文摘

动脉粥样硬化与线粒体功能障碍和损伤有关。我们组之前证明hypercholesterolemic老鼠现在增加线粒体活性氧(mtROS)一代在多个组织和低NADPH /辅酶ii +比率。在这里,我们调查是否自发在这些小鼠动脉粥样硬化可以调制治疗补充或备用线粒体NADPH,命名为柠檬酸的补充,胆固醇合成抑制,或两者同时治疗。稳健统计分析合用组数据进行为了解释动脉粥样硬化病变的变化领域相关经典动脉粥样硬化危险因素如血浆脂质、肥胖、和氧化应激,包括肝脏mtROS。使用三个不同的统计工具(单变量相关,调整相关和多元回归)水平增加的严格,我们发现了一个新的重要的协会和一个可靠的模型预测动脉粥样硬化的程度因mtROS的变化。因此,结果表明,动脉粥样硬化病变区域是积极、独立与肝脏mtROS生产速度。基于这些结果,我们建议调制线粒体氧化还原状态影响动脉粥样硬化的程度。

1。介绍

氧化应激似乎是一个公分母统一各种经典危险因素作用方式导致动脉粥样硬化(1]。细胞来源的活性氧(ROS)是多个,包括NAD (P) H氧化酶、黄嘌呤氧化酶、脂氧合酶,和环氧酶系统,线粒体电子传递链,自然氧化的不同物质。先前的研究发现,线粒体活性氧特别是来自(mtROS)相关的动脉粥样硬化。例如,mtROS诱导内皮功能障碍、炎症细胞浸润和激活,细胞凋亡内皮细胞和血管平滑肌细胞(2,3]。此外,在动脉粥样化形成线粒体DNA损伤和功能障碍的作用提出了在过去的十年里4- - - - - -9]。

我们组之前显示不同组织线粒体的hypercholesterolemic atherosclerosis-prone低密度脂蛋白受体(LDLr基因敲除小鼠^−−/)比野生型控制释放更多的活性氧(10]。此外,该模型提出了减少线粒体NADPH的内容(10),谷胱甘肽抗氧化系统的主要还原能力和thioredoxine还原酶/过氧化物酶(11]。这LDLr^−−/线粒体prooxidant状态呈现细胞器膜更容易渗透过渡(MPT)。已经认识到线粒体功能紊乱如的渗透率过渡孔直接促进炎症和氧化应激反应,参与一些代谢疾病疾病现象(8,9,12]。线粒体可以触发细胞死亡的内在途径积累胆固醇在巨噬细胞13),动脉粥样化形成的早期事件。此外,氧化损伤mtDNA是人类和小鼠动脉粥样硬化的严重程度相关4,9]。

在先前的研究中,我们验证,除了NADPH缺乏症,LDLr^−−/线粒体包含更少的克雷布斯循环中间体异柠檬酸和治疗的细胞器等异柠檬酸(在体外)和LDLr^−−/与柠檬酸小鼠模型(在活的有机体内)导致降低NADPH mtROS生产和增加内容(14]。主要过程消耗细胞NADPH和克雷布斯循环中间体是脂质和胆固醇生物合成,提升在这个动物模型(10]。因此,我们假设柠檬酸补充或胆固醇合成抑制可能增加线粒体NADPH可用性、降低mtROS生产,减少动脉粥样硬化LDLr的发展^−−/鼠标。

2。材料和方法

2.1。动物

交配对LDLr^−−/(B6.129S7-Ldlr < tm1Her。/J, homozygous for Ldlr−−/小鼠随机分为四组:控制(CON)、柠檬酸(CIT),普伐他汀(PRA)和柠檬酸+普伐他汀(CIT + PRA)。柠檬酸的解决方案(1.34毫米柠檬酸+ 1.1毫米柠檬酸钠)和普伐他汀(67 mg / L)相当于10毫克/公斤体重作为唯一的饮用水源。提供的解决方案是在黑暗的瓶子和改变了每隔一天在3个月。额外的实验在未经处理的LDLr执行^−−/和野生型控制检查氧化易感性的差异状况和脂质氧化损伤血浆VLDL的粒子,以及确定抗炎系统性标记。控制殖民地的表型是由测量空腹血浆胆固醇水平(LDLr^−−/> 200 mg / dL和WT < 80 mg / dL)和PCR基因型的尾巴尖DNA样本根据杰克逊实验室协议。

2.2。等离子体生化分析

收集血液样本从retroorbital丛或麻醉和隔夜禁食老鼠的尾巴尖。总胆固醇、甘油三酯和nonesterified脂肪酸测定新鲜血浆使用标准的商业工具(和光,Roche-Hitachi、德国和kouichi德国)。血糖水平测量用一个手持glucometer (Accu-Chek优势,罗氏诊断、瑞士)。血浆尿素、肌酐、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)测定使用一个自动化的模块化分析仪PP(日立)与罗氏试剂(德国罗氏诊断)。血浆细胞因子tumoral坏死因子-α(TNFα)、白介素2(2)、白介素4 (il - 4)和干扰素(干扰素γ)与ELISA测定商业工具(eBioscience,圣地亚哥,CA)根据制造商的指示。等离子体氧化低密度脂蛋白抗体在等离子体测量被Zaratin et al。15]。聚苯乙烯96 -孔板涂有人类copper-oxidized LDL和孵化一夜之间在4°C。盘子被屏蔽1%明胶在PBS 48 h在室温下。与PBS洗涤后,血浆样品(1:200)被添加在室温下和孵化2 h。洗后用PBS含0.2毫升/ L渐变20,盘子和50孵化μL(过氧化物酶共轭兔子anti-mouse IgG抗体室温1 h。最后,75年μL过氧化物酶底物的解决方案是添加,孵化15分钟,结束了25个μL 2 M硫酸。光密度(OD)以450海里。结果给出了OD读数(任意单元)。CuSO₄全身的等离子体硫代巴比土酸活性物质(TBARS)浓度测定首先暴露等离子体在37°C到0.1毫米CuSO4 5小时。然后,100年μL(氧化等离子体与200年孵化μL 0.7%硫代巴比土酸0.05 M氢氧化钠和60μL 50%三氯乙酸。样本在沸水孵化了30分钟,其次是离心664克15分钟。标准曲线的制备使用几个稀释0.05毫米1,1,3,3-tetramethoxypropane。样品和标准曲线的光密度测量在532 nm标。

2.3。身体成分和组织脂质分析

附睾的脂肪组织和肝脏和脾脏新鲜质量测定重量分析地。老鼠尸体组成由重量决定之前和之后尸体前后水干燥和脂质与石油醚提取干尸体如前所述,Salerno et al。16]。肝脏脂质提取使用Folch方法(17]。肝脏胆固醇和甘油三酯含量测定用colorimetric-enzymatic化验(Roche-Hitachi、德国)溶解脂质提取后triton-containing缓冲区(0.1磷酸钾,pH值7.4,0.05 M氯化钠,5毫米胆酸,和0.1% Triton x - 100)。

2.4。隔离小鼠肝线粒体

线粒体是由传统的差速离心分离在4°C如前所述18]。肝脏均质在250毫米蔗糖,1毫米EGTA, 10毫米消息灵通的缓冲区(pH值7.2)。线粒体悬架被洗两次在同一介质含有0.1毫米EGTA和最后的颗粒在250毫米resuspended蔗糖最终蛋白质浓度80 - 100毫克/毫升。蛋白质浓度决定了修改后的缩二脲测定。

2.5。活性氧(ROS)生产

由线粒体ROS生产监控使用membrane-permeable荧光染料2′,7′二乙酸-dichloro-dihydro-fluorescein (H₂据Garcia-Ruiz DCF-DA)等。19]。简单地说,线粒体(0.5毫克/毫升)被添加到汉克斯介质,pH值7.2,包含1μM H₂DCF-DA和一个5毫米谷氨酸NAD-linked基质(苹果酸+ +的混合物α酮戊二酸+丙酮酸)与恒定搅拌1毫升试管在37°C。荧光信号被记录在488/525 nm的激发/发射波长对使用荧光计(日立、模型F4500)。执行校准与已知浓度的二氯荧光素(DCF),这是H的产物₂dcf氧化。

2.6。NADPH氧化率

吡啶核苷酸的氧化还原状态是衡量如前所述[10在线粒体悬架(1毫克/毫升)包含100μM EGTA、琥珀酸5毫米和5μ米鱼藤酮通过荧光信号在日立f - 4010荧光谱仪使用激发和发射波长的366和450海里,分别和狭缝宽度5海里。吡啶核苷酸氧化的程度计算的函数引起的荧光增加异柠檬酸。内部校准是由已知数量的NADH的加入。

2.7。动脉粥样硬化的组织学分析

原位灌注心脏切除和嵌入在10月Tissue-Tek化合物(美国樱花),冻结在−80°C,削减10μ部分在480μm从主动脉瓣主动脉长度传单,油红O染色根据Paigen et al。20.]。鲁宾描述的lipid-stained病变被量化为et al。21)使用ImageJ(1.45小时)软件。

2.8。VLDL氧化易感性

血浆VLDL分数被超速离心法从12 h小鼠禁食。五百年μL(等离子体被添加到离心器管的底部,并且仔细地覆盖了300μ生理盐水的L(150毫米氯化钠,1毫米EDTA,密度为1.006)。样品在140000 rpm(1×10离心机⁶g), 16°C在50分钟microultracentrifuge,日立(模型CS150GXL)。二百年μL顶部图层包含VLDL分数收集。VLDL的氧化试验中使用规范化的甘油三酯浓度(100毫克/毫升)。CuSO₄全身的氧化(40μM, 37°C)测定通过检测的形成共轭二烯烃随时间在234海里(分光光度计融合Packard)根据以前的报告(22]。

2.9。脂质化学标记识别

VLDL样本提交Bligh-Dyer萃取(23]。脂质提取resuspended 50μL(甲醇:H₂O milliQ(1: 1)和10μL(后者在990年被稀释μL 0.1%的甲酸和甲醇。在执行数据采集LTQ-XL Orbitrap发现仪器(30000应用,热科学、不来梅、德国)在正离子模式为复杂的脂质识别范围600 - 1000。每个光谱质量和强度值是包含在主成分分析(PCA),这是使用辨音器执行v.9.7这种软件(挪威特隆赫姆)。PCA的歧视后,潜在的化学标记选择识别。为此,结构命题进行使用高分辨率的主要参数。质量方面的计算精度,并表示ppm转变,根据Machado et al。24]。错误值被认为是在线数据库的协助下脂质地图(加州大学圣地亚哥分校,CA;http://www.lipidmaps.org/)指导潜在的脂质标记的选择。

2.10。统计数据分析

结果表现为±SE的手段。组之间的比较,分析了单向方差分析后续测试图基。相关性分析,我们枪兵的单变量相关性测试执行,部分(调整)相关和多元线性回归模型,分别使用GraphPad Prism 5.0, SPSS统计14.0和2.9 R包。在多元线性回归分析,变量选择在每个模型中进行使用regsubsets工具中可用飞跃包R (25,26],它标识了探索性变量创建最佳拟合线性回归模型根据贝叶斯信息准则(BIC)。是水平的意义。

3所示。结果

在一个试点实验中,食源性动脉粥样硬化在LDLr评估^−−/治疗与否与120毫米柠檬酸喝酒解决方案(14在两个星期)。在这项研究中使用的高柠檬酸浓度导致血浆脂质水平显著增加,没有mtROS生产的变化,导致主动脉粥样硬化病变面积增加80%的柠檬酸LDLr治疗^−−/老鼠(数据未显示)。因此,在接下来的研究中,我们采用柠檬酸低50倍剂量在12周(2.4毫米),确定了自发的(不是食源性)动脉粥样硬化的发展。这个协议没有造成血浆脂质水平的高度。抑制胆固醇组(他汀类药物治疗),我们选择亲水的低剂量他汀类降胆固醇(10毫克/公斤/天),因为我们曾表明,高剂量他汀类药物可以直接损伤线粒体(27]。这个剂量是仍然被证明是有效的减少LDLr的动脉粥样硬化^−−/没有重要的小鼠血浆脂质变化(28]。

控制(CON)、柠檬酸(CIT),普伐他汀(PRA)和柠檬酸+普伐他汀(CIT + PRA)小鼠相似的身体成分和血浆脂质水平(表1),尽管PRA组老鼠提出降低体重的治疗。肝脏和肾脏功能在所有组类似的验证通过量化的血浆碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸酐等离子体水平。然而,PRA组血浆尿素水平比其他组高出22%(表1)。氧化应激标记的平均值,如对脂质过氧化(铜sulfate-induced硫代巴比土酸活性物质),标题的等离子体氧化低密度脂蛋白抗体,肝脏线粒体NADPH氧化率,和活性氧产量率(mtROS)没有显著(表修改三个治疗1)。自发的动脉粥样硬化的发展,以脂质染色的面积在主动脉根病变,在反对没有明显变化,CIT, PRA组的老鼠。令人惊讶的是,CIT集团+ PRA呈现显著增强动脉粥样硬化(表1和图1)。

由于治疗没有改变经典动脉粥样硬化危险因素的平均值如血浆脂质、肥胖、氧化应激,合用组数据进行统计相关性分析试图解释观察到的差异变化的动脉粥样硬化病变区域。斯皮尔曼的单变量相关性测试表明,动脉粥样硬化病变区域与血浆胆固醇呈正相关(,),甘油三酸酯(,),高山(,),肝线粒体ROS生产(mtROS) (,)(图2)。我们进一步测试的存在线性多元回归模型来解释动脉粥样硬化的程度。三组变量测试:(1)对身体成分变量(胴体瘦肉和脂肪、内脏脂肪质量,和体重),(2)对等离子体变量(葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、LDLox抗体,和TBARS),和(3)对肝变量(肝质量,胆固醇和甘油三酯含量,和mtROS)。对于每个模型,创建的变量选择的拟线性回归是软件(25,26(表)来解释动脉粥样硬化变化2)。身体成分变量没有任何关系在确定动脉粥样硬化变异(没有发现显著的关联)。对于等离子体的变量,软件选择的两个重要模型:(a)与血浆甘油三酯水平和(b)与血浆甘油三酯和血糖水平。肝的变量,也发现了两个重要的模型:(a)与mtROS和(b)与mtROS和肝脏甘油三酯含量(表2)。根据这些回归模型,在动脉粥样硬化程度的影响这些变量可以解释如下。Ten-unit增加血浆甘油三酯(10 mg / dL)预计将增加17%的病变大小(等离子体模型(2)和一个单位增加mtROS (nmol DCF /毫克蛋白)预计将增加370%的动脉粥样硬化病变的大小(肝模型(3))。

为了验证是否mtROS相关性血浆甘油三酯水平与动脉粥样硬化的独立,我们也进行了部分(调整)相关测试。这种调整分析包括所有变量与动脉粥样硬化密切相关的斯皮尔曼相关测试(甘油三酯、胆固醇、血浆高山和mtROS)。调整后血浆甘油三酯水平,唯一仍显著相关的变量与动脉粥样硬化mtROS (,)(表2)。因此,mtROS正相关与动脉粥样硬化是证实了三个不同的统计分析和独立于古典风险因素的变化,血浆脂质水平。

这些统计肝脏mtROS和动脉粥样硬化之间的相关性表明机械的肝脏和动脉疾病之间的联系。最可能的连接是代谢(例如,分泌的氧化VLDL)和/或氧化诱导的促炎细胞因子。因此,我们LDLr相比^−−/和野生型小鼠VLDL易氧化(图3(表)和脂质标记3)以及血浆细胞因子(表的水平4)。图3表明VLDL LDLr的分泌^−−/肝脏明显更容易氧化的侮辱(CuSO₄)比野生型相比VLDL的TG基础内容。野生型VLDL显示了氧化的5倍大的滞后时间起始和从LDLr VLDL的氧化率要低50%^−−/老鼠。此外,质谱分析VLDL脂质提取确定氧化脂质标记,主要是磷脂,LDLr VLDL的^−−/与野生型小鼠相比(表3)。两组显然是分离与95%的准确性和质量的错误小于2 ppm。关于系统性炎症标记物,表4显示三个促炎细胞因子(TNFα2、干扰素γ)增强LDLr的等离子体^−−/老鼠。

4所示。讨论

几项研究已经证明线粒体功能的相关性对动脉粥样硬化的发展在人类和动物2,3,7,8]。大多数研究认为,线粒体ROS生产过剩与动脉粥样硬化的发生可能与疾病进展,虽然仍然需要更好的机械的理解(29日]。

因为我们之前发现线粒体atherosclerosis-prone小鼠模型(LDLr^−−/克雷布斯循环中间体)降低了内容,减少相当于权力,并增加活性氧的释放,我们假设至少部分这些线粒体功能可以归因于一个高胆固醇合成,既消耗克雷布斯循环中间体和细胞减少的等价物。因此,在目前的工作,我们测试是否补充柠檬酸结合抑制胆固醇合成可以减少线粒体活性氧释放和动脉粥样硬化的发展。与我们的假设相反,任何治疗显著影响mtROS的平均值,而合并后的柠檬酸与普伐他汀治疗实际上增加了动脉粥样化形成补充。

普伐他汀单独增加血浆尿素水平和尿毒症本身似乎proatherogenic [30.]。尿素浓度可能会增加的速率增加异氰酸酯的合成,增加carbamylation脂质和蛋白质,包括低密度脂蛋白(31日]。先前的研究表明,carbamylated LDL剂量依赖性促进人类冠状动脉平滑肌细胞的增殖,内皮细胞死亡,和粘附分子的表达32,33]。另一方面,CIT集团+ PRA,尿素等离子体水平正常。柠檬酸可能治疗尿毒症可能抵消普伐他汀的效果,因为它曾表明,柠檬酸减少尿毒症引起的高脂肪饮食(34]。关于动脉粥样硬化程度,很难解释为什么柠檬酸+普伐他汀会增加自发性动脉粥样硬化的进展。我们推测,这些因素之间的相互作用可能会有局部血管壁有害的行动,在这项研究中我们还没有解决,但可能与mtROS生产。

本研究的一个限制是数量少()的老鼠和高可变性的反应。因此,我们应用统计方法来推断可能的动脉粥样硬化和所有测量参数在汇集数据之间的联系。集中数据的相关性和回归分析有助于确定哪些风险因素相关参数(血浆脂质、肥胖、和氧化应激)对动脉粥样硬化的变化产生重大影响。正如所料,血浆胆固醇和甘油三酯呈正相关,主动脉病变大小,即使在一个非常狭窄的范围。此外,新正相关性,肝脏派生的高山和mtROS命名。增加水平的高山显示肝损害和心血管疾病之间的相关性,他人已被证明对肝酶(35)和c反应蛋白水平(36]。然而,调整血浆甘油三酯的分析后,只剩下mtROS积极、独立与动脉粥样硬化有关。多元线性回归分析还表明,肝脏mtROS生产可以解释主动脉动脉粥样硬化的程度,要么孤独(表2模型(3))或结合肝脏甘油三酯含量(表2模型(3 b))。因此,通过使用三个不同的统计工具(单变量相关,调整相关和多元回归)水平增加的严格,我们确认一个重要变量之间的关联,并进一步量化的因变量的变化量(动脉粥样硬化),可以解释为独立变量(mtROS)。尽管这些统计分析并不意味着因果关系,这些结果与整个身体的证据在当前文学使我们建议机械的链接是可以想象的。肝脏mtROS可以通过不同的方式与动脉疾病。第一个是通过代谢连接,也就是说,通过分泌改变数量和/或VLDL质量,低密度脂蛋白的前兆。其次,肝脏线粒体氧化应激导致炎症通路的激活可能导致系统性炎症,进而强烈与动脉粥样硬化(36]。最后,肝脏可以替代标记的主要事件发生在动脉壁,尤其是脂质积累和线粒体氧化应激。在代谢支持连接,我们发现VLDL LDLr的分泌^−−/肝脏明显更容易氧化的侮辱(CuSO₄比野生型VLDL),而在同一TG基础内容。此外,这些LDLr^−−/VLDL已经与几个氧化脂质分泌与野生型相比VLDL。在这一点上,它是相关的回忆和引用戴维斯和回族在乔治·莱曼达夫纪念演讲“心脏的动脉粥样硬化是一种肝脏疾病”(37]。在那个场合,作者提到特别复杂的过程在肝脏组装和分泌apoB-containing脂蛋白,动脉粥样硬化的前体的罪魁祸首,低密度脂蛋白。

总之,我们的结果表明,线粒体活性氧是一种新型的积极和动脉粥样硬化的独立危险因素。我们建议调制线粒体氧化还原状态导致的动脉粥样硬化程度的重要变化。这些发现支持提出的策略使用mitochondria-targeted抗氧化剂作为心血管疾病的潜在治疗治疗。

信息披露

作者仅负责内容和论文的写作。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

确认

这项研究是通过赠款支持海伦娜·c·f·奥利维拉和Anibal大肠Vercesi从巴西的机构:Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(FAPESP # 2011/50400-0必须占州政府和2011/51349-8)和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)。加布里埃尔·g·Dorighello和布鲁诺a掌被CNPq和奖学金支持,分别。作者感谢Natalia迈乌米Inada女士Edilene de Souza Siqueira桑托斯和加芙c Tonini技术援助。