGy /小时1.385 cGy / h,近似于领头永久使用的临床适用的辐射剂量率近距离放射疗法。这个模型验证利用热释光的剂量测定法(TLD)测量和辐照时间计算根据吸收剂量和初始辐射剂量率。控制细胞被播种和收获在同一时间点辐照细胞。

2.2。试剂和抗体

膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备我从北京买了Zoman生物技术(中国,北京);ROS的试验装备和线粒体膜电位测定装备JC-1买来Beyotime(中国上海);线粒体ROS指示器MitoSOX从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德);防治(NAC)和氯喹(CQ)从Sigma-Aldrich购买;3-methyladenine (3-MA)从Selleck购买化工有限责任公司(美国休斯顿,德克萨斯州);Ly294002从英杰公司购买;抗霉素A从Sigma-Aldrich购买。LipofectamineTM 2000年从英杰公司购买。Diphenyleneiodonium氯(DPI)从基因操作购买有限公司有限公司(无锡,中国)。互补脱氧核糖核酸逆转录工具包和实时PCR设备购买从豆类生物技术(中国大连); and goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP), goat anti-mouse IgG-HRP, anti-β肌动蛋白,anti-LC3从Sigma-Aldrich获得多克隆抗体。

2.3。细胞培养

人类大肠癌cells-HCT116细胞请小娟杜博士提供的北京大学健康科学中心,北京,中国。HCT116细胞生长在RPMI(罗斯威尔公园纪念研究所)1640中补充10%胎牛血清(FCS)、青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素,在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂在37°C。

2.4。单独生存分析

HCT116细胞在适当的数字被播种在35毫米菜肴,以确保每道菜100殖民地的形成。24小时后,细胞接触^125年我的种子辐照在模型中。在理想的时间点,细胞远离辐射源和培养10 - 12天(28]。然后他们被固定与绝对乙醇和冰醋酸1:1比4°C 30分钟,与亚甲蓝染色2小时。最后,样本用冷洗净磷酸盐(PBS)和在室温下干燥。殖民地每道菜的数量清点,生存分数(SF)计算聚乙烯(测试组)/ PE (0-Gy组),在PE(菌落数/接种细胞的数量)×100%。重复的实验重复两次。生存分数的平均数±标准差值提出了各自的辐射剂量。

2.5。免疫印迹分析

细胞细胞溶解在一次电台免疫沉淀反应试验(里帕)缓冲区(50 mM的ph - 7.4 Tris-HCl, NP-40 1%, 0.25% Na-deoxycholate, 150毫米氯化钠,ph值和1毫米- 7.4 EDTA)蛋白酶和磷酸酶抑制剂在冰上鸡尾酒15分钟,然后在12000年离心机30分钟和4°C。Bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验用品(Beyotime生物科技、上海、中国)被用来测量蛋白质浓度的上层清液。等量的蛋白质样本在95°C变性5分钟然后分开十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)凝胶。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(Hybond-P;Amersham,白金汉郡,英国)2小时在100 V冰。膜被封锁在Tris-buffered盐水与5%脱脂牛奶,渐变20 (TBST) 1小时在室温下然后孵化一夜之间在4°C表示主要抗体。与TBST洗涤三次后,与相应的二次抗体膜被涂抹在室温下1小时。膜是孵化与增强化学发光(ECL)检测试剂盒(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)可视化蛋白质。人类的表达β肌动蛋白检测加载控制。

2.6。流式细胞术分析

2.6.1。流式细胞术分析细胞凋亡

后暴露于辐射的2 Gy, HCT116细胞收获和double-stained与异硫氰酸荧光素(FITC)标签膜联蛋白V和propidium碘(π)15分钟绑定缓冲根据制造商的指示来检测细胞凋亡。然后,荧光是由流式细胞术检测(美国贝克曼库尔特、迈阿密、FL)检测细胞凋亡的比例。

2.6.2。流式细胞术分析细胞内活性氧和线粒体ROS

ROS分析工具被用来评估细胞内ROS水平。后暴露于2 Gy辐射附着HCT116细胞被洗无血清RPMI 1640中,沾染了5μ在37°C M DCFH-DA 30分钟。然后,贴上HCT116细胞使胰蛋白酶化并通过流式细胞术分析。

MitoSOX™红色线粒体超氧化物选择性指标目标检测线粒体ROS线粒体。辐照后附着HCT116细胞用无血清RPMI 1640中孵化和10μM MitoSOX红线粒体超氧化物指标在37°C 30分钟。在治疗后,HCT116细胞使胰蛋白酶化并通过流式细胞术分析。

2.6.3。流式细胞术分析线粒体膜电位

十万年HCT116细胞照射后与PBS收集和清洗一次。线粒体膜电位检测通过流式细胞术使用与JC-1线粒体膜电位分析工具。在正常情况下,JC-1线粒体基质中积累的形式J-aggregates,发出红色荧光;然而,当线粒体膜电位的崩溃,JC-1存在单体,不能进入线粒体,发出绿色荧光。JC-1红色信号的比值(J-aggregates) JC-1绿色信号(单体)被用作衡量线粒体膜电位。数据分析了FCS表达V3软件(新创软件,格兰岱尔市、钙、美国)。

2.7。免疫荧光分析

细胞培养在35毫米菜盖玻片。在剂量的表示^125年我种子辐照细胞被固定为4%甲醛在PBS 15分钟37°C。固定细胞permeabilized 0.2% Triton x - 100在冰上PBS 15分钟,随后被山羊血清。孵化后主要抗体在一夜之间在4°C, LC3和TIM23检测与多克隆对TIM23 anti-LC3抗体和单克隆抗体,分别。LC3发现FITC -(异硫氰酸荧光素)共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白。TIM23贴上TRITC -(异硫氰酸Tetramethylrhodamine)共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白。核沾染了4′,6-diamidino-2-phenylindole (Beyotime,中国)。荧光图像捕获LSM 510蔡司共焦显微镜(德国卡尔蔡司耶拿)。

2.8。检测细胞ATP水平

萤火虫luciferase-based ATP测定工具包(Beyotime,中国)是用来测量细胞ATP水平。暴露于辐射的2 Gy之后,HCT116细胞细胞溶解和离心机,享年12000岁5分钟。细胞溶解产物(100μ与100年L)涨跌互现μL ATP检测工作在96孔板稀释,和细胞ATP水平测量使用BioTek协同2标仪(美国Winooski BioTek仪器公司,VT)。BCA分析工具被用来确定细胞溶解产物(1的蛋白质浓度μ每组的L)。细胞ATP水平蛋白质浓度的比率是用来评估总ATP水平。

2.9。逆转录和实时PCR

从细胞总RNA提取使用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示,和1μ克总RNA用于反向转录的互补。实时PCR进行使用多个包(SYBR预混料TaqTM交货、DRR041A,豆类Bio)在CFX96 (Bio-Rad、大力神、钙、美国)29日]。管家基因次黄嘌呤phosphoribosyl转移酶(产生HPRT)作为内生控制。以下引物被使用:产生HPRT上游引物5′cag答AAT CCA亚美大陆煤层气有限公司ATG GTC AA-3′和产生HPRT下游引物5′-TTA GGC TTT GTA TTT TGC TTT TCC-3′;太极拳TGG BNIP3上游引物5′cag GGC GTA棉酚CT-3′和BNIP3下游引物5′cta CTC CGT CCA广汽柠檬酸TGC-3′;TCG NIX上游引物5′atg太极拳CAC CTA GTC GAG-3′和NIX下游引物5′tga GGA TGG TAC GTG TTC CAG-3′;HIF-1α上游引物5′棉酚CGT CGA AAA棉酚亚美大陆煤层气有限公司TCT CG-3′,和HIF-1α下游引物5′有条件现金转移支付乙CAA手枪GCG AAC柠檬酸CA-3′。

2.10。细胞转染

LC3-specific siRNAs(小干扰RNA) (5′-GAGUGAGCUCAUCAAGAUAtt-3′)和一个不相关的控制核(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′) (30.]合成了GenePharma有限公司,击倒LC3的表达式。HCT116细胞转染和100海里蛋白LC3 siRNA nonrelated控制核。转染进行LipofectamineTM 2000按照制造商的指示。

2.11。统计分析

实验至少重复三次。统计分析使用统计软件SPSS 17.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。的双尾以及应用于比较组的意思。统计学意义是。

3所示。结果

3.1。抑制自噬增强肿瘤细胞的敏感性^125年我的种子辐射

探讨自噬如何影响肿瘤细胞的放射敏感性,单独生存分析进行评估的响应^125年我的种子辐射和没有与自噬抑制剂预处理。与自噬抑制剂3-MA HCT116细胞进行预处理(0.5毫米)或Ly294002 (10μ米)2小时之前接触2和4 Gy^125年我的种子辐射。幸存的分数之间的比率3 ma组和对照组分别为0.81,0.48总剂量的2和4 Gy,分别(图1(一))。更重要的是,幸存的分数Ly294002和对照组之间的比值分别为0.83和0.59的总剂量的2和4 Gy,分别(图1 (b))。我们发现单独使用显著降低HCT116细胞存活分数使用3-MA或Ly294002 2和4 Gy (),这表明这些自噬抑制剂对HCT116机体效应细胞。无论是3-MA还是Ly294002是特定的自噬抑制剂。我们进一步调查是否击倒LC3的表情,保守基因所需哺乳动物的自噬,HCT116细胞的辐射敏感性的影响。单独生存分析被用来评估的响应^125年我的种子辐射与蛋白LC3 siRNA转染后或nonrelated控制核双工。LC3的表达与蛋白LC3 siRNA HCT116细胞转染双nonrelated控制核组相比显著降低(图1 (c))。辐照后幸存的分数之间的比率蛋白LC3 siRNA集团和nonrelated控制核分别为0.66,0.51,总剂量的2和4 Gy,分别。我们发现击倒LC3的敏化HCT116细胞表达^125年我在2和4种子辐射Gy (,图1 (d)),这表明自噬抑制机体的影响HCT116细胞。

3.2。抑制自噬促进了细胞凋亡引起的^125年我的种子辐射

在先前的研究中,我们已经表明^125年我在结直肠癌细胞种子辐射诱发细胞凋亡。检查是否增强辐射敏感度的自噬抑制剂是由于细胞凋亡增加,凋亡细胞的比例是衡量双染色膜联蛋白V和π通过流式细胞术和化验。我们发现,π的比例⁻/膜联蛋白V⁺和π⁺/膜联蛋白V⁺细胞群在HCT116细胞治疗后从13.9%上升到19.5%^125年我的种子辐射+自噬抑制剂3-MA (,数据2(一个)和2 (b))。确认这种现象,同样的实验重复与自噬抑制剂Ly294002代替3 ma(图2 (c))。细胞凋亡的比例从19.1%上升到30.1%,细胞治疗^125年我的种子辐射+ Ly294002 (,图2 (d))。我们进一步调查是否蛋白LC3 siRNA HCT116细胞诱导的细胞凋亡的影响^125年我的种子辐射。与小干扰rna双LC3,转染后引起的凋亡细胞的百分比^125年我的种子辐射从10.41增加到15.77 (,数据2 (e)和2 (f))。这些结果表明,抑制自噬的敏感性增加^125年我的种子辐射通过增强细胞凋亡。

3.3。^125年我在肿瘤细胞辐射诱导Mitophagy种子

调查是否^125年我种子辐射可以诱导自噬在HCT116细胞,LC3-I和LC3-II用作估计自噬的诱导自噬标记和整体自噬流量允许正确的解释结果。与anti-LC3抗体进行免疫荧光染色后HCT116细胞暴露于0,0.5,1和2的Gy^125年我的种子辐射(图3(一个))。如图3 (b),LC3标点符号的数量每个细胞接触后逐渐增加0,0.5,1和2的Gy^125年我的种子辐射。免疫印迹分析,执行检查可溶性LC3的变换(LC3-I) LC3-II形式,表明LC3-II比LC3-I治疗后逐渐增加剂量的表示^125年我的种子辐射(图3 (c))。这提供了进一步的证据^125年我的种子辐射剂量依赖性的方式诱导自噬HCT116细胞。

自噬涉及两个关键过程:自噬小体的形成和自吞噬泡的形成。在初始阶段,膜远离高尔基体或ER扣押蜂窝组件形成自噬体。相对后期的自噬,自噬体与溶酶体融合形成一个自吞噬泡,LC3-II和隔离蜂窝组件被溶酶体水解酶降解[31日- - - - - -33]。LC3-II的积累有两个原因:一是增加自噬体形成的,另一个是抑制自吞噬泡的形成是退化的网站自噬体(34]。识别这两种机制负责自噬引起的^125年我种子辐射,然后,我们调查是否LC3-II水平升高是由于自噬体形成的upregulation或逃避autophagosome-lysosome融合。氯喹(CQ),充当晚期自噬抑制剂通过阻断autophagosome-lysosome融合,是用于治疗辐照HCT116细胞收获前6小时,共焦显微镜下检查和细胞(图4(一))。正如所料,治疗与CQ可以进一步增加LC3-II标点符号的数量每细胞引起的^125年我的种子辐射(,图4 (b))。此外,完整的细胞溶解产物从治疗细胞被免疫印迹分析并联在同一时间。结果表明:CQ可以进一步提高LC3-II比LC3-I诱导的^125年我的种子辐射(图4 (c))。这些建议^125年我种子辐射诱导LC3-II标点积累的增加是由于自噬小体的形成,而不是抑制lysosome-autophagosome融合。

我们还利用电子显微镜,检测自噬的黄金标准,是否进行调查^125年我在HCT116细胞种子辐射诱导自噬。透射电子显微镜(TEM)分析显示,大量的线粒体在autophagosome-like空泡在细胞质中出现2 Gy^125年我的种子辐射(图5(一个))。这一现象与免疫荧光分析的结果是相一致的。暴露于2 Gy^125年我种子辐射,这些细胞被双与anti-TIM23抗体间接免疫荧光染色法(红色)和一个anti-LC3抗体(绿色)检测线粒体标记蛋白质TIM23和自噬体标记蛋白LC3,分别。共焦图像显示LC3标点符号与后与线粒体^125年我的种子辐射。除此之外,这个colocalization诱导^125年我和CQ种子辐射治疗后显著增加,这可能会阻止autophagosome-lysosome聚变放大自噬(图5 (b))。这些结果进一步支持^125年我种子辐射诱导健壮mitophagy通过促进自噬小体的形成。

3.4。^125年我的种子辐射受损的线粒体和诱导氧化应激

研究是否^125年我种子辐射可以引起线粒体损伤,我们进行一系列的指标,可以反映线粒体功能障碍。与anti-TIM23抗体进行免疫荧光染色检测线粒体蛋白质TIM23标志。荧光共焦图像显示^125年我种子辐射诱导线粒体形态的变化,改变它的细长的线性网络形式和绒球的点形成(图6(一))。此外,线粒体膜电位与流式细胞术分析(图6 (b));我们发现^125年我的种子辐射线粒体功能受损和诱导线粒体膜电位下降(,图6 (c))。

据报道,线粒体功能障碍引起的辐射导致减少ATP合成由于中断整个线粒体膜的质子梯度(35,36]。我们下一个调查是否^125年我的种子辐射诱导的线粒体功能障碍导致ATP产量变化。细胞ATP水平评估了萤火虫luciferase-based ATP检测设备;结果显示总ATP水平显著降低^125年我的种子辐射(,图6 (d))。在暴露于2 Gy^125年我种子辐射,细胞染色和线粒体ROS进行流式细胞术分析(图6 (e))。结果表明,^125年我种子辐射水平升高线粒体ROS HCT116细胞(,图6 (f))。同样,辐照后细胞被染色的细胞内ROS探测和分析通过流式细胞术(图6 (g))。结果表明,^125年我种子辐射水平升高的细胞内ROS HCT116细胞(,图6 (h))。在一起,这些数据表明^125年我的种子辐射诱导线粒体的氧化损伤。

3.5。ROS升高Mitophagy和引起的细胞凋亡是至关重要的^125年我的种子辐射

有越来越多的证据表明,氧化应激是负责自噬(25]。在mitophagy证实活性氧的作用,引起细胞凋亡^125年我种子辐射,我们对待HCT116细胞N-acetyl-L-cysteine (NAC;活性氧清除剂),^125年我的种子辐射,或两者兼而有之。线粒体ROS和细胞内ROS生成使用相应的调查进行分析,流式细胞术分析。如图7(一),南汽减少^125年我的种子辐射诱导线粒体活性氧的积累。三个独立实验的统计结果复制图所示7 (b)()。此外,南汽减少引起的细胞内活性氧的积累^125年我的种子辐射(图7 (c))。实验重复三次,数据如图7 (d)()。蛋白质含量LC3-II和LC3-1由并行免疫印迹。如图7 (e)LC3-II LC3-1比的增加,引起的^125年我的种子细胞NAC治疗时辐射降低了。此外,免疫荧光染色显示,NAC可以减少LC3标点符号引起的积累^125年我的种子辐射(图7 (h))。

我们接下来利用线粒体呼吸链抑制剂研究线粒体ROS在mitophagy诱导的作用^125年我的种子辐射。DPI(50嗯)和抗霉素A(50),充当线粒体呼吸链抑制剂通过阻止电子流在线粒体呼吸链复合物我三世,分别被用来治疗辐照HCT116细胞收获前18个小时。如数据所示6 (f)- - - - - -6 (h),DPI的治疗和抗霉素A可以促进线粒体活性氧的积累和进一步提高mitophagy引起的^125年我的种子辐射。

我们也使用NAC,活性氧清除剂,检查是否引起的细胞凋亡与活性氧的水平^125年我的种子辐射。细胞被翻了一番沾探测膜联蛋白V和π评估通过流式细胞术分析细胞凋亡的比例(图8(一个))。流式细胞仪分析表明,南汽减少引起的细胞凋亡的比例^125年我的种子辐射(,图8 (b)),这表明在mitophagy ROS发挥重要作用,在HCT116细胞凋亡。

3.6。引起的线粒体活性氧的积累^125年我的种子辐照对mRNA表达HIF-1至关重要α和BNIP3 /拒绝

我们调查是否^125年我的种子辐射HIF-1的表达的影响α和它的目标基因。执行实时PCR检测HIF-1的表达α和它的目标基因BNIP3和拒绝。如数据所示9(一个)- - - - - -9 (c),^125年我种子辐射显著调节HIF-1的mRNA的表达α(,图9(一个)),BNIP3 (,图9 (b)),无(,图9 (c))。

以决定是否引起的活性氧^125年我种子辐射可以提高BNIP3的表达和拒绝,这是一个重要的信号转导通路调节mitophagy,我们检查了HIF-1的表达αBNIP3,拒绝使用实时PCR在mRNA水平。如图9,南汽减少HIF-1的表达α(,图9 (d)),BNIP3 (,图9 (e)),无(,图9 (f))。和抗霉素A的处理可能会进一步增加HIF-1的mRNA的表达α(,图9 (g)),BNIP3 (,图9 (h)),无(,图9(我)引起的)^125年我种子辐射,表明线粒体活性氧引起的^125年我的种子辐照可能通过HIF-1 mitophagy和细胞凋亡的关键α-BNP3 / NIX通路。

4所示。讨论

目前证据支持自噬作为一种新型癌症治疗的目标(37]。自噬是一个动态的过程,其特征是溶酶体降解的细胞质组件(如细胞质蛋白质和细胞内细胞器(38]。这个过程需要双层膜的形成自噬体,扣押和细胞质货物运输到溶酶体降解[39]。最近的研究表明,自噬起着重要的作用在癌症细胞命运决定后应力条件如饥饿、缺氧,和化疗40]。多项研究表明,高水平的自噬与radio-resistance各种癌症的41,42]。多个临床试验研究传统抗癌的效果进行放疗结合自噬抑制剂(37]。自噬抑制剂,如氯喹(CQ),羟氯喹(HCQ)和3-methyladenine (3-MA),已应用于临床试验。自噬抑制剂和放射治疗已被证明提供生存利益和提高癌症患者的寿命(43- - - - - -45];然而,自噬诱导的特定角色^125年我的种子辐射尚未确定。

在目前的研究中,我们第一次表明,自噬抑制剂3-MA和Ly294002能够减少HCT116细胞存活分数^125年我的种子辐射(数字1(一)和1 (b))。此外,击倒LC3表达HCT116细胞处于敏感状态^125年我种子辐射,表明自噬抑制机体影响HCT116细胞(图1 (d))。接下来,我们探讨了如何修改后自噬抑制剂HCT116细胞的反应^125年我的种子辐射。我们发现,抑制自噬细胞凋亡诱导的比例增加了^125年我的种子辐射(数字2(一个)- - - - - -2 (f))。由多种形式的细胞自噬诱导stress-such缺氧,活性氧积累、DNA损伤、蛋白质聚集,受损的细胞器,或与细胞凋亡细胞内病原体与控制细胞生存和死亡46]。因此,我们认为这可能^125年我的种子辐射引发自噬防止结肠癌细胞凋亡细胞死亡。

LC3检测自噬是一个重要的标志。它有两种存在形式:LC3-I LC3-II。LC3-I可溶性胞质蛋白,最初合成在一个未加工的形式,proLC3。一旦引发自噬,LC3-I修改为LC3-II招募autophagosomal膜和显示punctuation-like分布。LC3-II标点符号的数量是可靠地与自噬体形成的程度(47]。LC3 lipidation可以评估通过观察LC3-II比LC3-1免疫印迹。自噬体的积累可以测量通过TEM图像分析或免疫荧光分析LC3标点符号(34]。在目前的研究中,我们确定^125年我的种子辐射诱导自噬(数字3(一个)- - - - - -3 (c))和自噬流量(数字4(一)- - - - - -4 (c)通过免疫荧光和免疫印迹lipidation LC3的分别。此外,TEM图像显示与线粒体自噬空泡的存在(图5(一个)),这是与免疫荧光分析的结果(图一致5 (b))。这些研究结果的基础上,我们得出结论^125年我强劲辐射诱导mitophagy种子。

Mitophagy cargo-specific自噬,选择性移除受损的线粒体(48]。细胞死亡的遗嘱执行人,除了其传统的角色在生物能学和新陈代谢,线粒体是现在公认的扮演着重要的角色在辐射诱导细胞反应11]。线粒体损伤能诱导mitophagy控制线粒体数量和质量与代谢需求(49]。线粒体能量是至关重要的细胞器,大量的ATP生产使用电化学梯度跨线粒体内膜的生成等(50]。线粒体膜电位供应proton-motive力量促进易位的质子从线粒体基质膜间隙,这对ATP合成是必要的。除了作为权力中心的细胞,线粒体还生成活性氧(ROS),来自电子泄漏等。众所周知,损伤线粒体的形态改变线粒体呈现典型的伴随着生物化学变化,如ATP下降,降低线粒体膜电位,增加线粒体ROS (51]。因此,我们测量了线粒体参数在暴露于2 Gy^125年我的种子辐射。我们证明了^125年我种子辐射产生重大影响线粒体功能,导致特异性线粒体膜电位的影响,减少生产ATP,和积累的细胞和线粒体ROS(图6)。这些结果表明,氧化应激引起的^125年我种子辐射增加活性氧的浓度,导致线粒体功能障碍通过抑制线粒体呼吸。

线粒体活性氧的来源生产过剩与线粒体电子漏等复合物等被视为主要的我和三世线粒体ROS生产商的网站(52]。特定抑制剂可以抑制物我和第三等,引起电子的泄漏,从而导致较高的线粒体活性氧(53]。我们用活性氧抑制剂或线粒体ROS增强剂影响线粒体ROS水平和调查mitophagy线粒体活性氧诱导的作用^125年我的种子辐射。作为活性氧清除剂NAC可以阻止细胞内线粒体活性氧引起的^125年我的种子辐射。NAC治疗后,LC3-II积累引起的^125年我种子辐射减少(数字7(一)- - - - - -7 (e))。抗霉素A,块电子流在复杂的三世,是众所周知的增加引起的线粒体ROS和mitophagy进一步增加^125年我的种子辐射(54]。Diphenyleneiodonium (DPI)作为细胞过氧化物生产抑制剂通过抑制线粒体呼吸链复杂我NADH还原酶导致的潜力增加线粒体超氧化物的生产(55]。如数据所示7 (f)- - - - - -7 (h),DPI的治疗和抗霉素引起的线粒体ROS和进一步提高mitophagy^125年我的种子辐射。这些结果表明,引起的线粒体活性氧的积累^125年我种子辐射是一个重要的细胞因子,导致触发mitophagy。

活性氧能破坏细胞并激活许多信号通路诱导mitophagy组件。HIF-1α由活性氧激活是一个重要的信号蛋白调节mitophagy目标基因的转录调控BNIP3及其同系物NIX [17,56]。ROS上调HIF-1α转录激活nonhypoxic因素redox-sensitive的方式(57]。因此,我们调查是否引起的活性氧的积累^125年我的种子HIF-1辐射激活α和它的目标基因BNIP3和拒绝因此mitophagy触发。我们证明了^125年我的种子辐射升高线粒体ROS和HIF-1的表达α和它的目标基因BNIP3和拒绝(数字9(一个)- - - - - -9 (c))。值得注意的,抑制ROS的NAC不仅减少ROS水平还HIF-1的表达α和它的目标基因BNIP3和拒绝(数字9 (d)- - - - - -9 (f))。此外,线粒体电子传递链抑制剂(DPI和抗霉素A)上调线粒体活性氧的积累水平和HIF-1的表达α和它的目标基因BNIP3和拒绝(数字9 (g)- - - - - -9(我))。这些结果表明,线粒体活性氧引起的^125年我的种子辐射调节HIF-1的表达α和它的目标基因BNIP3和触发mitophagy拒绝。

BNIP3和拒绝与BCL2 BCL-XL发挥proapoptotic作用。放松管制的BNIP3或无表达与细胞凋亡有关58]。因此,我们假设引起的活性氧积累^125年我的种子辐射可能在细胞命运决定扮演关键角色。为了测试这一理论,我们使用NAC探讨活性氧积累如何影响细胞的命运。引人注目的是,南汽抑制细胞凋亡诱导的百分比^125年我的种子辐射(数字8(一个)和8 (b)),这表明线粒体活性氧积累引起的^125年我不仅种子辐射引发mitophagy通过upregulation HIF-1的表达α和它的目标基因,但也参与了细胞凋亡的决定。

5。结论

我们的研究结果表明,高水平的线粒体ROS生成的^125年我的种子辐射诱导线粒体损伤移植HIF-1的表达α和它的目标基因BNIP3 mitophagy NIX和触发器。Mitophagy有助于减少氧化损伤,通过移除受损的线粒体ROS水平,从而保护HCT116细胞凋亡。

相互竞争的利益

所有论文的作者没有金融和人际关系与他人或组织不当影响这项工作。

作者的贡献

王俊杰和勇赵设计研究。Lelin胡锦涛进行了分子生物学实验。郝王黄和李参加了统计分析。Lelin胡写的手稿。王俊杰和勇赵修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

作者感谢Guopeng王副教授,曾在生命科学学院北京大学、技术援助和提供建议对透射电子显微镜技术在这项研究中。作者感谢小娟杜教授,曾在北京大学健康科学中心,提供HCT116细胞系。这项工作是由国家自然科学基金支持的年轻学者(81402519,王郝)。

引用

1. h·s·j·j . Wang元,j . n . Li w . j .江y l .江和s .问:田”间隙永久植入125 i籽作为re-recurrent抢救治疗直肠癌,”结直肠疾病的国际期刊,24卷,不。4、391 - 399年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 江y . j . Wang, j·李,田,w .跑,和d .秀”术中超声引导下碘- 125的种子植入不可切除的胰癌,”实验和临床癌症研究杂志》上,28卷,不。1,第88条,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. j . j . Li王:孟et al .,“图像引导经皮^125年我种子植入抢救治疗复发性软组织肉瘤手术和放疗后,“癌症生物疗法和放射性药物,26卷,不。1,第120 - 113页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. l .朱y江,j .王et al。”的调查^125年我种子永久植入头部和颈部复发癌的手术和体外放射治疗后,“世界肿瘤外科杂志》上第六十条,卷。11日,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. 姚l . j . Wang江y . et al .,“永久的间隙^125年我的种子植入抢救治疗小儿复发或转移性软组织肉瘤多学科治疗后,“世界肿瘤外科杂志》上,13卷,不。1,第335条,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. l .姚明,y江,江p . et al .,“计算机永久的^125年我种子间质近距离放射疗法对复发性腹膜后淋巴结转移体外放射治疗后,“近距离放射疗法,14卷,不。5,662 - 669年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 问:曹,h .王:孟et al .,“ct引导间隙^125年碘种子近距离放射疗法抢救治疗复发性脊柱原发性肿瘤,”放射肿瘤学,9卷,不。1,第301条,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. y田问:谢,y田et al .,“放射性^125年我种子抑制细胞生长、迁移和入侵引发鼻咽癌的DNA损伤和灭活VEGF-A / ERK信号”《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。9篇文章ID e74038 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 瞿a . j . Liu h . Wang, j·李,赵y,和j·王,“C225和125 -碘的种子辐射对结直肠癌细胞,”放射肿瘤学,8卷,不。1,第219条,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 李瞿a, h . Wang j . et al .,”生物的影响^125年我种子辐射对A549肺癌细胞:G2 / M逮捕和增强细胞死亡,”癌症调查,32卷,不。6,209 - 217年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 张,m·m·戴维森周h, c . Wang w·f·沃克和t . k .黑“细胞质辐照导致线粒体功能障碍和DRP1-dependent线粒体裂变,“癌症研究,卷73,不。22日,第6710 - 6700页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. w . W.-Y。金和r . b . Banati电离辐射对线粒体的影响。”自由基生物学和医学卷,65年,第619 - 607页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. m . Saraste“世纪末de氧化磷酸化,”科学,卷283,不。5407年,第1493 - 1488页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. p·a·奈伊,“线粒体自噬:起源、意义,和角色BNIP3和拒绝,“Biochimica et Biophysica Acta-Molecular细胞研究,卷1853,不。10日,2775 - 2783年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. b, a, m·乔et al。”,短的剪接变体BECN1 BECN1s mitophagy功能,“自噬,11卷,不。11日,第2056 - 2048页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. k . l . Liu神,问:陈和k . Okamoto”受体介导mitophagy在酵母和哺乳动物系统中,“细胞研究,24卷,不。7,787 - 795年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. a . h . Chourasia k·特雷西,c .私生子et al .,“Mitophagy缺陷引起的BNip3促进乳腺肿瘤进展转移损失,”EMBO报告,16卷,不。9日,第1163 - 1145页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. a . Viale p . Pettazzoni c a Lyssiotis et al .,“致癌基因ablation-resistant胰腺癌细胞依赖线粒体功能,“自然,卷514,不。7524年,第632 - 628页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. d·h . Wu雪,g . Chen等人“BCL2L1和PGAM5轴定义了低氧诱导受体介导mitophagy,”自噬,10卷,不。10日,1712 - 1725年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. t·e·奥沙利文l·r·约翰逊h·h·康和j . c .太阳,“BNIP3——BNIP3L-mediated mitophagy促进自然杀手细胞记忆的一代,”免疫力,43卷,不。2、331 - 342年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. n .网游美国奥斯汀b Scheiber-Mojdekhar et al .,“小说p53-dependent抗癌策略,针对铁信号和BNIP3L-induced mitophagy,”Oncotarget,7卷,不。2、1242 - 1261年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. d·r·格林和b·莱文,“生存还是毁灭?如何管理选择性自噬,细胞死亡细胞的命运,”细胞,卷157,不。1,第75 - 65页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. n·m·马祖尔和j . Pouyssegur”低氧诱导自噬:细胞死亡和细胞生存?”当前细胞生物学的观点,22卷,不。2、177 - 180年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 依Braicu, h . Luketina HIF1 r . Richter et al。。α是一个独立的预后因素总体存活率在晚期卵巢上皮无知OVCAD财团的研究,“OncoTargets和治疗7卷,第1569 - 1563页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. 李l . j . Tan y苗,p . Lei,张问:“ROS和自噬:相互作用和分子调节机制”细胞和分子神经生物学,35卷,不。5,615 - 621年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. H.-Q。壮族,j j。王,A.-Y。廖,j。王,赵y”的生物学效应^125年我在CL187种子连续低剂量率辐照细胞,”实验和临床癌症研究杂志》上,28卷,不。1,第十二条,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 瞿j . h . Wang, a, y赵,j . Liu和j·王,“单一的不同的生物效应,分馏和持续低剂量率辐照CL187大肠癌细胞,”放射肿瘤学,8卷,不。1,第196条,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. 严t、y Seo和t . j . Kinsella“微分细胞反应长期LDR-IR MLH1-proficient和MLH1-deficient大肠癌HCT116细胞,”临床癌症研究,15卷,不。22日,第6920 - 6912页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. l .朱t·杨,李l . et al .,“TSC1巨噬细胞极化控制,防止炎症性疾病”,自然通讯卷,5篇文章ID 4696, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. w·l·郭h . Yu顾et al .,“自噬负调节传染性胃肠炎病毒复制,”科学报告》第六卷,ID 23864条,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. l·l·胡h . Wang黄赵y,和j·王,“相声自噬与细胞内的辐射响应(审查),“国际肿瘤学杂志卷,49号6,2217 - 2226年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. y江,j·李,j·h·李et al .,“arginylation分支N-end法则的积极途径调节细胞自噬的通量和间隙proteotoxic蛋白质,”自噬,12卷,不。11日,第2212 - 2197页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. m·j·李,j·h·李,d . c . Rubinsztein博士“τ退化:ubiquitin-proteasome系统与自噬溶酶体系统,”神经生物学的进展卷。105年,49-59,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. d . j . Klionsky h·阿布达拉h . Abeliovich et al .,“使用指南和解释的化验监测自噬,”自噬,8卷,不。4、445 - 544年,2012页。视图:谷歌学术搜索
35. Banerjee, n . Aykin-Burns k . j . Krager et al .,”C / EBP的损失δ提高IR-induced细胞死亡通过促进氧化应激和线粒体功能障碍,”自由基生物学和医学卷,99年,第307 - 296页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. 赵m x Wang Yan, l . et al .,“低剂量methylmercury-induced细胞凋亡和线粒体DNA突变在人类胚胎神经祖细胞,”氧化医学和细胞寿命卷,2016篇文章ID 5137042, 10页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. m·b·e·Schaaf b . Jutten t . g .家珍et al .,“规范自噬不会导致细胞抗辐射性。”放射治疗和肿瘤,卷114,不。3、406 - 412年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. h . Weidberg大肠Shvets, z Elazar”生物起源和货物选择性自噬体”,年度回顾生物化学卷,80年,第156 - 125页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. 比比Chandrika c·杨,y Ou et al .,“内质网应激自噬提供cytoprotection从化学缺氧、氧化损伤和改善肾脏缺血再灌注损伤,”《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。10篇文章ID e0140025 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. j . j . Jaboin e . t .筱原l·莫雷蒂e·s·杨,j·m·卡明斯基b . Lu,“在放疗诱导自噬抑制mTOR的角色,”技术在癌症研究和治疗》第六卷,没有。5,443 - 447年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. 刘问:太阳、t、y元et al .,”米尔- 200 c抑制自噬,增强辐射敏感度在乳腺癌细胞针对UBQLN1,”国际癌症杂志》上,卷136,不。5,1003 - 1012年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. h . n, l . Wu元,j .王”ROS /自噬/ Nrf2通路介导的低剂量辐射诱导radio-resistance人类肺腺癌A549细胞,”国际生物科学杂志》上,11卷,不。7,833 - 844年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. k·w·金·l·莫雷蒂,l·r·米切尔,k . j . Dae和b . Lu”结合bcl - 2 /哺乳动物雷帕霉素靶抑制导致增强的放射线增减通过诱导细胞凋亡和自噬在非小细胞肺癌肿瘤异种移植模型中,“临床癌症研究,15卷,不。19日,6096 - 6105年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. a . Apel赫尔,h·施瓦兹,惠普Rodemann,和a . Mayer”阻止了自噬糖分会让耐药细胞癌放射治疗,”癌症研究,卷68,不。5,1485 - 1494年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. m . Chaurasia a . n . Bhatt Das, b . s . Dwarakanath和k·沙玛,“辐射诱导自噬:机制和后果,”自由基的研究,50卷,不。3、273 - 290年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. g .获得g·马里诺,b . Levine,“自噬和集成的压力反应,”分子细胞,40卷,不。2、280 - 293年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. y Kabeya:水岛,t .上野et al .,“哺乳动物同系物的酵母Apg8p, LC3在自噬体膜局部处理,”在EMBO杂志,19卷,不。21日,第5728 - 5720页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. c . De Duve和r . Wattiaux溶酶体的功能。”年度回顾的生理28卷,第492 - 435页,1966年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. r . j . Youle和纳伦德拉·d·p·“mitophagy机制。”自然评论分子细胞生物学,12卷,不。1,9-14,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. 海克米,y . Wang和a·诺“线粒体ROS和效应器的内在老化细胞凋亡通路:辨别杀手!,”遗传学前沿第161条,卷。7日,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. l . Galam行进,r .桑德拉让r .在业和n . Kolliputi”4-Hydroxynonenal人类小气道上皮细胞,调节线粒体功能”Oncotarget》第六卷,没有。39岁,41508 - 41521年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. d先生、g·勒克莱尔诉古森斯et al .,“线粒体NADPH氧化酶类的主要来源是TNF -α/ cycloheximide-induced氧化应激小鼠肠上皮MODE-K细胞,”细胞信号,27卷,不。6,1141 - 1158年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. p . r . Angelova和a . y .阿布拉莫夫”线粒体活性氧的生理学功能作用,”自由基生物学和医学卷,100年,第85 - 81页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. d . Rakhmatullina a . Ponomareva n . Gazizova和f . Minibayeva线粒体形态和动力学小麦根在鱼藤酮和抗霉素A,”原生质,卷253,不。5,1299 - 1308年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. n, k .拉吉卜·g·Lawler et al .,“DPI细胞凋亡的线粒体superoxide-mediated,”自由基生物学和医学,34卷,不。4、465 - 477年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
56. s . Movafagh美国骗子,k .签证官”的监管低氧factor-1a活性氧:新发展在一个古老的辩论中,“细胞生物化学杂志》上,卷116,不。5,696 - 703年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
57. s . Bonello c . Zahringer r s BelAiba et al .,”HIF-1活性氧激活α通过功能NF启动子κB站点。”动脉硬化、血栓和血管生物学,27卷,不。4、755 - 761年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. 张j . p·a·奈伊,“BNIP3的作用,并拒绝在细胞死亡,自噬,mitophagy,”细胞死亡和分化,16卷,不。7,939 - 946年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2016 Lelin胡锦涛等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。