文摘

天然产物可以与抗氧化活性生物分子的来源能够防止氧化应激疾病和抗肿瘤活性,使其原型的抗癌新药的重要来源。在这种背景下,本研究旨在分析乙醇提取物的化学成分塞纳velutina叶子和评估其抗氧化和细胞毒性在白血病细胞的活动。的抗氧化性能进行了评估采用DPPH自由基清除实验,通过检查提取的抑制AAPH-induced人类红细胞脂质过氧化作用。其细胞毒性和可能的作用机制进行评估Jurkat和K562白血病细胞系。乙醇提取含有类黄酮,如儿茶素、表儿茶素、山柰酚heteroside,芦丁、二聚的和三聚物的proanthocyanidin衍生品。提取表现出通过清除自由基和抗氧化活性antihemolytic行动,人类红细胞丙二醛含量下降。此外,提取也诱导白血病细胞死亡通过激活细胞内钙和caspase-3,线粒体膜电位降低,并逮捕和G2的细胞周期阶段。因此,美国velutina叶提取物中含有抗氧化剂和antileukemic生物分子与氧化应激相关的潜在应用在疾病和肿瘤细胞增殖的抑制作用。

1。介绍

一些疾病,包括癌症、糖尿病、动脉粥样硬化、炎性疾病和过早衰老相关的氧化应激(1]。氧化应激源于体内过剩的自由基,抗氧化活性较低,导致损害的基本生物分子如核酸、蛋白质和脂质(2]。

癌症是一种氧化应激相关疾病导致高发病率和死亡率在全球人口3]。白血病是造血系统的影响细胞的癌症;取决于他们的细胞起源和成熟阶段,可以归类为骨髓和淋巴白血病,急性或慢性(4]。手术、放疗和化疗(5)是治疗这些癌症的主要类型之一。

生物分子与抗癌活性较低的治疗剂量和降低副作用日益寻求最近几十年(6]。从1940年到2014年,49%的174抗癌药物市场上可用的要么是天然产物或其衍生品7]。因此,有一种趋势在一般人群和医学界作为药用植物替代来源的抗肿瘤药物,提供这样的治疗特性植物科学研究和证明(8]。紫杉醇的发现9),一种抗癌药物,高三尖杉酯碱(10),用于治疗急性和慢性骨髓性白血病,成功案例的例子在药用植物的药物的发展。

寻找新的分子治疗属性,包括抗氧化和抗癌的活动,很容易造成巨大的生物多样性和生物勘探潜力在巴西。番泻叶属已在巴西民间医药使用的抗氧化剂,抗菌(11,抗炎12,抗糖尿病的13),和抗肿瘤14)活动,以及其他用途。

从分类学上,一些物种已经转移桂皮属,番泻叶属(15]。这个分类单元目前包含500 - 600种(14,16],其中许多还没有对他们的化学成分和生物特征属性树栖物种塞纳velutina(Vogel) h·s·欧文& Barneby(豆科,Caesalpinioideae)。在这种背景下,本研究的目的是确定的乙醇提取物的化学成分美国velutina叶子和评价其抗氧化和antileukemic活动。

2。材料和方法

2.1。植物材料和提取准备

美国velutina树叶收集植物的识别和授权后的SISBIO (Sistema Informacao de Autorizacao e em Biodiversidade,许可证编号为54470 - 1)在Dourados,马托格罗索州(545年代22°05′′′和W 055°20′746′′),巴西、烘干的温度与空气循环 °C,然后在一个Willy-type切碎机。使干燥的样本存放在Grande Dourados联邦大学的植物标本,马托格罗索州,巴西,注册号4665。

提取当时由浸渍乙醇95%的植物材料混合物在室温下在黑暗中7天。然后,提取过滤,残渣进一步提取两次使用相同的过程。21天之后,滤液集中在一个旋转真空蒸发器(Gehaka、圣保罗、SP、巴西)获得的乙醇提取美国velutina叶子(ESV)。干提取收益率为29%,使用下面的公式计算:萃取率(%)=(冻干提取物的重量×100)/(原样品的重量)。ESV存储在−20°C受光照。

2.2。化学分析

提取分析了超快速液相色谱(UFLC)(日本岛津公司)耦合到二极管阵列检测器(爸爸)(240 - 800纳米,日本岛津公司)和电喷雾电离飞行时间(ESI-QTOF-micrOTOF QII)(在正面和负面的运营模式,120 - 1200 Da,力量Daltonics)。C-18列(Kinetex, 2.6μ米、150×2.2毫米,Phenomenex)一个警卫保护列相同的材料。流动相是如下:水(溶剂)和乙腈溶剂(B)两0.1%的甲酸的梯度0 - 2分钟3% B, B 2-25分钟3 - 25%,批准分钟25 - 80% B其次是清洗和整理列(8分钟)。流量为0.3毫升/分钟和1μL(1毫克/毫升)的提取注射。其他micrOTOF-QII参数如下:温度、200°C;N2干燥气体流速、9 L / min;喷雾器,4.0条;毛管电压,−3500 V(负)和+ 4500 V(正面);和内部校准与TFA-NA注入色谱分析。芦丁和表儿茶素标准得到从Sigma-Aldrich纯度≥95%。

2.3。抗氧化活性
2.3.1。DPPH自由基清除活性

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)自由基清除活性ESV中描述被评估为d·古普塔和r·k·古普塔(17),与修改。在这个分析,0.2毫升的不同浓度(1 - 1000μg / mL)添加到1.8毫升的DPPH解决方案(0.11毫米)在80%的乙醇。混合物在室温下孕育了30分钟在黑暗中。吸光度在517 nm spectrophotometrically测量。抗坏血酸和butylhydroxytoluene抗氧化剂(二叔丁基对甲酚)被用作参考。作为控制、0.2毫升溶剂用于稀释提取物添加到1.8毫升的DPPH解决方案在80%乙醇(0.11毫米)。两个独立的实验进行了一式三份。抑制百分比计算相对于控制使用以下方程:

2.3.2。抑制脂质过氧化作用在人类红细胞

(1)红细胞悬液的制备。研究伦理委员会批准后(拉西德Etica em尽管如此,CEP)大学中心的格兰德Dourados (UNIGRAN、巴西(CEP过程数量:123/12)),从健康的捐赠者收集外周血管含有柠檬酸钠,然后在400×g离心10分钟。等离子体和白细胞层被丢弃,红细胞被洗3次0.9%氯化钠溶液(氯化钠)和离心机。最后,10%的红细胞悬液制备在0.9%氯化钠溶液达到2.5%的最终浓度进行进一步分析。

(2)溶血活性和抑制氧化溶血。的能力ESV防止脂质过氧化作用是评估使用antihemolytic试验在人类红细胞与氧化剂孵化2,2′-azobis——(2-amidinopropane)盐酸盐(AAPH)、脂质过氧化的thermoinducible引发剂,所述的坎波斯et al。18]。评价溶血活性和抑制氧化溶血,红细胞是preincubated ESV或抗坏血酸(25 - 125μ在37°C g / mL) 30分钟之前的0.5毫升的0.9%氯化钠或50 mM AAPH(溶解在0.9%氯化钠)。分析,1%的乙醇作为溶剂的控制,而0.9%的氯化钠作为基线溶血控制。总溶血被孵化诱导红细胞与蒸馏水。样本孵化与常规搅拌37°C。溶血的程度是决定每隔60分钟的潜伏期5 h。管在700×g离心5分钟;0.2毫升的上层清液收集并添加到1.8毫升的0.9%氯化钠进行光度阅读在540海里。溶血百分比计算使用公式 ,在那里 样品吸光度和吗 的吸光度总溶血样本。三个独立的实验进行了一式三份。

(3)丙二醛(MDA)测量。的抑制丙二醛(MDA)生产、脂质过氧化反应的副产品,是根据Campos描述的方法评估et al。18]。红细胞在37°C preincubated 30分钟ESV或抗坏血酸(25 - 125μg / mL)之前的0.5毫升的50 mM AAPH解决方案。混合物被孵化与常规搅拌在37°C;1%的乙醇作为消极的控制。MDA浓度确定每隔60分钟总共5 h。MDA浓度,确定样本在700×g离心5分钟;0.5毫升的上层清液收集和转移到一个包含1毫升10纳米管硫代巴比土酸(稍后通知),溶解在75毫米单碱的磷酸钾缓冲pH值2.5。500使用的标准控件μL 20毫米的MDA解决方案和1毫升稍后通知。样本在96°C的环境为45分钟,允许冷却之前添加4毫升的正丁醇和离心法在1600 g×5分钟。得到的上层清液是阅读在532 nm分光光度计。两个独立的实验进行了一式三份。样本MDA水平表达在nM /毫升,根据以下公式:

2.4。细胞毒性的活动
2.4.1。细胞培养

人类白血病细胞系K562和Jurkat培养RPMI 1640(德国Sigma-Aldrich)培养基,补充10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素(Sigma-Aldrich、德国),和100年μg / mL链霉素(Sigma-Aldrich,德国)。细胞培养中包含5%的湿润孵化器有限公司2在37°C。

2.4.2。细胞毒性和细胞死亡

细胞毒性活性和细胞死亡概要文件进行评估根据Paredes-Gamero描述的方法et al。19]。白血病细胞被播种在105细胞/毫升96 -微型板块和处理(0 - 100μg / mL) 24 h。然后,细胞离心600 g×6分钟和resuspended绑定缓冲(0.14 M氯化钠,2.5毫米CaCl20.01米,玫瑰,pH值7.4)和孵化在室温下与1μL的膜联蛋白V-FITC(美国BD生物科学,圣地亚哥,CA)和5μg / mL propidium碘(PI),正欲美国20分钟。样品分析使用Accuri C6流式细胞分析仪(圣地亚哥,正欲、钙、美国),与3000年收购事件。

2.4.3。线粒体膜电位的测量

评估可能造成的影响,ESV对线粒体膜电位,白血病细胞荧光标记后的孵化JC-1 (5、5′, 6, 6′-tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘;分子探针,尤金,或者美国)根据莫拉描述的方法et al。20.]。JC-1探针在线粒体potential-dependent地积累。可行的细胞线粒体膜电位高染成红色。在线粒体膜电位的降低,细胞呈现出绿色。在这个试验,细胞被播种到24-well板(105细胞/毫升)包含补充27.6媒体,然后被孵化μ67.5克/毫升(Jurkat细胞)或μ克/毫升(K562细胞)为24小时。细胞被离心机和孵化JC-1 (1μg / mL)在室温下15分钟。在FACSCalibur荧光读数进行流式细胞分析仪使用CellQuest软件(圣地亚哥,正欲、钙、美国)。共收集10000个事件/样品。

2.4.4。Caspase-3活动

Caspase-3活动评估根据莫拉描述的方法et al。20.),小的修改。半胱天冬酶活性被流式细胞分析仪测量。白血病血统被处理(27.6μg / mL) 24-well微型板块(105细胞/毫升)24 h。然后用2%多聚甲醛细胞被固定在PBS 30分钟和permeabilized 0.01%的皂苷在室温下15分钟。接下来,这些细胞被孵化的1 h在37°C anti-cleaved-caspase 3-FITC抗体(美国,正欲)。孵化了40分钟后,分析了荧光Accuri C6流式细胞分析仪(美国,正欲)。总共10000个事件。

2.4.5。细胞内钙和Pan-Caspase抑制剂

胞内钙和还存在的角色ESV-promoted细胞毒性进行评估根据Bechara et al。21),小的修改。Jurkat细胞进行1 h在37°C下5%的股份有限公司2大气与intracelullar钙螯合剂BAPTA-AM或者Z-VAD-FMK pan-caspase抑制剂;ESV (27.6μg / mL)被添加到细胞和允许孵化24 h。控制和治疗细胞resuspended培养基中含0.05%台盼蓝和在血细胞计数器计数室决定细胞生存能力(台盼蓝排斥试验)。

2.4.6。细胞周期阶段

细胞周期的分布是由PI染色和流式细胞术分析。白血病血统(105细胞/毫升)处理(27.6μg / mL) 24 h,然后被固定和permeabilized如前所述,处理4毫克/毫升核糖核酸酶(Sigma-Aldrich、德国)45分钟37°C。DNA标记,细胞被孵化5μ克/毫升的π(西格玛奥德里奇,德国)。细胞在细胞周期的百分比隔间(年代G1, G2 / M)测定Accuri C6流式细胞分析仪(美国,正欲)。总共10000个事件。

2.5。统计分析

数据显示为平均值±标准平均误差(SEM)和统计分析使用学生的团体之间的显著差异t以及两组之间的比较和单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett测试比较两组以上的使用棱镜5 GraphPad软件。结果被认为是重要的时候 。

3所示。结果

3.1。ESV的化学成分

ESV的代谢物被解释紫外线吸收和质谱与文献中的数据进行比较。当可用时,化合物与真实的确认标准。

鉴定化合物2,m / z305.0660 (mh)−,是基于分裂模式提出的儿茶素窦等。22),即m / z261年[m公司2]−,m / z219 (mc4H6O2]−,m / z179 (mc6H6O3]−,m / z167 (mc7H6O3]−,m / z165 (mc7H8O3]−,并在270 nm紫外线吸收的检测。

化合物4、8和9显示紫外线吸收模式,黄酮醇(270和340海里)的特征。他们的分裂模式是一致的与heteroside山柰酚衍生品,包括其主要片段m / z285 (C15H9O6]−。中描述了这个类的化合物番泻叶属(23,24]。

二聚的(化合物6、7和10 - 14)和三聚物的原花青素(第15 - 22化合物),包括cassiaflavan、afzelechin、表儿茶素、儿茶素和柚苷配基子单元,也观察到。这些衍生品,虽然在自然界中罕见的,经常报道番泻叶属;一些作者认为它们是化学标记属(25- - - - - -27]。紫外线吸收最大值在280 nm和反相的增加保留时间随羟基含量减少或增加聚合度在赞同Callemien和科林(28]。分裂模式通过retro-Diels-Alder (RDA)裂变,杂环裂变(HRF)和醌甲基化物(QM)可以用来描述子单元组成原花青素(29日]。一个完整的讨论中发现的这类化合物可能说明文献[29日,30.]。因此,根据保留时间,分散配置文件,和比较与先前公布的数据,在ESV 22个化合物(图特点1和表1)。

表1
化合物鉴定在ESV UFLC-DAD-ESI-QTOF-micrOTOF QII。
(一)
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(c)
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图1
UFLC-DAD-ESI-QTOF-micrOTOF QII化学分析(负模式)的乙醇提取物美国velutina叶子。(一)基峰色谱(BPC)。(b)提取离子色谱(共同)m / z305年。(c)启德集团m / z289年。(d)启德集团m / z593年。(e)启德集团m / z609年。(f)启德集团m / z545年。启德集团(g)m / z529年。启德集团(h)m / z513年。(我)的启德集团m / z785年。启德集团(j)m / z769年。
3.2。DPPH自由基清除活性

ESV能够清除DPPH自由基,集成电路高2.5倍50和最大活动值相对于抗坏血酸;然而,这些值都低于同二叔丁基对甲酚(表2)。

表2
集成电路50和最大标准的抗氧化剂和ESV的DPPH自由基清除活性。
3.3。溶血活性和抑制氧化溶血

在测试浓度范围,ESV没有人类红细胞溶血活性,观察不溶血孵化(图5 h后2(一个))。

(一)
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(c)
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图2
人类红细胞溶血和MDA含量为5小时孵化与抗坏血酸(AA)和(50 - 125μg / mL)。(一)缺乏AAPH ESV的溶血性活动。(b) Antihemolytic添加AAPH后活动。(c)丙二醛(MDA)浓度(nM /毫升)后添加氧化剂。 相比AAPH-only控制(红细胞孵化与氧化剂)。

控制抗氧化,抗坏血酸,能防止红细胞溶血长达4 h孵化时暴露在氧化剂AAPH(数据没有显示)。ESV能够保护红细胞5 h / 50 - 125进行测试μ克/毫升浓度范围(图2 (b)),展示了其强大的antihemolytic活动。

3.4。MDA的测量

ESV赋予的程度的保护对AAPH-induced人类红细胞脂质过氧化作用是评估通过测量MDA水平。在100年和125年的浓度μg / mL, MDA含量降低整个过程的分析(数据未显示)和孵化(图5 h后2 (c))。

3.5。细胞毒性活性和细胞死亡

ESV促进细胞死亡在两个细胞系进行测试。集成电路50值表明,现代本是更有效的比erythroleukemic Jurkat细胞细胞株K562 (IC50= 27.6μ和67.5克/毫升μg / mL, resp。)(数据3(一个)和3 (b))。治疗促进双染色两种细胞系。这种类型的死是明显的 % Jurkat细胞和 %的K562细胞治疗后40和80μ克/毫升的提取,分别为(数字4(一)和4 (b))。

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图3
和K562白血病Jurkat的可行性(a) (b)在治疗后细胞与不同浓度的。 与未经处理的对照组。
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图4
细胞死亡的ESV-treated Jurkat (a)和K562细胞(b)。焦虑感−/π−可行的细胞;焦虑感+/π−凋亡细胞;焦虑感−/π+坏死细胞;和焦虑感+/π+,晚期凋亡细胞。 相对于各自的对照组。
3.6。线粒体膜电位

Jurkat和K562白血病细胞线粒体膜电位的下降与ESV孵化24 h后,通过减少红色荧光和绿色荧光比未经处理的细胞的增加。线粒体膜电位降低 % Jurkat细胞 %在K562细胞治疗后27.6和67.5μ克/毫升的提取,分别为(数字5(一个)和5 (b))。

(一)
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图5
线粒体膜电位的白血病Jurkat (a)和K562细胞(b)与不同浓度处理。 与未经处理的对照组。
3.7。Caspase-3活动

Jurkat细胞系,更为敏感ESV活动,被用来调查ESV-promoted细胞死亡机制。荧光直方图(图6(一))显示右转(更大的荧光值),表明caspase-3凋亡诱导酶的激活。裂解caspase-3水平增长了4.5倍ESV-treated细胞相对于未经处理的细胞(图6 (b))。

(一)
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图6
直方图(a)和代表图(b)的caspase-3激活ESV-treated Jurkat细胞。 与未经处理的对照组。
3.8。Pan-Caspase抑制和细胞内钙螯合

Jurkat细胞preincubated与pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK评估是否细胞毒性主要是由半胱天冬酶激活。Z-VAD-FMK预处理并没有减少ESV-induced细胞死亡(图7)。然而,细胞内的钙2 +螯合剂BAPTA-AM部分抑制ESV-induced Jurkat死亡细胞(图7)。


图7
的参与还存在(通过pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK)和细胞内钙(使用螯合剂BAPTA-AM)在ESV-induced Jurkat细胞的细胞毒性。 与未经处理的对照组。 而现代本集团。
3.9。细胞周期阶段

柱状图是用来显示细胞周期的分布阶段控制和ESV-treated Jurkat细胞孵化(图24小时后8(一个))。结果显示减少的一部分细胞G0 / G1期( %)和增加的部分和G2 / M期细胞( %, %,resp)(图8 (b))。这些结果表明,抑制细胞周期转换的进程。

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图8
直方图(a)和代表图(b)细胞周期分布与ESV治疗24小时后。 和 与未经处理的对照组。

4所示。讨论

巴西生物多样性丰富的活性化合物具有高潜力开发新的治疗药物,尤其是抗氧化剂和抗癌药物。一些植物物种中发现巴西特点是抗氧化和细胞毒性的活动在一些肿瘤细胞系(31日- - - - - -33]。

在目前的研究中,乙醇提取的美国velutina叶表现出抗氧化活性和显示细胞毒性效应对两个白血病细胞系,Jurkat和K562。ESV的抗氧化活性在AAPH-incubated人类红细胞;DPPH自由基清除和抑制脂质过氧化作用导致氧化溶血和减少丙二醛生产。这个活动ESV可能相关与抗氧化活性黄酮衍生品的存在,如儿茶素、表儿茶素、芦丁、山柰酚苷、二聚的和三聚物的原花青素,在树叶34- - - - - -37]。

类黄酮可以捐赠氢原子自由基,防止脂质过氧化作用,这种能力是与二羟b环的存在(38]。类似于其他酚类化合物,黄酮类化合物的抗氧化活性是归因于自由分子中羟基的存在,和增加抗氧化活性水平与羟基的数量(39]。

体内过剩自由基不仅可以促进脂质过氧化作用而且DNA氧化损伤,导致发展的早期阶段的突变和致癌作用40,41]。因此,化合物具有抗氧化特性的基本角色在预防疾病,如癌症。

的细胞毒性活动ESV对白血病行评估膜联蛋白/ PI-stain细胞死亡试验。此外,激活caspase-3观察但不确认是细胞死亡的一个主要机制pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK时使用。不同的提取物能促进不同的死亡机制同时因为不同的成分。这一事实使特定的细胞死亡通路的分析和识别。

ESV-induced的线粒体膜电位下降是一致的与观察到的细胞毒性效应对白血病细胞。潜在的变化可能是由于线粒体膜透性增加引起的细胞内钙含量的增加,坏死细胞死亡的特点(42,43]。

目前的研究表明钙的参与在细胞死亡,减少细胞生存能力的extract-treated细胞逆转了孵化与钙螯合剂BAPTA-AM。高钙水平促进线粒体渗透性转换孔开放;这些毛孔非选择性,从而释放的线粒体膜间隙的内容(44]。

针对Jurkat ESV-induced细胞毒性细胞的另一个机制包括细胞周期阻滞。ESV推广数量的减少细胞G0 / G1期,增加细胞的数量和G2阶段。建立了抗癌药物,如顺铂和阿霉素,施加类似的概要文件在肿瘤细胞周期的变化(14,45]。穆勒et al。46]发现顺铂可能是活跃在G2 / M期细胞因为在这些阶段对DNA损伤更敏感,在DNA修复机制比G1 / S不活跃阶段。黄酮类化合物是已知的植物化学物质诱导细胞周期阻滞通过减少细胞的细胞周期素B和细胞周期蛋白依赖性激酶1水平,负责控制细胞周期进展[S和M之间阶段47]。此外,一个主要的抗癌机制归因于黄酮类化合物是他们能够诱导肿瘤细胞株细胞周期变化(48]。因此,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKIs)产生极大的兴趣的能力阻止肿瘤细胞周期和防止肿瘤细胞增殖;这样的细胞周期阻滞可能是ESV运作的主要机制(49]。然而,植物提取物与复杂的化学成分,天然产物和生物活性化合物的提取可能单独行动或通过不同的途径表现为协同作用。

总之,乙醇提取的美国velutina叶子对白血病细胞表现出抗氧化活性和细胞毒性影响通过激活细胞内钙和caspase-3,线粒体膜电位降低,并逮捕和G2的细胞周期阶段。

缩写

AA: 抗坏血酸
AAPH: (2,2′-Azobis) - 2-amidinopropane盐酸盐
前言: 吸光度
感: 膜联蛋白V-FITC
二叔丁基对甲酚: Butylhydroxytoluene
Ca2 +: 钙
CaCl2: 氯化钙
爸爸: 二极管阵列检测器
DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
ESI-QTOF-micrOTOF QII: 电喷雾电离飞行时间
ESV: 乙醇提取美国velutina叶子
JC-1: 5、5′,6,6′-Tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘
MDA: 丙二醛
生理盐水: 氯化钠
PI: Propidium碘化
扫描电镜: 平均数标准误差
稍后通知: 硫代巴比土酸
UFLC: 超快速液相色谱。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是企业管理学院德基金会的赠款支持Apoio ao Desenvolvimento做教学,Ciencia e Tecnologia做南马托格罗索州(FUNDECT),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)。Edson卢卡斯多斯桑托斯、卡洛斯·亚历山大·Carollo和埃德加·j·Paredes-Gamero从巴西国家研究委员会接受奖学金(CNPq),巴西。