文摘
酒精是最社会接受上瘾的物质世界,及其与氧化应激代谢有关的一代。这项工作的目的是评估氧化应激的作用在酒精性肝硬化(ALC)。这项研究包括187例患者分为两组:酒精度,分类根据儿童得分,和一个对照组。我们确定的水平降低,氧化谷胱甘肽(谷胱甘肽和GSSG)及谷胱甘肽(GSSG比血液中酶的方法。同时,蛋白质羰基和丙二醛(MDA)含量估计血清中。MDA水平损害的严重程度成比例增加,而谷胱甘肽和GSSG水平降低和增加,分别在不同阶段的肝硬化。谷胱甘肽(GSSG没有差异率和羰基化作用组之间的蛋白质含量。我们也评估是否或禁欲的积极消费酒精饮料的行为,这些氧化影响的标记,只有发现差异MDA,谷胱甘肽,GSSG决心和谷胱甘肽(GSSG比率。我们的结果表明,酒精性肝硬化科目增加氧化应激的早期阶段疾病严重程度和节制的饮酒有利于主要抗氧化单子叶植物:谷胱甘肽晚期患者的疾病严重程度。
1。介绍
酒精是全世界大多数社会接受上瘾的物质。酒精饮料的消费是社交聚会的一个特点。然而,在许多社会中,这些饮料的消费超过代表严重的健康和经济问题(1]。长期或过量饮酒可以使身心健康风险,损害不同器官如脑、肝、心脏、肺、骨骼肌肉组织和骨骼(2- - - - - -4]。
约2 - 10%的酒精吸收是通过肺和肾脏消除;其余主要由氧化代谢通路在肝和nonoxidative通路在肝外组织。肝脏的氧化代谢的结果广泛的肝脏正常代谢底物的位移,乙醛的生产和活性氧(ROS),和NADH / NAD的增加+比(5]。数据证明ROS增加生产和减少抗氧化酶谷胱甘肽peroxidase-1强烈建议慢性乙醇消费创造了一个氧化和潜在的有害的环境在肝细胞内,这可能最终导致氧化和失活的细胞大分子。脂质过氧化作用[5和线粒体DNA的氧化变化6)急性和慢性乙醇暴露后曾被观察到。致病性的重要性过氧化过程ethanol-induced肝损伤仍然是一个争议的话题。增强肝脏中脂质过氧化作用的积极证据只有被证明当动物长期用乙醇和给予急性高剂量的乙醇与低温条件(隔夜空腹或叠加后7]。事实上,只有少数的研究已经研究了脂质过氧化反应和肝的参数内容的抗氧化剂在慢性中毒状态。
蛋白质氧化损伤的一个重要目标,因为ROS也可以氧化氨基酸残基,打通肽债券,增加蛋白分裂和聚合,改变蛋白质水解率(5]。因此,蛋白质氧化需要考虑几个ethanol-related之一的修改,改变肝细胞内蛋白质的功能,特别是在线粒体内,因为乙醇增加了活性氧在这个细胞器。蛋白质修饰引起的直接攻击氨基酸侧链的氧化脂质过氧化作用的产品,或还原糖的结果,可能会导致在蛋白质羰基化合物的生成(8]。另一方面,减少谷胱甘肽(GSH)是目前研究最多的抗氧化剂之一。谷胱甘肽是天然化合物在体内的氨基酸谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。这个分子起着至关重要的作用在身体的解毒过程发生在细胞内,主要是细胞的肝、肾、肠、肺。谷胱甘肽与脂质过氧化具有特别重要的关系,因为已知的能力这样的化合物结合自由基引发脂质过氧化,以及降低过氧化氢形成细胞(9]。肝脏谷胱甘肽已被观察到慢性饮酒后降低;这可以由乙醛累积造成的。此外,减少谷胱甘肽合成谷胱甘肽耗竭可能也是一个因素,因为它已经被记载在肝硬化肝脏(10,11]。肝脏谷胱甘肽和乙醇脂质过氧化作用之间的关系尚不清楚。谷胱甘肽抑郁症与ethanol-induced有关脂质过氧化(11大萧条),但可能导致或过氧化反应的原因。表1总结了氧化标记所产生的酒精消费在这工作量化。
当前工作的目的是分析氧化应激是否在酒精性肝病的一个重要的角色。这样做是通过使用不同的量化肝脏损伤氧化标记。我们发现氧化分子发挥了重要作用过程中酒精性肝病;这个角色更明显的脂质损伤和肝硬化患者谷胱甘肽标记。
2。材料和方法
2.1。病人
酒精依赖和滥用评估精神障碍的诊断与统计手册》(dsm - iv)标准和危险的消费被酒精使用障碍的鉴别试验评估(审计)。
这个横断面研究包括187例,18岁以上,分为两组:对照组(),它由主体与乙醇消费≤10 g /和审计评分≤7天,和酒精性肝硬化(ALC)组(),它是由病人出现酗酒按照世界卫生组织(世卫组织)(乙醇消费70克/天在男性和乙醇消费50克/天的女性在过去5年)和肝硬化的诊断。酒精度组根据患者分为3组儿童得分:儿童(),儿童B (),儿童C ()[12]。
评估过程包括一个详细的体格检查和人体测量学和气孔的评估营养缺乏症。
排除标准为所有组阳性病毒面板,其他伴随肝损伤,精神发育迟滞,历史的创伤性脑损伤与意识丧失超过10分钟,和疾病的存在可能会影响中枢神经系统。
机构审查委员会批准的过程。所有参与者提供书面知情同意,这项研究是开展《赫尔辛基宣言》的规定。
2.2。化学物质
三氯乙酸(TCA)、盐酸、乙酸乙酯、硫代巴比土酸、盐酸胍和牛白蛋白从σ化学公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。2,4-Dinitrophenylhydrazine (DNPH)乙基属的乙醇,磷酸二氢钾从j.t贝克(Xalostoc、墨西哥)。
2.3。样品收集
收集血液样本(5毫升)静脉穿刺到真空采血管管,与血栓活化剂对血清收集和EDTA对血液和血浆生化指标和氧化应激评价集合。血液立即离心10分钟1308×g收集血清和血浆。
总血也利用谷胱甘肽的决心。
2.4。生物化学分析
生化测试包括血液分析和肝功能测试和执行自动化系统(250年体外,强生,新泽西,美国贝克曼库尔特HMX-AL血液学分析仪,加利福尼亚,美国)。结果为阴性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和丙型肝炎病毒(HCV)抗体。
2.5。减少谷胱甘肽氧化谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG比率测定全血
我们测量血液中的减少谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)和GSH / GSSG比率由酶方法使用商用设备(目录编号为371757,Calbiochem,达姆施塔特,德国)后,制造商的指示。简而言之,样品用于确定GSSG (100μL(全血混合着10μL (1-methyl-2-vinylpiridinium三氟甲烷(清道夫))及谷胱甘肽(50μL(全血)立即冻结,直到他们的决心。样品都是在室温下解冻,然后混合和孵化2 - 10分钟。样本酸化与5%偏磷酸和上层清液离心分离的1000 g×10分钟在4°C。谷胱甘肽和GSSG决心,我们使用Ellman试剂,并与谷胱甘肽反应生成一种产品被分光光度法在412海里。GSSG可以确定通过减少GSSG谷胱甘肽,当时与Ellman试剂取决于他们的行动。该方法利用颜色的变化发生在反应中,反应速率正比于谷胱甘肽和GSSG浓度。谷胱甘肽和GSSG浓度的计算以及谷胱甘肽(GSSG比率需要四个步骤:(a)反应速率的测定,(b)校准曲线,分析物的浓度(c), (d)计算的谷胱甘肽(GSSG比率。谷胱甘肽(GSSG比率是根据以下公式计算:(GSH-2GSSG) / GSSG [13]。谷胱甘肽(GSSG比率减少由于GSSG积累。测量GSSG水平或决心的谷胱甘肽(GSSG氧化应激的比率是一个有用的指标。
2.6。在血清蛋白质羰基化作用的决心
DNPH是用于确定蛋白质羰基含量。200年μ血清L 1: 100稀释混合着200年μL 20%柠檬酸;样本混合然后离心机(3290 g×3分钟)。离心后,上清液提供了和0.5毫升10毫米DNPH添加到蛋白质颗粒。样品空白准备使用0.5毫升盐酸2.5 N。管被放置在一个黑暗的环境一小时在室温和涡每15分钟;0.5毫升的20%柠檬酸添加到每个管然后离心机在3290×g(3分钟)。离心后,上清液提供了和1毫升ethanol-ethyl醋酸的解决方案是补充道。后的机械破坏颗粒通过涡流,管子被允许站10分钟,然后再次旋转在3290×g(3分钟)。上层清液提供了和颗粒与醋酸ethanol-ethyl洗两次。最后洗后,蛋白质可溶性1毫升的6 M盐酸胍和20毫米磷酸二氢钾(pH值2.3)。 To speed up the solubilization process, the samples were incubated in a 37°C water bath for 15 minutes. The final solution was centrifuged to remove any insoluble material. The carbonyl content was calculated from the absorbance measurement at 360, 370, and 390 nm and an absorption coefficient = 22000 M−1厘米−1(14]。
2.7。脂质过氧化反应的评估
脂质过氧化作用是通过测量血清样本估计丙二醛(MDA)形成使用硫代巴比土酸方法(15]。简单地说,100年μL酒精中毒患者的血清或对照组是混合了500年μL(150毫米Tris-HCl和1.5毫升的0.375%稍后通知和涡10秒钟。反应混合然后在100°C的环境在水浴45分钟。年底的孵化,样品在1000×g离心10分钟。MDA含量与吸光度计算测量在532 nm和吸收系数= 1.56×105厘米−1米−1。
据布拉德福德(总蛋白测定16),使用牛血清白蛋白作为标准。
2.8。统计分析
数据表示为平均值±SEM。比较是由方差分析(方差分析)和正交对比被用来确定所有组之间的差异。与斯皮尔曼等级相关,相关性计算的要求。分析与Windows SPSS 15.0统计软件进行了(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。时被认为是具有统计学意义的差异值小于0.05。
3所示。结果
表2显示了我们的研究人群的主要人口特征。我们包括130名参与者在对照组和57酒精性肝硬化患者分为子组,根据儿童的得分,为儿童,儿童B,或儿童c .男人主导所有的学习小组。克乙醇消耗一天的酒精度患者高于对照组()。还有一个显著的差异与年龄酒精度的儿童子组患者之间;老年患者更严重的疾病()。身体质量指数也值见表2。
肝损伤的血清标记(AST、GGT和白蛋白)根据肝损伤进展(表显著改变3)。AST和GGT酶水平在酒精度较高的患者,与对照组相比,结果是统计学意义()。之间的差异也观察到儿童与儿童B组和儿童与儿童C组关于AST水平()。表3也显示了血红蛋白的水平,比容、血小板。直接成比例降低的水平观察每一个标记的情况下伤害的严重程度和这些结果具有统计学意义。
不同的研究在体外和在活的有机体内表明氧化应激在酒精度的发展中起着重要作用[17]。表4显示了一些氧化损伤的结果标记。MDA的区别、谷胱甘肽和GSSG水平对照组和肝硬化患者显著。MDA水平损害的严重程度成比例增加,而谷胱甘肽和GSSG水平降低和增加,分别在儿童子群,但恢复的其他阶段肝硬化(儿童B和儿童C)。没有谷胱甘肽(GSSG比率和羰基化作用的差异群体之间的蛋白质含量。此外,评估是否活跃或禁欲酒精饮料的消费影响病人的行为,这些氧化标记,我们根据以下标准分类的病人:11(儿童)的患者,9例(儿童B)和6例(儿童C)去年活跃的消费者,和11个病人(儿童),17个病人(儿童B), 3例(儿童C)戒酒者(患者没有饮酒在过去6个月)。类似于结果见表4学习小组之间没有明显差异,与羰基化作用(蛋白质含量数据1(一)和1 (b))。另一方面,如图2,MDA含量增加的危险ALC患者也依照儿童评分()。对照组(图2(一个)),MDA浓度高据肝病严重程度和酒精度的模式是相同的患者主动饮酒(图2 (b))。
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谷胱甘肽的行为在所有肝硬化患者不同,无论活跃饮酒或禁欲。在儿童子群、谷胱甘肽水平显著降低饮酒,以及活跃的消费者,与对照组相比。三肽的水平恢复的儿童患者B没有饮酒,但他们降低患者再一次活跃饮酒(儿童C组)(数据3(一个)和3 (b))。相反,数据4(一)和4 (b)表明GSSG增加在肝损伤的发展,最高机密与儿童患者,对照组,以及儿童B和C儿童患者。这个反应是类似不饮酒和其积极的消费(数字4(一)和4 (b))。最后,谷胱甘肽(GSSG比率在禁欲的患者(积极的方向发展),这表明他们有更高浓度的减少谷胱甘肽(图5(一个))。这个反应是在活跃的消费者(图相反5 (b)),这表明有一个倾向于有更高的氧化谷胱甘肽的浓度。因此,活跃饮酒产生谷胱甘肽氧化的倾向,而节制的饮酒恢复的主要抗氧化分子,减少谷胱甘肽。
(一)
(b)
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(b)
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(b)
我们发现儿童得分是直接关系到AST (= 0.522,)、白蛋白(= 0.707,)、MDA (= 0.395,)、谷胱甘肽(= 0.589,)和GSSG (=−0.657,)。谷胱甘肽水平与白蛋白(=−0.484,)和GSSG (=−0.546,与VCM)和MDA水平(=−0.458,)和GSSG (= 0.277,)。
4所示。讨论
“肾上腺脑白质退化症”是一种常见的反应,由于长期滥用酒精和代表全球发病率和死亡率的主要原因。这个损害的病理生理学包括不同阶段,包括脂肪变性、肝病、纤维化和肝硬化,一小部分患者肝硬化发展肝细胞癌(18]。酒精度发病机制所涉及的机制是免疫和炎症反应,遗传因素,在肝酒精代谢产生的氧化应激。
不同的研究已经报道了氧化应激参与酒精度。1963年,迪Luzio [19),其次是其他研究表明,乙醇促进各种自由基中间体的形成由几个细胞类型,包括肝细胞、枯氏细胞,内皮细胞,浸润炎症白细胞(20.,21]。一些研究也表明,补充不同的抗氧化剂和自由基拾荒者减少肝脏损伤在alcohol-fed啮齿动物22- - - - - -24]。在目前的工作中,我们研究了几种氧化应激标志物的行为在酒精度患者血清和血液样本,在特定的肝硬化也分类根据儿童得分。
不同的报告表明,氧化应激,特别是线粒体氧化损伤,可以在酒精度负责肝细胞凋亡/坏死(25]。这就解释了结果在ALT, AST,和GGT水平。相关的肝脏线粒体内氧化应激诱导的线粒体膜电位的崩溃和线粒体通透性转换(MPT)的发病(26]。MPT特点是开幕式的超大频率导致线粒体膜蛋白复合物组装(27]。广泛的MPT导致线粒体肿胀由于离子和水的涌入和坏死的肝细胞死亡的发生是至关重要的(28]。这样的反应解释了增加肝损伤标记我们发现在我们的病人。GGT酶来源于肝细胞的质膜和其活动已被接受作为一种生物标志物的酒精度29日]。这种酶是参与的转移γ谷酰基肽中氨基酸和合成谷胱甘肽,谷胱甘肽水解氨基酸成分。半胱氨酸酶用于细胞内再合成(30.,31日),因此抗氧化防御系统起着重要的作用。
我们的研究结果表明,GGT活性增加和谷胱甘肽水平降低酒精度的病人。谷胱甘肽还原在儿童患者更明显比儿童B或C儿童患者。谷胱甘肽水平的降低可以解释为多年的酒精消费,根据儿童,儿童B, C和儿童,28日,26日和22年(数据没有显示)。
饮酒可能导致继发性贫血由于其直接作用于肝脏和其他不同的机制32]。叶酸和维生素B12缺乏患者常常伴有肝硬化。这些变化可能与食物摄入不足或肠道吸收不良。叶酸缺乏是最常见的导致酒精中毒患者低比容(33,34]。贫血在一个酗酒的人也可能直接毒性作用的结果在骨髓红细胞前体(35]。这些观察可以解释我们的研究结果中,血红蛋白和血细胞比容水平下降与损害的严重程度。
乙醇消费导致活性氧的产生,这可能会损害任何生物分子(蛋白质、脂类或DNA)。然而,蛋白质可能是最直接的载体对细胞造成氧化损伤,因为他们往往是催化剂,而非化学计量介质。因此,一个分子损伤的影响大于化学计量的变化(36]。蛋白质羰基含量是最通用的指标和到目前为止最常用的标记的蛋白质氧化(17,37]。羰基化合物(醛和酮)产生蛋白质侧链(尤其是Pro,参数、赖氨酸和刺)当他们被氧化了。这些根的化学稳定性,它是有用的对于他们的检测和存储36]。在我们的研究中,羰基化作用蛋白质含量没有显著差异对照组患者和酒精度(儿童,儿童B,或儿童C),甚至考虑当前的消费或禁欲的参与者。
我们还通过丙二醛量化评估脂质过氧化作用。多不饱和脂质是必不可少的,整个细胞的支持系统,包括细胞膜、内质网和线粒体。破坏他们的结构属性可以因此对细胞功能有可怕的后果。脂质过氧化反应已经被认为是一个主要的影响自由基。由于这个原因,许多分析方法建立自由radical-induced损伤测量产品的反应与脂质分子;这些产品之一是丙二醛(38,39]。致病性的重要性这过氧化过程ethanol-induced肝损伤的辩论。事实上,只有少数的研究已经研究了脂质过氧化反应和肝的参数内容的抗氧化剂在慢性中毒状态。每天喝超过两个标准杯在很长一段时间可能与铁过载的重要高程有关组织(40]。在动物模型中,铁和酒精已被证明以协同的方式采取行动提高脂质过氧化反应,导致MDA的形成(10]。此外,众所周知,酒精度患者抗体靶向细胞色素P450 2 e1和氧化磷脂。临床前和临床研究表明,免疫球蛋白的高程与脂质peroxidation-derived抗原与TNF -相关联α海拔和肝脏炎症的严重程度41]。我们的研究结果表明,血清MDA水平显著高于肝硬化患者和顺序相同的科目有不同的儿童。关于这两个活跃饮酒和不饮酒,过氧化损伤是维护。
有很多信息乙醇消费和抗氧化防御损耗的影响。细胞内谷胱甘肽是最重要的非酶的抗氧化剂。早期研究表明,减少谷胱甘肽水平和增加GSSG水平在肝脏,不管营养状况或肝脏疾病的程度,是一个共同特点,就是ethanol-fed动物,以及酒精中毒患者(19]。谷胱甘肽内稳态在alcohol-mediated氧化损伤的预防是非常重要的。支持这种说法的观察刺激老鼠的谷胱甘肽再合成补充谷胱甘肽前体,如防治作用,防止肠内酒精肝损伤模型(30.]。在我们的研究中,我们观察到进步的谷胱甘肽水平的变化,GSSG,谷胱甘肽(GSSG比率。在第一阶段的肝损伤,所有参数都改变,最明显的是氧化应激(氧化谷胱甘肽的浓度高于减少谷胱甘肽作为GSSG积累的结果)儿童患者a .众所周知,酒精消费短期刺激谷胱甘肽耗竭(11,12研究院和蒂策1969年发现,资助),但在长期酒精喂养的老鼠,谷胱甘肽水平增加。这种反应的机理尚不清楚,但证据表明谷胱甘肽的耗竭或增加营业额由于乙醇是由乙醛加合物的形成(21)、谷胱甘肽合成[受损42肝组织[],或增加损失43]。结果患者的酒精度根据儿童的得分是类似在临床前研究中获得。也许这是一个补偿性响应,以抵消酒精损害长期饮酒(饮酒者至少22年)。
零饮酒修改谷胱甘肽和GSSG的行为,特别是在儿童B和C儿童患者。他们显示增加谷胱甘肽水平和低GSSG浓度相比,儿童患者。此外,谷胱甘肽(GSSG比率值是积极的儿童B和C组儿童,由于谷胱甘肽积累,有利于抗氧化作用(数字3- - - - - -5),可能停止不同的炎症介质,如细胞因子。然而,gh / GSSG比患者积极消费呈负趋势,即表现为氧化肝损伤的存在。这些结果必须确认各组儿童更多的病人。在本研究的患者数量限制。
自由radical-antioxidant失衡可能是其中的一个主要因素,导致死亡率的流行在墨西哥的人口,即使饮酒人均是温和的,相比之下,欧洲国家的(44]。
氧化应激标志物通常以肝组织。我们的结果表明,它可以测量外周血,反映是什么发生在肝脏酒精肝硬化患者。
鉴于我们的研究结果,我们认为有必要进行临床试验,评估使用的抗氧化剂和抗氧化剂的使用治疗可能成为支持治疗+治疗抵消饮酒引起的肝损伤。
5。结论
我们的结果是第一个报道氧化标记在拉丁美洲的人口。他们认为,酒精性肝硬化科目增加氧化应激在禁欲的早期阶段疾病的严重程度和酒精消费倾向于主要抗氧化单子叶植物:谷胱甘肽晚期患者的严重性。
信息披露
玛丽娜Galicia-Moreno DGAPA-UNAM博士后奖学金项目的一员。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
玛丽娜Galicia-Moreno导致规划、解释结果,确定谷胱甘肽,GSSG,谷胱甘肽(GSSG比率,和MDA水平,和写作的手稿。Zaira Medina-Avila病人负责招聘和样本收集。Dalia猎鹰导致病人招募,样本收集和MDA的决心。多萝西Rosique-Oramas造成了谷胱甘肽和蛋白质羰基化作用的决心。法蒂玛Higuera-de la tijera亚l . Bejar Paula Cordero-Perez,琳达Munoz-Espinosa, Jose Luis Perez-Hernandez导致所有参与者的临床记录的审查。大卫Kershenobich进行研究。加芙Gutierrez-Reyes负责计划和执行。所有作者都同意最后的手稿。
确认
这部分工作是支持UNAM-PAPIIT, IA 203113和TA200515 PROMEP-SEP Fisiopatologia de las心血管植物ca - 302。