文摘

toll样受体4 (TLR4)是一种重要的革兰氏阴性细菌,可以触发传感器的激活先天免疫系统。TLR4的激活增加会导致氧化应激的感应。在此,通路,TLR4影响抗氧化活性进行了研究。TLR4-overexpressing羊,TLR4表达被发现与集成拷贝数在单核细胞挑战与脂多糖(LPS)。因此,生产的丙二醛(MDA)的增加,这可能会增加prooxidative压力酶的激活。抗氧化的同时,激活酶,谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶),是增加。实时PCR显示表达式的激活蛋白1 (AP-1)和antioxidative-related基因增加。相比之下,超氧化物歧化酶1的表达水平(SOD1)和过氧化氢酶(CAT)是减少。在转基因羊,谷胱甘肽(GSH)含量显著降低。此外,转基因绵羊皮内注射LPS的每只耳朵上。 The amounts of inflammatory infiltrates were correlated with the number of TLR4 copies that were integrated in the genome. Additionally, the translation ofγ-glutamylcysteine合成酶(γgcs)增加。我们的研究结果表明,超表达TLR4的羊可以通过谷胱甘肽的分泌,改善氧化损伤引起LPS刺激。此外,TLR4提升γ通过AP-1 gcs翻译途径,谷胱甘肽合成的必要条件。

1。介绍

toll样受体4 (TLR4)是一个模式识别受体(PRR),在先天免疫和宿主防御中发挥着关键作用。TLR4是一个关键的信号传感器的脂多糖(LPS),主要的革兰氏阴性细菌的胞外组成部分。TLR4的激活可以促进细胞增殖和细胞凋亡1]。TLR4可以通过骨髓分化主要响应启动免疫反应基因88 - (MyD88)依赖和独立的途径。MyD88-dependent通路,TLR4激活核因子-κB (NF -κB)和激活蛋白1 (AP-1),导致氧化应激和炎症(2,3]。

氧化应激后经常观察到的病原微生物感染。在这种情况下氧化应激应该抵御病原微生物。过度时,组织可以被生产过剩的活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)的方法。为了保护器官,ROS / RNS回收通过抗氧化机制。有两个主要的生理抗氧化防御系统,内源性抗氧化剂(谷胱甘肽)和membrane-protecting酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶和氧化酶)()(4]。基因,如猫、SOD、谷胱甘肽S转移酶(GST),γ-glutamylcysteine合成酶(γgc)和血红素加氧酶l(假日),用于监测抗氧化过程中,其编码产品相关的抗氧化应激反应,保护细胞不受氧化应激(5- - - - - -7]。

TLR4途径交联氧化应激。后TLR4触发NF -κB激活炎症因素,如白细胞介素- 6 (il - 6)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α),分泌。这些炎症因素加速炎症反应通过降低SOD活性和增加丙二醛(MDA)的生产。结果,增加活性氧/ RNS的生产可能会影响细胞的抗氧化能力8,9]。AP-1通路参与监管生产谷胱甘肽(10]。作为一种抗氧化剂,谷胱甘肽在预防氧化损伤中起着重要的作用,直接与ROS / RNS或交互操作作为各种酶的辅因子(11]。作为一个病原反应酶,γgcs对谷胱甘肽合成的影响。的upregulationγgcs可以增加抗氧化能力(12]。

许多羊疾病密切相关,增加了大量的氧化产品,因为积累的氧化产品可以减少羊免疫和宿主防御反应(13]。研究表明,炎症反应是抑制TLR4-mutant老鼠(14,15]。超表达TLR4放大的宿主反应有限合伙人,为转基因老鼠提供了一种生存优势16]。增强的炎症反应有助于清除病原体,但过度的炎症会导致氧化损伤。这里,我们生成的转基因羊,过表达TLR4与各种数字拷贝。有限合伙人管理诱导氧化损伤。TLR4途径,参与抗氧化损伤,研究阐明抗氧化应激反应的羊。

2。材料和方法

2.1。基因分型的Tg羊

转基因羊是由显微镜下注射。转化外源基因在南部印迹实验分析了后代的基因组DNA从耳朵切片,和我们使用pcr方法生成一个特定Digoxigenin-labeled探针(罗氏诊断,曼海姆,德国)。分析了外生TLR4南部与探针cTLR4(表玷污1)。基因组DNA (20 ng /μL)是消化垂直地震剖面我和Sma我(美国内,贝弗利,MA)。基因表达水平和TLR4复制数据被实时PCR量化。单核细胞被孤立使用羊从转基因羊外周血淋巴细胞分离介质(TBD,天津,中国)。实时PCR用于检测外源性TLR4的副本。引物设计目标序列位于cTLR4。β肌动蛋白作为一个内部标准(表吗1)。实时PCR反应进行了与一个真正的大师混合SYBR绿色装备(Tiangen,中国)使用MX300P (Stratagene)后,制造商的协议。

2.2。单核细胞的文化

羊与外生TLR4从1到3份副本被随机选中。那些羊被分成三个组基于外生TLR4副本的数量。每组包括三个转基因羊相同数量的外生TLR4副本。总共10毫升外周血从6个月大的羊收集和使用肝素抗凝。单核细胞隔离和文化进行了根据羊淋巴细胞分离介质制造商的指示。然后,1×10⁵细胞被播种在每个6-well盘子的一式三份井为每个组。RM1640(美国纽约Gibco,大岛)中含有10%的边后卫(Gibco)改变每24 h。单核细胞被刺激使用有限合伙人(1μg / mL;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)后48 h。

在8 h后刺激,培养基收集和冻结。从贴壁细胞RNA是孤立使用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。互补脱氧核糖核酸合成。TLR4的mRNA转录丰度是衡量使用实时PCR。SOD1基因表达水平的AP-1,猫,销售税α1,γgcs,通过rt - pcr和HO1量化。引物序列见表1。

2.3。氧化应激相关酶的测量

细胞悬浊液掉在液氮和样本在冰上融化;这个冻结/解冻循环重复两次。伊诺的活动、T-SOD猫,cox - 2, NADPH氧化酶,MDA,谷胱甘肽,GSSH检查使用各自的分光光度法检测试剂盒(南京建成,中国)。氧化酶检测使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(CUSABIO,湖北,中国)后以前公布的方法。使用一个微型板块分光光度计OD比率得到。

2.4。在活的有机体内注射LPS

观察局部炎症反应在三个三个transgene-positive个人皮内注射后100年的有限合伙人(3毫克/毫升μ每只耳朵上左)。8 h后的挑战,组织收集。病理变化观察用苏木精和伊红染色。免疫组织化学染色部分被用于观测γgc (Abcam,剑桥,英国)蛋白表达。

2.5。统计分析

上述所有实验重复3次。数据进行方差分析统计分析系统的使用的漠视,过程(SAS研究所卡里、数控、美国)。所有数据都表示为±SEM。差异被认为是重要的时候。

3所示。结果

3.1。超表达TLR4增加氧化损伤的羊

转基因羊,过表达TLR4是由显微镜下注射。印迹分析是用来检测阳性转基因羊羔(图1(一))。通过分析发达墨迹图计算转基因拷贝数、个体识别,进行各种外生TLR4基因的拷贝数。实时PCR用于研究外生TLR4的表达。单核细胞的信使rna转录水平选择羊羔观察(图1 (b))和外源性TLR4副本的数量计算,1.24,1.30,1.38,1.67,1.89,2.46,2.84,3.00,和3.23,分别。基于外生TLR4副本的数量,9羔羊被选择并分为三组(图1 (c))。

在LPS刺激后8 h,单核细胞TLR4转录水平从9羔羊被测量。我们发现TLR4 mRNA转录水平和MDA含量与外生TLR4(数据副本的数量1 (d)和1 (e))。转录水平转基因羊都显著高于野生型(Wt)羊()。与Wt羊相比,有更多的氧自由基生成,导致增强的转基因动物的氧化损伤。

耳组织LPS刺激引起的炎症反应是Wt、转基因绵羊(图中的下一个评估2)。炎性细胞浸润观察真皮。炎症细胞被发现增加Tg-1组动物。许多炎症细胞也观察到Tg-2动物。Tg-3动物的表皮角质层表皮的角质层和许多炎性细胞,包括分段细胞,可以观察到。氧化应激诱导组织不均衡。随后,炎性细胞浸润和炎性介质释放炎性组织中被检测到。在活的有机体内观察组织部分表明,炎症的程度与转基因拷贝数有关。

3.2。TLR4促进氧化应激相关酶激活LPS刺激后的羊

氧化中间产品是氧化应激的主要动力,大多是没有或。催化作用,cox - 2可促进合成和分泌。在现在的研究中,单核细胞与各种外生TLR4复制数字1的挑战μg / mL有限合伙人8 h。与Wt羊相比,激活细胞cox - 2和伊诺在Tg显著高于动物(数字3(一个)和3 (b))。与此同时,cox - 2和伊诺激活与TLR4拷贝数密切相关。

酶活性之间的转基因组明显不同()。NADPH氧化酶激活,Tg-1和Wt组之间无显著差异;然而,有一个Tg-2和Tg-3团体之间的显著差异()。NADPH氧化酶激活Tg-2组水平远高于Tg-1和Wt组(图3 (c))。这些发现表明,过表达TLR4可能引发ROS / RNS释放,可能因此引发氧化应激。更多的副本TLR4增强自由基释放,增加细胞的氧化应激。

3.3。在LPS刺激,过表达TLR4 T-SOD减少和增加氧化酶活动

在现在的研究中,单核细胞TLR4的表达各种复制数字显示相似的猫T-SOD激活后8 h接触有限合伙人(数字3 (d)和3 (e))。Tg-1羊的细胞中的表达水平高于从Wt羊,但差异不显著()。这两种酶表现出Tg-3组中表达水平较低而Tg-2集团()。氧化酶激活往往与TLR4拷贝数呈正相关(图3 (f))。我们发现TLR4提升氧化酶的活化,T-SOD,猫在拷贝数保持相对较低的氧化应激水平。TLR4增加副本数量可以减少T-SOD猫和激活,而氧化酶激活增加。

3.4。谷胱甘肽含量减少TLR4 Overexpressing羊

单核细胞与各种TLR4复制数据收集和挑战与LPS 8 h。谷胱甘肽和测量GSSG内容(数据4(一)和4 (b)),他们Tg-1组高,尽管Tg-1和Wt组之间无显著差异()。GSSG内容倾向于增加与TLR4拷贝数的关联,这是与谷胱甘肽。过表达TLR4造成氧化损伤。在这个过程中,氧化中间产品被回收。谷胱甘肽在transgene-positive单核细胞保持在一个更高的水平,这与Wt组相比有显著差异()。GSSG内容TLR4拷贝数呈负相关,表明自由基被回收。

谷胱甘肽(GSSG比间接反映出的氧化应激水平,所以比率计算每组8和48 h。我们发现GSH / GSSG的比率负相关与TLR4的拷贝数和低Tg-2和Tg-3组相比Tg-1和Wt组8 h (;图4 (c))。在刺激后48 h,谷胱甘肽(GSSG已恢复的比率的平均水平。这些发现表明,在LPS刺激,额外的副本TLR4可能导致降低大量的谷胱甘肽。然而,随着时间的推移,这一比例可能会迅速增加到平均水平。的时间内氧化损伤发生在转基因动物减少。

3.5。超表达TLR4的提升AP-1抗氧化应激基因的表达和调控

实时PCR用于研究TLR4下游基因表达,包括AP-1,猫,SOD1销售税α1,γgcs,假日(图4 (d))。AP-1水平与外生TLR4表达增加相关数字副本。销售税的表达水平α1,γgcs,假日也显示出了类似的模式。相比之下,猫和SOD1表达水平显示下降的模式。γgcs也可以通过免疫组织化学方法观察。更多的γgcs观察TLR4高拷贝数组(图5)。猫和SOD1表达被抑制TLR4高拷贝数的组。AP-1表达水平更高的TLR4高拷贝数组。支持一个反馈调节机制,HO1表达增强,可能抵消任何氧化的影响。增加大量的销售税α1,γgcs表达式表明谷胱甘肽合成被提升为清除自由基。

4所示。讨论

氧化应激和LPS-induced免疫反应可以共享TLR4通路。绑定与骨髓分化因子2 (MD2)有限合伙人诱发TLR4信号转导,增强吞噬作用和细胞因子生产针对革兰氏阴性细菌(17]。主要有两种TLR4转导通路,MyD88-dependent和独立通路。MyD88-dependent通路,MyD88触发interleukin-1 receptor-associated激酶(伊拉克共和国)绑定到TNF receptor-associated factor-6 (TRAF6),导致的核易位NF -κB,启动AP-1通路(18,19]。与此同时,TLR4在氧化应激通路发挥重要作用,促进氧化应激相关酶激活(20.]。氧化应激的产品作为第二信使,促进细胞因子合成通过激活NF-кB和AP-121]。自从伊诺是下游TLR4基因之一,TLR4途径导致upregulation伊诺的转基因羊。因此,中性粒细胞被触发产生过氧化物,这可以增加巨噬细胞激活(22]。cox - 2是前列腺素合成的病原反应酶,cox - 2参与病理条件下急性和慢性炎症。两种NF -κB和AP-1可以调节转录cox - 2 (23]。在这项研究中,cox - 2表达倾向于增加根据TLR4副本,这表明cox - 2转录是由TLR4通路。NAPDH氧化酶生产管理通过TLR4 IRAK4通路(24]。我们发现LPS激活AP-1在转基因动物,尤其是羊TLR4高拷贝数。这可能是由于AP-1 NF-кB相互作用[25]。与此同时,另一个重要的抗炎HO1表达酶,被检测到。结果显示HO1表达被发现增加转基因羊。先前的研究表明,直接调节AP-1 HO1表达,独立于其催化活性(26,27]。HO1活动增加可以抑制TLR4-induced信号转导(28]。我们的研究结果表明,负面反馈循环开始减少炎症反应在TLR4-overexpressed羊。

氧化应激代表氧化系统的不平衡。当一个器官感染,许多类型的炎症细胞被激活。没有生产推广和大量的氧自由基生成清除病原体。大量的氧化中间体及其衍生物不仅能破坏细菌的细胞膜,但也会造成组织损伤(29日]。氧化损伤的一个关键特性的分解酶防御系统。SOD是一个关键酶,清除氧自由基。在这个研究中,SOD活性调节Tg-1动物被发现。这表明,组织是轻微的氧化应激条件下30.]。而SOD表达式在Tg-2和Tg-3团体被压抑了,但这表明,急性应激条件下组织。SOD是清除氧自由基的过程中使用。随后,组织受到活性氧积累(31日]。所有这些发现表明,SOD是消耗过剩TLR4转基因绵羊和过表达TLR4严重损害抗氧化应激引起的酶系统在转基因羊。

谷胱甘肽是一种非酶的抗氧化成分,防止自由基是很重要的器官。氧化酶可以催化谷胱甘肽的存在,几乎所有ROOH卢武铉。氧化酶徒的猫在某些组织,消除H₂O₂(32]。在本研究中,猫活动减少和氧化酶表达LPS刺激后增加。销售税可能调节抗氧化的酶的表达(33)和AP-1可以上调GST转录,而谷胱甘肽可以下调销售税转录(34]。我们获得了类似的结果,观察AP-1表达增加,水平的销售税α1转录也升高。在炎症条件下,可以由巨噬细胞和中性粒细胞产生活性氧。活性氧引起的炎症可以逆转的外源谷胱甘肽(35]。在现在的研究中,表达式γgcs,病原为谷胱甘肽合成的酶,观察增加与TLR4副本数量。在氧化应激条件下,γgcs补偿调节增加谷胱甘肽合成。谷胱甘肽可以避免组织转移到GSSG消除自由基的氧化损伤36,37]。但TLR4基因的额外拷贝导致更多的谷胱甘肽快速消费和GSSG显著增加。这一发现表明,更严重的氧化损伤发生在TLR4 overexpressing羊。随着时间的推移,谷胱甘肽是保持在相对较高的水平,更快地返回平均水平在转基因动物。因此,氧化损伤的时间缩短。

5。结论

它已经建立了TLR4与氧化应激反应(38]。现在研究发现,过表达TLR4抑制SOD活性和触发AP-1启动下游抗氧化基因,防止氧化应激。我们发现过表达TLR4增加抗氧化应激能力。TLR4提升AP-1表达式,随后γgcs表达调节维持组织内稳态。

伦理批准

人工授精,intradermic注射、手术活检和采血进行在中国农业大学试验站,整个过程是严格按照协议批准中国农业大学动物福利委员会(允许XK662数量)。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Shoulong邓、坤舆兴丽安,Yixun刘的构思和设计实验。Shoulong邓、Guoshi刘和张生进行了实验。Shoulong邓和坤舆分析数据。燕和李黔吴贡献试剂/材料/分析工具。坤舆Shoulong邓,Baolu张写了论文。Shoulong邓小平和坤舆同样这项工作。

确认

这项工作是支持由国家转基因生物繁殖大项目(2013 zx08008 - 005),中国高校科学基金(2014 bh032),和青年项目CAMA (CAMAQN201411)。